Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic
Bu makalede
Özet
Özet
İç kulak duyu organları deneysel manipülasyon ve optik gözlem için onların erişilememesi nedeniyle memelilerde çalışmaya zorlu. Ayrıca, mevcut kültür teknikleri biyokimyasal tedirginlikler olanak, ancak bu yöntemler mekanik kuvvet ve doku sertlik iç kulak duyu organları geliştirilmesi sırasında çalışması için bir yol sağlamaz. Burada olduğu gibi fare utricle ve bu sınırlamaların üstesinden koklea üç boyutlu organotypic kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan üç boyutlu matris sertlik düzeltilmesi için teknik manipülasyon doku büyüme karşı elastik kuvvet verir. Bu yöntem bu nedenle iç kulak geliştirme sırasında mekanik Kuvvetleri rolü eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, kültürler kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu deneyler için kullanılan virüs-aracılı gen teslim izin verir. Bu kültür yöntemi doğuştan gelen saç hücreleri koruyan ve destekleyen hücreleri ve vestibüler ve işitme duyu organları geleneksel iki boyutlu kültür potansiyel olarak üstün bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Giriş
Pek çok yönden memeli organ gelişiminin incelenmesi, vitro sistemleri tarafından kolaylaştırılmış. İki temel yöntem şimdi vestibüler duyu organları kültürü için kullanılan: serbest yüzer1 ve yapışık2 hazırlıkları. Her iki yöntem saç hücre güvenlik açıkları3 ve rejenerasyon1,4 içinde vitrosoruşturma izni. Buna ek olarak, çentik5,6, Wnt7,8ve iç kulak Cascade'lerde sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntem tanımlamak burada Güney Kaliforniya Üniversitesi ve hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. (isteğe bağlı) kolajen hazırlanması ben eriyik--dan Mouse-tail tendonlar
Not: Kollajen ben ticari olarak kullanılabilir çözümlerdir. Jel hazırlık için üreticinin yönergelerini izleyin.
- 5-10 Genç Yetişkin (3-5 hafta eski) fare ile karbon dioksit ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi16tarafından onaylanmış protokol uyarınca herhangi bir vahşi türü baskı ötenazi. Kuyrukları toplamak ve onları 4 h, oda s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vestibüler ve işitme duyu organları embriyonik kulaklar, gelen kültürlü 40-Pa kolajen ben düşük sertlik embriyonik koşulları11taklit jelleri, nispeten normal üç boyutlu yapılar (Şekil 1) korumak ve saç hücreleri korumak ve Destek hücreleri (Şekil 2 ve Şekil 3). Her ne kadar hücre yoğunluğu destekleyen üzerinden % 30 oranında azaltır (öğrenci t -testi: n 4, p .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Aracılık büyüme ve iç kulak farklılaşma Geliştirme sırasında olmuştur moleküler sinyaller kapsamlı5,6,7,8,9,10okudu. Ancak, hücre kavşaklar ve su aygırı sinyal, harekete geçirmek ile hissedilen, mekanik yardımlar bu işlemleri2,11', de önemli bir rol oynamak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi ve A. Petelski bu protokolü dayandığı orijinal araştırma katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Biz ayrıca J. Llamas ve W. Makmura teknik yardım ve Hayvancılık için teşekkür ederiz. NIDCD eğitim grant T32 DC009975, NIDCD R01DC015530, Robertson terapötik Geliştirme Fonu ve finansmanı için Caruso Aile Vakfı Hibe etmiş oluyorsunuz. Son olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Dr. Hudspeth bir araştırmacı olduğu, desteğinden anıyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| # 10 Cerrahi Bıçaklar | Miltex | 4-110 | |
| # 5 Forseps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri kabı | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL büyük delikli pipet uçları | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm cam tabanlı Petri kabı | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 kuyu plaka | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hidroksitamoksifen ve nbsp; | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri kabı | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Asetik asit | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vektör Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, tavuk IgY fraksiyonu | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antikoru (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bikinkoninik asit tahlili | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Görüntüleme Kiti | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Kollajenaz I | Gibco | 17100017 | |
| D-glukoz | Sigma | G8270 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal büyüme faktörü | Sigma | E9644 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast büyüme faktörü | Sigma | F5392 | |
| Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme | Sutter Aleti | P-97 | |
| Glutamin | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemositometre | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| İnsülin | Sigma | I3536 | |
| İridektomi makası | Zepf Tıbbi Aletler | 08-1201-10 | |
| Mikroenjektör | Narishige | IM-6 | |
| Nikotinamid | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Fenol Kırmızı pH indikatörü ve nbsp; | Sigma | P4633 | |
| Saf Etanol, 200 Kanıt Decon | Labs | 2716 | |
| RFP antikoru | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma | S5761 | |
| Sodyum hidroksit | Sigma | S8045 | |
| Sodyum selenit | Sigma | S5261 | |
| Masa üstü girdap | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Tripan mavisi | Sigma | T6146 |
Kaynaklar
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proli....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
