Yöntem makalesi

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

7.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30 Nisan 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Özet

Kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş palindromik tekrarlar (CRISPR) - CRISPR - protein prokaryotik edinilmiş bağışıklık savunma sistemi kesin ökaryotik genom mühendisliği için güçlü bir araç olarak ortak tercih 9 (Cas9) ilişkili. Burada, C. elegansgenomik noktası mutasyonların verimli ve hassas nesil chimeric tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNA) ve CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) kullanarak hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Biz bir boru hattı sgRNA hedef seçimi, homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu tasarım, CRISPR-Cas9-RNP kompleks ve teslim ve doğru düzenlenmiş hayvanlar sağlam ve hızlı tanımlaması sağlar bir Genotipleme strateji tanımlamak. Yaklaşımımız sadece facile üretimi ve istenen genomik noktası tanımlaması mutant hayvanlar izin verir, ancak aynı zamanda diğer karmaşık Indel allelleri algılama yaklaşık 4-5 gün içinde yüksek verimliliği ve azaltılmış tarama iş yükü ile kolaylaştırır.

Giriş

Son teknolojik gelişmeler kökten değiştirdi ve tam olarak mühendis genleri yeteneği hızlandırılmış. Özellikle, RNA güdümlü endonükleaz Çift Kişilik strand mola (DSB) faiz hedef sıra ikna etmek için Cas9 dayanan, CRISPR-Cas9 sistemi kapsamlı olarak doğru bir şekilde kullanılan model organizmalar çoğunluğu genom mühendisi kullanılmaya başlanmıştır Biyomedikal Araştırma1,2,3,4. Önemli ölçüde, CRISPR-Cas9 kullanımı bile zor türler C. elegans5gibi genom düzenleme kilidi. Türü ne olursa olsun, sistem düzenleme CRISPR-Cas9 dayalı genom ile nokta mutasyonlar üreten üç çekirdek bileşenleri üzerinde dayanır: 1) Cas9 endonükleaz, bir hedef sıra ve tasarlanmış 3) bir kullanıcı için Cas9 endonükleaz yönlendirir 2) bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) İstenen içeren homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonunu faiz2/ edit(s).

Hedefleme sgRNA ve Cas9 tanıtmak için kullanabileceğiniz çeşitli yöntemler vardır nükleaz plazmid, RNA ve viral alan teslim yöntemleri6dahil olmak üzere hücre içine. Son zamanlarda, pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) doğrudan teslim CRISPR Cas9 esaslı genom7düzenleme güçlü ve etkili bir araç ortaya çıkmıştır. Pre-complexed CRISPR-Cas9 RNPs doğrudan teslim Yani birkaç farklı avantajı vardır: 1) RNPs bypass hücresel transkripsiyon ihtiyacını ve çeviri, 2) RNPs hızla temizlenir, hangi-ebilmek artmak özgüllük için kullanılabilir zamanı azaltarak kapalı-hedef bölünme ve 3) RNPs non-yerli dizileri rasgele tümleştirme yoluyla ana bilgisayar genom içine giriş circumvents hiçbir yabancı DNA/RNA unsurları içerir. Birlikte, bu öznitelikler muhtemel hedef kapalı etkileri en aza indirerek CRISPR hedef olarak düzenleme kısa ömürlü bir patlama sağlar.

C. eleganssiteye özgü genomik değişiklikleri tanıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı sgRNA ve tek telli Oligonükleotid (ssODN) HDR şablon tasarımı, sgRNA-Cas9 RNP kompleks ve teslim ve düzgün düzenlenmiş hayvanlar kesin tanımlaması için bir Genotipleme strateji hedefleme içerir. Bu stratejiyi kullanarak, sadece istediğiniz siteye özgü değişiklikleri elde edilebilir, ama diğer non-spesifik Indel mutasyonlar da kurtarılabilir. Böylece, bizim strateji allelic dizisi tek bir strateji kullanarak mono allelic, BI allelic nerede nesil verir ve Indel mutantlar F1 üretimi oluşturulabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi'nde kılavuz izledi. Ve ipuçları protokol boyunca pipet RNase free çözümleri kullanın. Çalışma alanı, Pipetler, tüpler ve santrifüj ( Malzeme tabloyabakın) Üretici yönergeleri izleyerek RNase dekontaminasyon çözüm ile temiz.

1. sgRNA hedef seçimi

  1. Bir web tarayıcısı kullanarak Web sayfasını açın: http://crispor.tefor.net8
    1. ~ 60 baz çifti (bp) istenen düzenleme ilgi kanat sırası giriş (Yani 30 bp 5' ve 3' istenen düzenleme).
    2. Caenorhabditis elegans genom açılan menüden seçin.
    3. Protospacer bitişik Motif seçin (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) açılan menüsünden.
    4. Gönder'i tıklatın. Sonuç sayfası faiz düzen için en yakın üst sırada hedef sırası seçin. Kanat 60 bp Giriş dizisi içinde hiçbir uygun hedef site varsa, en fazla 100 sorgu sırası genişletin bp (Yani 50 bp istenen her iki tarafında düzenleme).
  2. Bir kaynaktan, örneğin synthego, aşağıdaki özelliklere sahip bir 20-mer hedef sgRNA elde etmek: 3 nmol; modifikasyon yok.
  3. Aldıktan sonra liyofilize sgRNA tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Tüp TE nükleaz Ücretsiz 60 µL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı kullanarak 15 - 20 kez P200 pipet pipetting tarafından yeniden askıya. Son 50 µM bölgedir.

2. homoloji-yönetmen onarım şablon tasarımı

  1. Bir ssODN HDR şablonu içeren tasarım: 1) faiz mutasyon, 2) bir benzersiz çerçeve kısıtlama endonükleaz sitesi, birini veya her ikisini NGG PAM dizisi içinde Gs sessiz 3) bir mutasyon ve ilk ve son mutasyon kanat 4) 50 bp 5' 3' homoloji silah. (Şekil 1 c) 9 , 10.
    1. Mutasyon NGG PAM sırası mümkün değilse, 5-6 sgRNA-aracılı bölünme ssODN HDR şablonunun önlemek için sgRNA hedef tanıma dizisi içinde sessiz mutasyonlar tanıtmak.
  2. Bir kaynaktan, örneğin idtdna, bir "Ultramer DNA Oligonükleotid" aşağıdaki parametrelerle elde etmek: Ölçek: 4 nmol; Formülasyon: None; Arıtma: Standart Desalting.
  3. Aldıktan sonra liyofilize ssODN tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Yavaşça ssODN 100 µM son bir konsantrasyon için GKD nükleaz ücretsiz2içinde O 15 - 20 kere P200 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.

3. tasarım Genotipleme astar

  1. ~ 400-700 bp PCR amplicon11oluşturmak için genom değişiklik kanat ayarla bir astar tasarım.
  2. PCR bisiklet koşullarını tek ve belirli amplicon11üretmek için en iyi duruma getirme.

4. enjeksiyon karışım hazırlamak

  1. Tablo 1 reaktifler 4 ° C'de 2 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi
  2. Listelenen sırayla Tablo 1 reaktifler bir nükleaz ücretsiz PCR tüp ekleyin.
  3. Yavaşça aşağı yukarı 10 kez P20 pipet ile pipetting tarafından iyice karıştırın.
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika için enjeksiyon karışımı kuluçkaya.

5. enjeksiyon Protokolü

  1. Yük enjeksiyon micropipette yaklaşık yarısı enjeksiyon ile12karıştırın. Enjeksiyon iğne takunya ya da tatili halinde enjeksiyon mix kalan kaydedin.
  2. Yavaş yavaş akan çözüm12~ 20-30 psi üretir micropipette ipucu break.
    Not: Büyük çap ipuçları olumsuz hayvan sağlığını etkileyen ve F1 döl verim azaltın.
  3. 10-15 genç enjekte yetişkin solucanlar her iki eşey kollarında mümkünse12. Eğer değilse, bir eşey kol içine enjeksiyon yeterlidir.
  4. Oda sıcaklığında 1-2 h için kurtarmak enjekte hayvanlar (P0) 35 mm OP50 numaralı seribaşı nematodunun büyüme medya (NGM) plaka üzerinde izin. Daha sonra bireysel OP50 numaralı seribaşı 35 mm NGM tabak Platin tel solucan kullanarak tek enjekte P0 hayvanlara12seç.

6. ekran P0 plakaları ve tek mCherry(+) F1s

  1. İki gün sonrası enjeksiyon, F1 döl mCherry floresan stereomicroscope kullanarak yutak olarak ifade içeren P0 plakaları tanımlamak (şekil 1 d, gün 2 - 3). En mCherry(+) F1 hayvanlar içeren üç P0 plakaları seçin.
  2. Her üç seçili P0 plakalar, 8-12 mCherry(+) F1 hayvanlar 24-36 mCherry(+) F1s bir solucan kullanarak toplam tek seçin (şekil 1 d, gün 2 - 3).
    Not: mCherry(-) hayvan-da var saydı P0 tabakları, ancak doğru bir şekilde belirlenmesi olasılığını hayvanlar çok düzenlenmiş (şekil 2A) daha düşük.
  3. Bireysel F1ler Self-fertilize ve oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca yumurtlamak izin verir.

7. tek solucan PCR ve Genotipleme

  1. 1-2 gün sonra yumurta atma, F1s 7 µL solucan lizis bir solucan pick (Tablo 2, şekil 1 d, gün 4-5) kullanarak arabellek içeren bireysel PCR şerit tüp kapakları aktarın.
  2. Santrifüj PCR tüpleri tüp altına hayvan getirmek ve tüpler için 1 h-80 ° C'de dondurmak için oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda.
    Not: Worms-80 ° C'de süresiz olarak saklanır.
  3. Aşağıdaki programı kullanarak bir thermocycler de donmuş solucan parçalayıcı: 4 ° C 60 ° C 60 dk, 15 dk, 95 ° C için tutun.
  4. Tablo 3' te gösterilen kurulum PCR mastermix.
  5. 21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpler içine ekleyin ve sonra adım 3 4 µL solucan lizis ekleyin. İyi bir pipet kullanarak mix ve ( Malzeme tabloyabakın) üreticileri yönergeleri izleyerek PCR programını çalıştırın.
  6. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir DNA temiz ve konsantre kit kullanarak PCR reaksiyonları arındırmak ( Malzeme tabloyabakın). DNA spin sütun 10 µL su ekleyerek elute.
  7. Tablo 4' te gösterildiği gibi set-up restriksiyon enzimi mastermix.
  8. Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş her PCR reaksiyon ekleyin ve 1-2 h 37 ° C13için kuluçkaya.
  9. Ayrı 120 V 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek14kullanarak çalıştırmak % 1.5 özel jel PCR ürünleri sindirilir.

8. kimlik ve sıra doğrulama düzenlenen hayvan

  1. Potansiyel hayvanlar14 (şekil 1 d, 4-5 gün) düzenlenmiş belirtmek bantları varlığı için sindirilmiş enzim örnekleri inceleyin.
    Not: Grup boyutu ve/veya desenleri bantlama beklenmedik ve karmaşık restriksiyon enzimi sindirim nöbetleşe olarak gözlenen potansiyel Indel mutasyonlar tanımlamak için bir N2 denetimini yükleyin.
  2. Potansiyel düzenlenen hayvan belirlenmesi sonra solucan lizis kalan 3 µL kullanın ve PCR reaksiyon tekrarlayın. Temiz mi veya restriksiyon enzimi sindirmek PCR reaksiyon program tamamlandıktan sonra. PCR reaksiyon % 1'özel jel, ayrı olarak yüklemek ve bir jel ekstraksiyon kiti15 kullanarak Grup ayıklamak ( Malzeme tabloyabakın).
  3. Sanger sıra16 jel doğru düzenlenmiş hayvanlar (şekil 1A) tanımlamak için F1 astar kullanarak DNA elde
    Not: okuma içerir Heterozygote doruklarına vahşi türü varlığı nedeniyle overlaid ve alleli tasarlanmış.
  4. Homozigoz hayvanlar doğrulanmış heterozigoz düzenlenen hayvanlardan, tek 8-12 F2 hayvanlar almak ve 7-8 adımları gerçekleştirmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mutasyonların insan süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ailesel amyotrofik lateral skleroz, felç ve ölüm17' ye kaçınılmaz götüren bir yıkıcı nörodejeneratif hastalık ~ 10- hesabı. İnsan SOD-%1 55 kimlik ve % 70 benzerlik C. elegans SOD-1 protein ile (şekil 1B) paylaşımı örümceklerle korunmuş bir proteindir. Basitlik, fizibilite ve CRISPR-Cas9 RNP dayalı yaklaşım verimliliğini göstermek için C. elegans çimen-1 gen h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CRISPR-Cas9 sistemi tam olarak canlılar genom değiştirmek için güçlü ve etkili bir araçtır. Burada, biz o chimeric sgRNAs20 ssODN HDR şablonları etkinleştir ile yüksek verimli üretimi C. elegansgenomik noktası mutasyonların birleştiğinde göstermek. Önemlisi, biz floresan bir eş seçimi marker olarak kullanıldığında RNP teslim yüksek Düzenleme verimliliği üreten göstermek kolaylık ve güvenilirlik-in teknik vurgulayarak.

C. elegans genom mühendisliği için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz üyeleri Beg laboratuvar bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Beg laboratuvar araştırma hibe tarafından NIH (R01 NS094678) ve Musküler Distrofi Derneği (MDA382300) A.A.B. için desteklenir

Teşekkürler

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego A.Ş.kimerik sgRNA
Nükleaz içermeyen TESynthego Inc.sgRNA kiti EZ kiti
Nükleaz içermeyen suSynthego Inc.sgRNA kiti ile sağlanır EZ kiti
4 nmole Ultramer DNA OligoEntegre DNA TeknolojilerissODN HDR şablonu
Alt-R Sp HiFi Cas9 Nükleaz 3NLSEntegre DNA Teknolojileri1078728Cas9 proteini
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mKiraz İşaretleyici Plazmid
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Temiz & YoğunlaştırıcıZymo ResearchD4004
Zymoclean Jel DNA Geri Kazanım KitiZymo ResearchD4002
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinaz KSigmaP2308
Cam Borosilikat Cam MikropipetlerSutter AletleriBF100-78-10OD: 1.0mm. ID: 0.78mm
Trizma HidroklorürSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap Dekontaminasyon SolüsyonuFisher ScientificAM9780
ile sağlanır

Kaynaklar

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C elegans Genom D zenlemesgRNA Hedef Se imissODN HDR ablonuRestriksiyon Enzimi GenotiplemeFloresan mCherry Mark rSanger Dizileme Do rulamasHomozigot Mutant HayvanlarH zl Mutasyon Ak

İlgili makaleler