Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

13.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57543

⸱

21 Mayıs 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Bu makalede

Özet

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Özet

Verimli ve sağlam yalıtım ve birincil oligodendrocytes (OLs) kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra, multipl skleroz gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç ve Pelizaeus-Merzbacher-gibi hastalığı (PMLD). İşte, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Olgunlaşmamış OL teşkil beri fazla bu yalıtım Yöntem sadece sağlar yüksek hücresel verim % 80 Doğum sonrası gün 7, kemirgen-beyin beyaz maddenin (P7), aynı zamanda zaten oligodendroglial soy taahhüt OLs belirli yalıtım, azalan astrocytes gibi bulaşıcı hücreleri ve diğer hücrelerden fare beyin izole imkanı. Bu yöntem daha önce rapor teknikleri bir değişiklik olduğunu ve oligodendrocyte hazırlık saflık yaklaşık 4 h % 80 oranında yukarıda sağlar.

Giriş

Oligodendrocytes (OLs) merkezi sinir sistemi (MSS)1myelinating hücrelerdir. Yalıtım ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ortamda birincil oligodendrocytes kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra multipl skleroz2 gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç . Bu bir verimli ve sağlam oligodendrocyte yalıtım ve kültür Yöntem3gerektirir. Bu çalışmada, biz hızlı ve belirli bir değiştirilmiş yalıtım tekniği uygulamak için bir ayırt edici oligodendrocyte hücre yüzey marker ifadesi kullandı.

Dört farklı aşamaları oligodendrocyte olgunlaşma tespit edilmiştir, farklı hücre yüzey işaretleyicileri ifade her gelişim aşaması (Şekil 1) için her karakterize. Bu hücre yüzey işaretleyicileri belirli antikor4,5tarafından tanınır ve belirli aşamalarında OLs yalıtmak için kullanılabilir. İlk aşamada, oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) çoğalırlar, göç ve özellikle hızlı trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör (PDGF-Rα)6, gangliosid A2B5, proteoglikan NG27,8 kapasitesine sahiptir. , polysialic asit sinir hücre adezyon molekülü9 ve yağ asidi bağlayıcı protein 7 (FABP7)10. OPCs birkaç kısa işlemler sinirsel öncül hücreleri11karakteristik olan hücre vücudun karşıt direkleri yayılan iki kutuplu morfoloji var.

Oligodendrosit olgunlaşma diyagramı; işaretleyicili aşamalar: OPC, Preoligodendrosit, Olgunlaşmamış, Olgun.
Şekil 1: fare oligodendrocyte geliştirme sırasında hücre yüzey işaretlerinin ifade. A2B5, GalC (O1) NG2 O4 ve PDGF Rα özellikle oligodendrocytes belirli antikorları kullanarak belirli gelişimsel aşamada yalıtmak için kullanılabilir gibi OLs yüzey işaretleyicileri hücre.   Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İkinci aşamada, OPCs preoligodendrocytes için ortaya çıkmasına ve hücre zarı hızlı sadece OPC işaretleri, aynı zamanda O4 antikor12,13ve GPR17 protein14, tarafından tanınan sulfatide (sülfürlü galactolipid) Hangi kadar olgunlaşmamış oligodendrocyte (OL) sahne devam ederse. Bu aşamada preoligodendrocytes multipolar kısa işlemler genişletir. Preoligodendrocytes büyük OL sahne olgunlaşmamış OLs15küçük bir nüfusa sahip fare ve fare serebral beyaz madde postnatal gün 2 (P2) bulunmaktadır.

Üçüncü aşamada, olgunlaşmamış OLs O4 hızlı, ifade A2B5 ve NG2 işaretlerinin kaybetmek ve galactocerebroside C16hızlı başlar devam ediyor. Bu aşamada OLs oligodendroglial soy işlenir ve uzun ramified dalları17,18ile sonrası Mitotik hücre olur. Olgunlaşmamış OL teşkil P7, kemirgen beyaz madde % 80'den fazla ve şu anda15,19,20,21ilk MBP+ hücreler gözlenir. Bu nedenle, izolasyon P7, OLs yüksek hücresel verim sağlamak.

OL geliştirme son ve dördüncü aşamada olgun OLs myelinating proteinler (miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), ilişkili miyelin glikoprotein (MAG) ve miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG)22,23 hızlı. ,24,25,26. Bu aşamada olgun OLs Membran Kaplamalar aksonlar çevresinde enwrapping bu formu kompakt genişletmek ve myelinate için edebiliyoruz. Bu fare ve fare beyninde MBP+ hücreleri P1419,20,21, giderek bol olmak gözlem ile örtüşmektedir.

Oligodendrocyte Fewster ve 196727meslektaşları tarafından ilk yalıtım beri kemirgen CNS OLs, izolasyon için çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere immunopanning28,29,30hayata geçirdik, floresans aktif hücre hücre yüzey özgü antijenlere28,31, farklı degrade Santrifüjü32,33,34,35 istismar (FACS) sıralama ve farklı CNS glia36,37fark bağlılık dayalı sallayarak yöntemi. Ancak, mevcut kültür yöntemleri kısıtlamaları, saflık, verim ve38yordamları gerçekleştirmek için gereken süre açısından özellikle bulunmaktadır. Bu nedenle, daha verimli izolasyon yöntemleri oligodendrocytes için gereklidir.

Bu yazıda, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Bu yöntem Emery vd tarafından bildirilen teknikleri bir değişiklik olduğunu 39 ve Dincman vd. 40

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan fareler için SUNY eyalet Tıp Merkezi bölümü, laboratuvar hayvan kaynakları (DLAR) protokol numarası 15-10492 kurallarına göre bakım.

Not: Birincil oligodendrocytes yenidoğan (P5-P7 vahşi tipli C57Bl/6N) izole edildi fareler. Bu aşamada, yüksek hücresel verim sağlamak kemirgen beyaz madde % 80'den fazla olgunlaşmamış OLs oluşturmaktadır. Tüm arabellek ve reaktif kompozisyon Malzemeler tablosonunda mevcuttur.

1. Coverslips hazırlık

Not: Poly-D-lizin (PDL) / kaplı laminin coverslips OL yalıtım önce hazırlanmış.

  1. Yer #1 Alman cam coverslips 50 mL konik tüp içine ve %70 35 mL ekleyin alkol onları temizlemek için.
  2. Tüp kapatmak, bir nutating Mikser yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya. Coverslips gecede inkübe.
  3. % 70 alkol atın.
  4. Coverslips 3 kez deiyonize su ile yıkamak, su vakum aspirasyon ile her zaman kaldır.
  5. 30-35 mL PDL 50 µg/mL coverslips kapsayacak şekilde 50 mL Tüp, yeterince coverslips için ekleyin.
  6. Coverslips bir nutating Mikser üzerinde içeren 50 mL tüp yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya.
  7. Coverslips vakum aspirasyon ile her zaman su kaldırma 3 kez deiyonize suyla yıkayın.
  8. Coverslips 60 mm Petri deiyonize su içeren yemekleri aktarın.
  9. P200 pipet ucu coverslips Petri kabına tüm yüzeyini örten bir katman olarak düzenlemek için kullanın.
  10. Dikkatle, su yemekleri vakum aspirasyon ile kaldırın.
  11. Coverslips etrafında su fazlalığı kaldırmak ve onlara gecede açık kapaklı ve UV mahallede ışığı altında kuru.
    Not: PDL kaplı cam coverslips steril Petri yemeklerinde 4 ° C'de üç aya kadar saklanabilir.
  12. Coverslips 24-şey levha, her şey, iyi forseps kullanarak bir tane yerleştirin.
  13. Coverslips de yapma kenarları kuyu duvarı dokunmayın emin merkezine hareket.
  14. B27NBMA içinde seyreltilmiş 10 µg/mL laminin 100 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek) her coverslip ortasında başlayan ve tüm alanı kapsayacak şekilde kenar kısımlara doğru dairesel şekilde hareket.
    Not: laminin OL bakım ilgilenmektedir ve farklılaşma olgun OLs içine teşvik, vitro kültür41,42,43,44için önemli bir OL hayatta kalma faktörü çünkü.
  15. Bir 37 ° C kuluçka OLs kaplama hazır olana veya en az 1 h için % 5 CO2 plaka kuluçkaya.

2. fare beyin korteksi ayrılma

  1. Doğum sonrası 5-7 günlük eski C57Bl/6N fare pups hızlı işten çıkarma tarafından daha önce % 70 etanol içinde temizlenmiş makas ile kurban.
    Not: serebral cortices 5-6 yenidoğan fare pups üzerinden her hazırlık için kullanılmıştır. Ortalama olarak, bir fare beyin 1-1.5 x 106 OLs verir.
  2. Kafa derisi deri orta çizgi boyunca küçük parçalara makasla kesme ve kafatası ortaya çıkarmak için geri çek.
  3. Kafatası dikkatle arkasında kafatasının ön alan beyin zarar görmesini önlemek için makasla yukarı kaldırarak doğru açılmasını başlayarak orta çizgi boyunca kesin. Sonra kafatasının arkasına açılış kullanarak her göz çukuru kafatasının boyunca doğru kesti.
  4. İyi forseps yavaşça orta uzak cortices alay ve B27NBMA 7 mL içeren 60 mm doku kültürü yemek için aktarmak için kullanın. 2.2 2.4 ile disseke cortices havuzu her beyin için yineleyin.
  5. Cortices 5 mL ayrılma arabellek de içeren yeni bir 60 mm doku kültürü tabak transfer (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain ve 2500 U DNaz ben).
  6. #15 neşter bıçak kullanarak yaklaşık 1 mm3 küçük parçalar halinde cortices zar ve 20 dk bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için kuluçkaya.
  7. 1 mL sığır büyüme serum (BGS enzimatik reaksiyon durdurmak için) ekleyin.
  8. Cortices ayrışma media ile birlikte bir 15 mL konik tüp 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak aktarın.
  9. Yavaşça yavaşça yukarı pipetting tarafından beyin dokusundan ayırmak başlar ve 10 mL serolojik damlalıklı 6 - 8 kez kullanarak aşağı kullanarak bakım baloncuklar en aza indirmek.
  10. 2-3 dakika için yerleşmek ve süpernatant temiz bir tüp aktarmak doku parçaları izin.
  11. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/2500 U DNaz ben doku için cips.
  12. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting sırasında beyin dokusundan ayırmak için 5 mL serolojik pipet kullanın 6 - 8 kez. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.
  13. Doku parçaları 2-3 dakika için yerleşmek izin verir.
  14. Süpernatant temiz bir tüp aktarın. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/DNaz ben doku için cips.
  15. Yavaşça P1000 damlalıklı bahşiş medya karışımı pipetting kullanarak beyin dokusu ayırmak ve beyin dokusu yukarı ve aşağı. Tekrar adımları 2,13 ve 2.14 doku yok büyük boyutta kalıncaya kadar veya B27NBMA kadar % 10 içeren BGS/DNaz yorgun, hangisi ilk olursa. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.
  16. Havuzu hücre süspansiyon ile önceki supernatants.
  17. 50 mL tüp yer 70 µm hücre süzgeç. 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak, havuza alınan hücre süspansiyon yavaşça 70 µm hücre süzgeç geçmek.
  18. B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS/DNaz ben.
  19. Hücre süzgeç atmak. 30-%10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS/DNaz ben.
  20. Hücre süspansiyon için iki 15 mL konik tüp aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
  21. Süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Süpernatant hücre artıkları nedeniyle bulutlu olacak. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS Pelet için.
  22. Dikkatle P1000 damlalıklı kullanarak hücre Pelet ayırmak. %15 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.
  23. Hücre süspansiyon bir taze 40 µm hücre süzgeç geçmek.
  24. B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS. Hücre süzgeç atmak.
  25. %30 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.
  26. Hücre süspansiyon için 2 x 15 mL konik tüpler aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
  27. Çoğu süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Hücre topakları buz soğuk manyetik hücre (MCS) arabellek sıralama 5 mL resuspend.

3. hücre sayımı ve Viabilite tespiti

  1. Hücre süspansiyon 100 µL Trypan mavi çözüm 400 µL 1:5 seyreltme %0,4 (w/v) elde etmek için bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ile sulandırmak.
  2. Bir cam bir hemasitometre odası ve dolgu üzerinde 10 µL P10 pipet kullanarak ve kaçınarak hücre seyreltme ile iki odaları bantlayın ortalayın. Çözüm kılcal eylem tarafından kapak cam altında geçecek.
  3. Hemasitometre mikroskop sahnesinde yerini ve 40 X büyütme kullanarak odağı ayarlayın.
    Not: Bir el karşı her beş kareler (dört köşe ve bir merkezi) kullanarak hücre sayısı kaydedilir. Yalnızca uygun olmayan hücreleri boya emer ve mavi, canlı iken görünür ve sağlıklı hücreler yuvarlak ve Refraktif görünür ve bırakmak mililitre başına uygulanabilir ve toplam hücre sayısı tayini için mavi renkli boya absorbe değil.

4. yalıtım O4+ Oligodendrocytes

  1. Hücre süspansiyon vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Dikkatle süpernatant vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak.
  3. Pelet 90 µL MCS arabelleği başına 1 x 107 toplam hücreleri anti-O4 boncuk 1 x 107 hücre başına 10 µL eklenmesiyle takip resuspend.
  4. Hücre süspansiyon ve boncuk hafifçe parmak ile 15 mL konik tüp 4 - 5 kez flicking tarafından karıştırın.
  5. 4-5 timesevery 15 mL konik tüp parmak ile flicking 4 ° C'de 15 dakika karışımı kuluçkaya 5 dak.
  6. Karışımı yavaşça tüp 2 mL 1 x 107 hücre başına MCS arabellek ekleyerek yıkayın. 200 x g 10 dk at mix santrifüj kapasitesi.
  7. Süpernatant dikkatli vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak. Hücre Pelet MCS arabelleği her 1 x 107 hücreler için 500 µL resuspend.
  8. Manyetik ayırıcı bir manyetik ayırıcı standına bağlayın. Manyetik ayırıcı için bir seçim sütununu ekleyin ve bir 40 µm hücre süzgeç sütun üstüne yerleştirin. İki 15 mL veya bir 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak için ayırma sütununun altında yerleştirin.
  9. 40-µm hücre süzgeç ve ayırma sütun MCS arabellek 3 mL ile ön durulama ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.
  10. Hücre süspansiyon ve boncuk hücre süzgeç ve seçim sütununu içine ekleyin.
  11. 40 µm hücre süzgeç MCS arabelleği 1 mL ile yıkayın.
  12. Hücre süzgeç atın ve hücreleri, boncuk ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.
  13. 3 kez ile 3 mL MCS arabellek ayırma sütun ve 1 saat OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile yıkayın.
  14. Ayrılık sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak, hızlı bir şekilde 15 mL konik tüp içine yerleştirin ve hemen OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya 5 mL ekleyin.
  15. Üstünde tepe-in belgili tanımlık sütun ve sıkıca bas 15 mL konik tüp etiketli hücrelere dışarı floş için lavabo pompası yerleştirin.
  16. Hücre sayımı ve canlılığı Trypan mavi ve hemasitometre madde 3 te belirtildiği şekilde kullanarak belirlemek için hücre süspansiyon, 100 µL kaldırın.
    Not: Hücre canlılığı % 80'i yukarıda OLs kültürü ile devam etmek için kabul edilebilir olarak kabul edilir, ancak canlılığı 90 %'den büyük en uygunudur.

5. kaplama izole O4+ Oligodendrocytes

  1. Hücre süspansiyon için yoğunluğu (coverslip başına 5 x 105 hücre) kaplama desire seyreltik OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya kullanımı.
    Not: devam etmeden önce bir doku kültürü mikroskop kullanarak uygun hücre yoğunluğu onaylanması bu yüzden yoğunluğu tohum OL çok önemlidir. Yoğunluk 10.000 hücre/coverslips aşağıda tohum zavallı hücre yaşam için neden olabilir. Yoğunluk için 10.000 25.000, OL, kaplama morfolojik farklılaşma yavaş45yaşında. Hücre hayatta kalmasını sağlamak için en az 50.000 hücreleri/coverslips tohum bir yoğunluk OLs plaka.
  2. Doku kültürü hood için kuluçka makinesi üzerinden laminin kaplanmış coverslips içeren 24-şey plaka taşımak.
  3. Laminin her coverslip kaldırın ve OL süspansiyon 100 µL ile değiştirin.
  4. 37 °C/5% CO2 kuluçka en fazla OL yapışma sağlar coverslips tanıtmak için 45 dk OLs kuluçkaya.
  5. Kuluçka sonra 24-iyi tabaklar da kuluçka kaldırın. Her sel de, 500 µL OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile 24-şey plaka.
  6. OLs 37 °C/5% CO2 kuluçka ek 24 h için geri koyun.
  7. OLs, kaplama sonra 24 h nükleer silahların yayılmasına karşı medyayı çıkarın ve farklılaşma ikna etmek için OL farklılaşma medya ile yerine.
  8. OLs da kuluçka makinesine koyun ve hücreleri fiksasyon için hazır olana çıkarmak değil.
    Not: pH değişiklikleri OLs için zararlıdır ve hücre canlılığı azaltmak, bu nedenle gereksiz kuluçka makinesi OLs kültürler kaldırılması-meli var olmak kaçmak.

6. ayirt boyama

  1. Hücre tespiti için yüzey işaretleyicileri (NG2, O1 ve O4) kuyulardan medyayı çıkarın.
  2. Fare Hibridoma supernatants (saf) O113 ve O4 (saf)13 karşı birincil antikor içeren 250 µL ekleyin ve NG2 karşı poliklonal tavşan (1:150 B27NBMA içinde seyreltilmiş).
    Not: ticari olarak mevcut anti-O1 ve anti-O4 antikorları kullanılacak ise, üretici tarafından önerilen dilutions kullanmak için tavsiye edilir.
  3. 45 dk 37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine maksimum için birincil antikor hücrelerle kuluçkaya.
  4. İle iki kez % 0.05 Ara-20/1 X PBS yıkayın. %4 paraformaldehyde ile hücreleri tamir (%4 PFA) Oda sıcaklığında 10 dakika için.
  5. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.
  6. Alexa 488 Birleşik keçi Anti-fare IgM ya da anti-tavşan IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde oranında seyreltin.
  7. % 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.
  8. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.
  9. Çift Kişilik iç işaretçileri (GFAP'nin) algılama için boyama için % 0.05 Ara-20/1 X PBS ve blok/permeabilize hücre bloğu/permeabilization arabellek oda sıcaklığında 15 dakika ile kaldırma. Aksi takdirde 6.17 adıma geçin.
  10. Blok/permeabilization arabellek kaldırın ve 250 µL tavuk anti-blok/permeabilization arabellekte seyreltilmiş GFAP'nin (1: 100) ekleyin.
  11. Anti-GFAP'nin oda sıcaklığında 1 h için hücrelerle kuluçkaya. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.
  12. Alexa 594 Birleşik keçi Anti-tavuk IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde sulandırmak.
  13. % 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.
  14. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.
  15. 4' ile 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain ve hücreleri DAPI içeren ortam takma antifade ile monte edin.
  16. Coverslips gecede karanlık oda sıcaklığında tedavi edelim.
  17. Lekeli hücreleri bir epifluorescence mikroskopla görüntü.
    Not: Bu protokol için tek tip çekim hızı kullanarak 40 X büyütme oranında hücreleri görüntüsü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada O4 için geliştirilmiş yalıtım yöntemini kurmak oldu+ hedef hücreleri en olası manipülasyon gerektiren birincil fare oligodendrocytes. Kaplama coverslips hücrelerinin tüm yordamına ötenazi ve yavrularını üzerinden yaklaşık 4 h alır ve burada gösterilen veriler üç bağımsız deneyler temsil eder. Doku ayrılma sonra ortalama 4.3 ± 0,46 x 107 hücre her bağımsız deneme için % 91'i ± %5,6 canlılığı ile izole edildi. Anti-O4 kullanarak immunomagnetic yalıtım many...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim, biz son derece saf olgunlaşmamış fare oligodendrocyte kültürler verimli yalıtım için bir yöntem mevcut. Daha önce yayımlanmış protokolleri39,40' a göre bu yöntem GFAP'nin pozitif astrocytes çok daha düşük düzeyde ve sigara ile karakterize diğer hücrelerin çok düşük bir yüzde ile daha yüksek bir saflık vermiştir. Bu olgunlaşmamış OLs zaten oligodendroglial soy kararlı olduğunu işaret etmek önemlidir. Böylece, bu hücreler farklılaşma erken aşamalarında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Teşekkürler

Bu çalışmada hibe Ulusal multipl skleroz Derneği (RG4591A1/2) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03NS06740402) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ivan Hernandez ve laboratuvar üyeleri laboratuvar alanı, ekipman ve tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10ml serolojik pipetlerFisher Scientific13-676-10J
10ml şırınga Luer-Loc ucuBD, Becton Dickinson309604
15ml konik tüplerFalcon352097
24 oyuklu doku kültürü plakalarıFalcon353935
40µ m hücreli süzgeçFisher Scientific22368547
50ml konik tüplerFalcon352098
5ml serolojik pipetlerFisher Scientific13-676-10H
60mm doku kültürü plakalarıFalcon353002
70&mikro; m hücreli süzgeçFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H+L) ikincil antikorInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgM (H+L) ikincil antikorInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgM (H+L) ikincil antikorInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 keçi anti-tavuk IgG (H + L) ikincil antikorInvitrogenA11042
Anti-O4 boncuk- Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin insanSigmaT1147
Autofil komple şişe üstü filtre tertibatı, 0.22um filtre, 250mlUSA Scientific6032-1101
Autofil komple şişe üstü filtre montaj, 0.22um filtre, 250mlABD Bilimsel6032-1102
B27 TakviyesiInvitrogen17504-044
Borik asitSigmaB7660
Sığır Büyüme Serumu (BGS)GE Healthcare Yaşam BilimleriSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotinSigmaB4639
Desoksiribonükleaz I (DNAse I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
Olympus DP70 kameralı epifloresan mikroskobuOlympusBx51
Tüy tek kullanımlık neşterlerAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
Alman cam lameller, # 1 kalınlık, 12mm çaplı yuvarlakNeuVitroGG-12-oz
GFAP antikoruAvesGFAP
GlikozFisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
İnsülinİnvitrojen12585-014
Manyetik ayırıcı stand - MACS multistandMiltenyi Biotec130-042-303
Manyetik ayırıcı-MiniMACS ayırıcıMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22 & mikro; m filtre ünitesiMillipore SLG033RS
Montaj ortamı - DAPIThermo FisherP36930
N-asetil-sistein (NAC)SigmaA8199
fare lamininInvitrogen23017-015
Nörobazal Orta AInvitrogen10888-022
Nörotrofin-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 antikoruMilliporeAB5320
PapainWorthingtonLS003126
Ca2 + < / sup> ve Mg2 + < / sup>SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
Petri kaplarıFalcon351029
Poli-D-LizinSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteronSigmaP8783
PutresinSigmaP5780
Seçim sütunu-LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
Sodyum SelenitSigmaS5261
Eser elementler BCorning25-000-CI
Triiyodotironin (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Tripan Mavisi ÇözeltisiCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379 B27NBMA
487.75 mL nörobazal ortam A; 10 mL B27 takviyesi; 1 mL Primosin; 1.25 mL Glutamaks; Filtre, sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; Kullanana kadar C.
B27NBMA +% 10 BGS27 mL B27NBMA; 3 mL Sığır büyüme serumu
CNTF çözelti stoğu (10 & mikro; g/ml; 1000X)Peprotech'ten sipariş verin (450-50). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatı (partiden partiye değişebilir) tamponda (örn. DPBS +% 0.2 BSA). -80 ° C.
'de saklayın Çalışma çözümü (10 & mikro; g/ml, 1000X)
1. DPBS solüsyonunda% 0.2 BSA (Fisher scientific BP-1600-100) yapın ve filtre sterilize edin.
2. Ana stok alikotunu 10 & mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS.
3. Aliquot (20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.
d-Biotin stok çözeltisi (50 & mikro; g/ml; 5000X)d-Biotin'i (Sigma-B4639) 50 & mikro'da çift damıtılmış H2O'da yeniden süspanse edin; g / ml (ör. 50 ml ddH2O'da 2.5 mg). Yeniden süspansiyon, makul miktarda ajitasyon / girdap veya 37 ° C'de kısa bir süre hafif ısınma alabilir. D-Biotin hala çözünmüyorsa, daha az konsantre (örn. 10 & mikro; g/ml) ve B27NBMA daha yüksek bir hacim eklemek için (1/5000 yerine 1/1000). 4 derece / C'de saklayın.
DNase I stok çözeltisi1. Buz üzerinde soğutulmuş HBSS'de 12.500 U Deoksiribonükleaz I / ml'de çözün.
2. Filtre buzda sterilize
3. Aliquot 200 &mikro'da; l ve gece boyunca -20 ° C.
4'te dondurun. Alikotları -20 ila -30 ° C'de saklayın.
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (Ca2 + ve Mg2 + olmadan)Torbayı 1 Litre suda çözün ve 1 litre ortam başına 9.6 gram toz elde edin. 2-8 ° C'de saklayın.
Forskolin stok çözeltisi (4.2 mg / ml; 1000X)Şişedeki 50 mg Forskolin'e (Sigma-F6886) 1 ml steril DMSO ekleyin ve tekrar süspanse olana kadar pipetleyin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4.2 mg / ml'ye getirmek için 11 ml steril DMSO ekleyin. Alikot (örn. 20 & mikro; l) ve -20 ° C'de saklayın.
Hank' Dengeli tuzlar (HBSS) (Sigma1. 900 ml su ölçün (sıcaklık 15-20 ° C; C) bir silindirde ve hafifçe karıştırın.
2. Gücü ekleyin ve eriyene kadar karıştırın.
3. Tozun tüm kalıntılarını gidermek için orijinal ambalajını az miktarda su ile durulayın.
4. Adım 2.
5'teki çözüme ekleyin. Son hacmin her litresi için 0,35 gr sodyum bikarbonat (%7,5 a/h) ekleyin.
6. Eriyene kadar karıştırmaya devam edin.
7. Karıştırırken tamponun pH'ını, filtrasyon sırasında yükselebileceğinden, pH= 7.4'ün 0.1-0.3 birim altına ayarlayın. pH.
8'i ayarlamak için 1N HCl veya 1N NaOH kullanılması önerilir. Son hacmi 1L.
9'a getirmek için ilave su ekleyin. 0.22 mikron.
10 gözenekliliğe sahip bir membran kullanarak filtrasyon yoluyla sterilize edin. 2-8 ° C'de saklayın.
İnsülin stok çözeltisi (4000 & mikro; g / ml)Şişeyi çözdürün ve alikot 25 &mikro; Mikrosantrifüj tüpü başına l ve -20 ° C'de saklayın.
Laminin çözeltisiLaminini soğukta yavaşça çözün (2 derece; C ila 8&derece; C) jel oluşumunu önlemek için. Ardından, polipropilen tüplere alikot. 5 ° C'de saklayın; C ila -20 derece; Alikotlarda C (örn. 20 &mikro; l) ve tekrar tekrar donmayın/çözmeyin. Laminin bu sıcaklıklarda altı aya kadar saklanabilir.
Manyetik Hücre Sıralama (MCS) TamponuFosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA, 5 ve mikro içeren çözeltiyi hazırlayın; g/ml İnsülin, 1 g/L Glikoz. Tamponu 0.22 & mikrodan geçirerek filtreleyerek sterilize edin ve gazdan arındırın; m Millex filtresi. Tamponu 4 ° C'de saklayın;
N-Asetil-L-sistein (NAC) stok çözeltisi (5mg / ml; 1000X)N-Asetil-L-sisteini (Sigma-A8199) DMEM'de 5 mg / ml'de çözün (ör. 10 ml B27NBMA'de 50 mg NAC). Filtre sterilize eder ve alikot (örn. 20 & l). -20 ° C'de saklayın.
NT3 stok çözeltisi (1 & mikro; g/ml; 1000X)Ana stok: < / > Peprotech'ten sipariş verin (450-03). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatları (partiden partiye değişebilir), tamponda (ör. DPBS +% 0.2 BSA). -80 ° C.

Depolama stoğu (1 & mikro; g/ml; 1000X):
1. DPBS çözeltisinde% 0.2 BSA yapın ve filtre sterilize edin.
2. Ana stok alikotunu 1 &mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS.
3. Aliquot (örn. 20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.
PDGF stok çözeltisi (10 & mikro; g/ml; 1000X)Ana stok: < / > Peprotech'ten sipariş verin (100-13A). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatları (partiden partiye değişebilir) tamponda (örn. DPBS) + %0.2 BSA). -80 ° C.

Depolama stoğu (1 & mikro; g/ml; 1000X):
1. DPBS çözeltisinde% 0.2 BSA yapın ve filtre sterilize edin.
2. Ana stok alikotunu 1 & mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS.
3. Aliquot (örn. 20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.
Poli-D-lizin (1 mg / ml; 100X)Poli-D-lizin, moleküler ağırlık 70-150 kD (Sigma P6407) 0.15M borik asit pH 8.4'te 0.5 mg / ml'de (ör. 50 ml borat tamponunda 50 mg). Filtre sterilize eder ve alikot (örn. 100 & mikro; l/tüp). Kullanmadan önce 100X stoğunu (1mg/ml) 50 &°C'de saklayın; steril suda g / ml.
Oligodendrosit proliferasyon ortamıbakınız Ek Tablo 1
Oligodendrosit farklılaşma ortamıbakınız Ek Tablo 1
Sato eki (100X)bakınız Ek Tablo 1
Referanslar: reaktiflerin ve tariflerin listesi, daha önce Emery ve ark. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Oligodendrosit soy hücrelerinin fare kortekslerinden immünopanning ile saflaştırılması. Soğuk Bahar Harb Protokolü. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) ve Dincman et. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Kortikal fare oligodendrosit öncü hücrelerinin izolasyonu. J Neurosci Yöntemleri. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
ile Prolong Gold Doğal kullanana kadar C)

Kaynaklar

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oligodendrosit İzolasyonuİmmünomanyetik AyırmaO4 Pozitif HücrelerNeonatal Fare YavrularıManyetik Hücre AyıklamaHücre Süzgeci FiltrasyonuSantrifüj ProtokolüOligodendrosit Proliferasyonuİmmünofloresan Boyama
Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.