Method Article

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

DOI:

10.3791/57528

⸱

October 29th, 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Populational morfolojik ve fonksiyonel değişikliğin endositik proteinlerin populational düzeyde bir tek hücre düzeyi ve istatistiksel görüntü analizi, görüntü yakalama talebi nedeniyle zorlu analizlerdir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz görüntüleme akış sitometresi ve transcriptomic (RNA-seq) profil oluşturma ilişkili değişmiş hücre altı yerelleştirme farklılaşma 1 d protein (CD1d) kümenin belirlemek için Engelli endositik gen ifade insan ile kullanılan ortak lipofilik sinin dendritik hücreler (DCs), kirletici benzo [a] dumanında hava. Colocalization CD1d ve endositik işaret Lamp1 proteinler akış sitometresi Imaging ile yakalanan hücre görüntüleri binlerce fikir ve ImageJ-Fiji kullanılarak analiz programları. Hücresel görüntülerle çok sayıda ortak lekeli CD1d ve Lamp1 proteinleri CD1d üzerinde Perdeleme sonra görüntülenir+Lamp1+ DCs fikirler kullanarak. Pozlama daha da thresholded scatterplots, kullanarak ortak yerelleştirilmiş yoğunluğu için Mander'ın katsayıları ile test edilmiş ve çizilen gösterilmiştir BaP üzerine geliştirilmiş CD1d ve Lamp1 colocalization ImageJ-Fiji kullanarak ortak lokalize alanlarda yüzde tabanlı. Protein colocalization, kirletici günese maruz kalan insan transcriptomic değişiklik Engelli fonksiyonel sonuç destekleyen tek ve populational hücresel düzeyde ölçmek için avantajlı bir enstrümantal ve bioinformatic yaklaşım bizim veri sağlamak DCs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antijen sunumu genelde kez morfolojik karakterizasyonu ve fenotipik antijen sunan hücreler1,2,3 profil oluşturma kullanarak soruşturma kaçakçılığı, hücre içi protein içerir . Görüntüleme ve fenotipleme yöntemleri avantajları birleştirmek için bir görüntüleme analizi platform tek hücre ve bir değişmiş protein colocalization insan dendritik hücreler (DC) olarak göstermek için nüfus düzeyleri açıklanmaktadır. Peptid antijen sunumu, MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri kısa peptid (8-10 artıkları) endoplazmik geleneksel CD8 etkinleştirmek için bağlamak+ T hücreleri,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın insan iletişim kuralları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulca kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Kan örnekleri sağlıklı bağışçılardan Cincinnati Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Hoxworth kan merkezinden elde edilmiştir.

1. Transcriptomic kirletici günese maruz kalan insan monosit kaynaklı DCs profil oluşturma

  1. BaP maruz DCs toplam RNA çıkarımı
    1. İnsan DCs sitokinler GM-CSF ve Il-4 kullanarak ayırt etmek ve DC için BaP 6 gün13için maruz.
    2. Sıralama BaP maruz DCs yüzey ifade işaretleri (Lineage-HL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipofilik kirletici BaP endositik gen kümelerden her donör insan DCs. insan DCs monosit kaynaklı olarak değiştirir (n = 3) BaP ile inkübe ve daha da açıklandığı gibi RNA çıkarma ve transcriptomic analiz için kullanılan geleneksel DCs için sıralanmış . Gen ifadesinin normalleştirme, BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar arasında değişmiş gen göre differentially ifade genlerin korelasyon fonksiyonel kümelenmiş. Toppcluster program16 ilgili hücresel yol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel onay döngüsünün bir değişmiş gen içeren birden çok yolları ve bireysel ve populational hücresel aktiviteler tümleştirmek için zorluk yaygın olarak etkilenen gen ekspresyonu nedeniyle meydan okuyor. Özellikle test CD1d endositik bölmeleri kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi çalıştırmaya başladık. Akış Sitometresi Imaging hücre populational ölçüm ve birden çok proteinlerin hücre altı colocalization bireysel gösterimi bütünleştirir. Confocal mikroskobu daha önce yüksek çözünürlüklü protein colocalization öl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Robert Giulitto (Hoxworth kan Merkezi) insan kan örnekleri için teşekkür ederiz ve Dr Liang Niu gen ekspresyonu normalleştirme için okur. Biz de teşekkür hibe destek üzerinden Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (ES006096), Merkez çevre genetik (CEG) pilot proje için (S.H.), Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati Üniversitesi Araştırma Konseyi Ödülü (S.H.) ve University of Cincinnati üniversite tıp çekirdek geliştirme fon (X. Z.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TranskriptomikIlluminaHiSeq 2500 v4Illumina HiSeq sistemi
Görüntüleme Akışı XMillipore100220Görüntüleme akışı sitometrisi
mirVana miRNA İzolasyon KitiThermo FisherToplam RNA ekstraksiyonu
Agilent RNA 6000 Pico KitiAgilentToplam RNA QC analizi
Veriti 96 Kuyulu Hızlı Termal DöngüleyiciTermo FisherPCR, enzim reaksiyonu
NEBNext Poli(A) mRNA Manyetik İzolasyon Modülü New England BiolabPolyA RNA saflaştırma
Otomatik SMARTer Apollo sistemiTakaraPolyA RNA saflaştırma
NEBNext IlluminaNew England BiolabKütüphanesi için
Agencourt AMPure XP manyetik boncuklarBeckman CoulterDNA saflaştırması 
2100 BiyoanalizörAgilentKütüphanesi QC, boyut dağılım analizi
Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilentLibrary QC, boyut dağılım analizi
QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (Thermo Fisher)Thermo FisherKütüphane miktar tayini
NEBNext Kütüphane Quant KitNew England BiolabKütüphanesi miktar tayini
cBotIlluminaKitaplığı küme oluşturma
TruSeq SR Küme Kiti v3 - cBot – HSIlluminaKitaplığı küme oluşturma
HiSeq 1000IlluminaDizileme
TruSeq SBS Kiti v3 - HS (50 döngü)IlluminaDizileme
Fikoeritrin/Siyanin 7 (PE/Cy7)Biyo EfsaneL243
Fikoeritrin/Siyanin 5 (PE/Cy5)Biyo Efsane3.9
Parlak menekşe 421Biyo EfsaneL161
PE-anti-fare IgG2bBio Legend51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)Bio LegendCD107a(H4A3)
Ultra RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti hazırlama

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometryTranscriptomic ProfilingCD1d TraffickingEndocytic Protein ColocalizationBenzo a pyrene ExposureHuman Dendritic CellsMander s Coefficient AnalysisRNA SequencingImageJ FijiIDEAS Software

Related Articles