Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı
Bu makalede
Özet
Özet
Vitro RNA-açılan özel RNA yapıları ve motifleri tanımak RNA bağlanıcı proteinler belirlenmesi amaçlı iletişim kurallarının ilk adımda hala büyük ölçüde kullanılır. Bu RNA-açılan iletişim kuralında, biotin, desthiobiotin, 3' terminus streptavidin için geri döndürülebilir olarak bağlar ve böylece daha fazla altında proteinlerin elüsyon sağlayan RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formu ile ticari olarak sentezlenmiş RNA probları etiketlenir fizyolojik koşullar. RNA-desthiobiotin ile özellikle faiz RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Burada anlatılan yöntem bilinen RNA proteinler ve bir faiz dizisini içeren 25-nükleotit (nt) uzun RNA prob arasındaki etkileşimi algılamaya uygulanır. Bu sabitleme veya öğeleri RNA molekülleri bir muhabir vektör tahlil kullanılarak elde mevcut istikrarsızlaştırıcı fonksiyonel karakterizasyonu tamamlamak yararlıdır.
Giriş
Gen ekspresyonu ve gen ürünü son seviyesi sıkıca mRNA kararlılığı ve mRNA çeviri hızı1etkileyen tarafından düzenlenmiş. Çoğu yasal mekanizmaların kodlamayan RNA ve/veya RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) etkileşimleri ile hedeflenen mRNA aracılığıyla sarf. Bu genellikle 3' Çevrilmeyen mRNA (3' UTR - genom2kodlamayan bölümüne ait) belirli CISiçeren bölgedir- transtarafından tanınan düzenleyici elemanlarının (CRE),-miRNA ya da RBPs gibi faktörler rol 3. en çok çalışılmış CIS-içinde 3' UTR, öğedir belirli AU bağlanıcı proteinler (AUBP) tarafından ve sırayla tanınır, adenin-zen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlanması sitozolik ve nükleer Protein fraksiyonu
- Plaka 4 x 106 ACC-MESO-4 hücreleri RPMI - 1640 orta yetiştirilen bir T150 hücre kültür şişeye %10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile desteklenmiştir. Hücrelerin % 80-90 (~5-5.5 x 106 hücreler) bir izdiham ulaştığınızda, nükleer ve sitozolik kesir protein çıkarılması ile devam edin.
Not: ACC-MESO-4 hücre kültürünü RIKEN BioResource Merkezi11' den elde edildi. - Orta Aspire edin, hücreleri 15 mL 1 x PBS ekleyerek yıkama, plaka birkaç kez hafifçe eğimli ve 1 x PBS Aspire edin. 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu deneyde, calretinin 3' UTR barındıran ARE motifi (CALB2 3' UTR (vardır) 25-nt) 25-nt uzun parçası özellikle insan-antijen R (HuR) protein için bilinen bir mRNA sabitleyici bağlar olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. ARE öğesi, bir 25-nt RNA özgüllük test etmek için daha önce olan motif sabitleme etkisini ortadan kaldırmak için gösterildi, ARE-motif mutasyon içeren CALB2 3' UTR (mtARE) kullanılan6yoklamaydı. Üçüncü RNA sonda 28 nt olan negatif kontrol .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kodlamayan genom3' e 3' UTRs ait ve onların işlev7uygulamak için tüm kodlamayan RNA'ların proteinler ile etkileşim kurabilir. Ne zaman memeli genom pervasively transkripsiyonu için kurmak ve uzun kodlamayan RNA'ların16önemli bir kısmını üretilen, delillerin ortaya çıkan bu uzun kodlamayan RNA'ların ile etkileşimde bulunan gen ifadesinin düzenlenmesine çalışması gösterdi kompleksleri17Kromatin remodeling. Bu bilgi RNA-açılan ta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung ve Zürih Krebsliga tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| NE-PER Nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon kiti | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Proteaz İnhibitör Tabletleri, EDTA içermeyen | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kiti | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Manyetik boncuklar içerir ve bu nedenle kitin 4 ° C'de saklanması gerekir; C |
| Pierce RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | Kit, "Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kit"in bir parçasıdır ve -20 °C'de saklanması gerekir; C, aşağı çekme kitinden farklı olarak (4 > C). |
| DynaMag-2, manyetik stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoklonal antikoru | Thermo Fisher | Scientific-Antikor | , Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kitine dahildir - 1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - tavşan anti-fare ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tübülin (MOUSE) monoklonal antikoru | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - tavşan anti-fare ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (TAVŞAN) Poliklonal antikor | Hücre Sinyali | 9542 | 1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - keçi anti-tavşan ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS |
| Anti - Mezotelin (MOUSE) Monoklonal Antikor | Rockland | 200-301-A87 | |
| İkincil keçi anti-tavşan antikoru | Hücre Sinyalizasyonu | 7074 | |
| İkincil tavşan anti-fare antikoru | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 orta | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrelenmiş Sığır Serumu | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penisilin - streptomisin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamin çözeltisi (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| %0,25 Tripsin-EDTA (1x) | Gibco by Life teknolojileri | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Hücreli | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean Sistem Cam Plakalar | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN 1,5 mm entegre ara parçalı Ara Plakalar | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Tarak, 10 kuyulu, 1,5 mm, 66 & L | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Hücre Döküm Modülleri | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Dekontaminasyon | Çözeltisi Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese jel 30 - 37.5:1 oranında sulu %30 akrilamid ve bisakrilamid stok çözeltisi | Roth | 3029 | |
| %20 SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membranı | Perkin Elmer | NEF1002 | Saf metanolde 1 dakika inkübe edildikten sonra 2 dakika suda yıkanarak aktive edilmesi gerekir; |
| Trans-Blot SD yarı kuru transfer hücresi | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Batı ECL Substrat | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Dijital Görüntüleyici | Vilber-RNA | ||
| oligo sentezi | Mycrosynth AG, | İsviçre-sentez | ölçeği - 0.04 & mol - HPLC saflaştırılmış |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hidroklorik Asit (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Saf 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Bilimsel | 15567027 | |
| Gliserol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | -20 ° C'de saklanacak %50 steril alikotlar; C |
| Pierce Streptavidin manyetik boncuklar ve nbsp; | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Lütfen bu manyetik boncukların ortalama çapının 1 & mikro olduğunu unutmayın; m (0,5 - 1,5 & mikro aralığında; Ayrıca, homojen boyutu 2.8 ve mikro olan Dynabeads-M280 Streptavidin; m, RNA pulldown'da da kullanılır, ancak bunun saflaştırma sürecini etkileyebileceğini unutmayın. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonyum persülfat ve nbsp; | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Alüminyumsülfat-(14-18)-hidrat | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| orto-fosforik asit | Uygulama | A0637 |
Kaynaklar
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
