Method Article

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurilik motor nöronlar (MNs) böylece hareket ve karmaşık görevleri omurgalılarda kontrol innervating hedefleri, iletişim kurmak için onların aksonlar genişletir. Böylece, akson gidin, arborize ve periferik onların kas innervate motor geliştirme ve dejenerasyon sırasında nasıl hedefler moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir. Transgenik Hb9::GFP fare hatları uzun motor axon yörüngeleri embriyonik gelişim sırasında görselleştirmek için hizmet etmiş olsa da, terminal akson arborization tam spektrum ayrıntılı açıklamaları desen karmaşıklığı nedeniyle eksik kalır ve sınırlamalar geçerli optik mikroskobu. Burada, hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM) ve nitelik ve nicelik motor aksonlar geliştirme görselleştirmek için sağlam görüntü analizi bir araya getiren gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Bu sistem kolayca genetik mutantlar veya MN hastalık modelleri motor axon gezinti ve arborization yol açan yeni moleküler mekanizmalar açığa Hb9::GFP çizgilerle geçmek için kabul edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurilik MNs merkezi sinir sisteminin parçası olan ancak hareketini denetlemek için periferik kasları innervate. Gelişmekte olan omurilik içinde MN ataları (pMNs) notochord ve bitişik somites yayılan sinyaller göre kurulur. Tüm sonrası Mitotik MNs ayrıştırılan sonra pMNs, sonunda bir dizi omurilik1,2rostrocaudal ekseni boyunca MN türlerinden sebebiyet veren oluşturulur. Omurilik MNs arazi ve anatomik olarak de düzenlenmektedir. Morfolojik düzenleri onların anılan sıraya göre hedef konumunu çevre3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kas hedeflerine ulaştıktan sonra akson genişletmek ve ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hayvanların hepsi onaylanmış ve IACUC Academia Sinica tarafından denetlenecektir belirli patojen ücretsiz (SPF) hayvan tesisinde, tutuldu.

1. fiksasyon

  1. Embriyo embriyonik gün 12.5 (E12.5) toplamak sonra başını kesmek ve onları alt.
  2. Embriyolar tek tek 24-şey levha ile 1 mL/taze hazırlanmış %4 paraformaldehyde fosfat tampon serum (PBS) x 1'in de gecede düzeltmek. Bir shaker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
  3. Sabit Embriyolardan en az 3 x, her biri için 5-10 dk, 1 mL 1 x PBS ile yıkama ve gecede 4 ° c üzerinde kalan paraformaldehyde kaldırmak için bir shaker kuluçkaya.

2. bütün Dağı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM embriyo MN yörünge ve akson arborization Mouse ayrıntılı 3D görselleştirme sağlar. Parlak alan altında doku ticari takas reaktif batırılır sonra tamamen şeffaf görünür. Hiçbir büzülme veya örnek şişmesi reaktif görüntüleme önce takas depolama bir hafta kadar sonra fark edildi. Floresans kanal altında motor nöronlar transgenically ifade GFP (film 1) ile etiketlenir. Bazı örnek ayrıntıları axon yapısının bozulması. Örneğin, Şekil 2 düşük k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletişim kuralı birkaç adımda belirli koşullar altında değişikliklere tabi olabilir. Örneğin, fiksasyon süresi 2 h paraformaldehyde taze yapılmış kullanarak 1 veya daha fazla gün için değişen embriyo yaşın üzerinde bağlıdır. Fiksasyon için protein crosslinking, hassas antikorlar için bütün Dağı immunostaining önce yürütülen metanol alternatif bir sabitleştirici ajan olarak kullanılabilir. Boyama üzerine bir yüksek sinyal gürültü oranı için deterjan toplama en iyi duruma getirmek gereklidir (0,1-0,5 arasında %). Ek yıkama.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM deneyleri ve veri analizi kısmen enstrüman hizmet bölümü gelişmiş optik mikroskoplar kullanarak Academia Sinica ve Bayan Shu-Chen Shen yardımı ile yapıldı. Bayan Sue-Ping Lee Imaging Core tesis, IMB Imaris görüntü analizi ile önemli teknik destek için teşekkür ediyoruz. IMB'ın bilimsel İngilizce düzenleme Core el yazması inceledim. Bu eser Academia Sinica kariyer geliştirme Ödülü (CDA-107-L05), en (104-2311-B-001-030-MY3) ve NHRI (NHRI-EX106-10315NC) tarafından finanse edilmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPJackson laboratuvar005029Embriyonik gün 12.5 (E12.5)
%4 Paraformaldehit (PFA)embriyolarını toplayın200ml için: ddH2O'da 20ml 10X PBS, 8g PFA ekleyin. NaOH (10N) ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Filtre, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.
Fosfat tampon salin 10X (PBS 10X)1L için: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 ekleyin ve ddH2O ile doldurun. Otoklavlayın ve RT'de saklayın.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Fetal Sığır SerumuThermoFisher26140079
Koyun poliklonal anti-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 eşek anti-koyunInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 temizleme reaktifiSunJin LabRC149001
1.5ml mikro tüpSarstedt72.690.001
24 kuyu plakasıThermoFisher142475
5 SA Cımbızideal-tek3480641
İris Makas striaght keskin/keskinAesculapBC110R
Mikrocerrahi Neşterleri, tek kullanımlıkAesculapBA365
Diseksiyon mikroskobuNikonSMZ800
ShakerTKSRS-01
Lightsheet Z.1 mikroskobuCarl Zeiss Mikroskopi
Imaris 8.4.0 görüntü analiz yazılımıBitplane, Zürih, İsviçre
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP fareleri)The Jackson Laboratory005029

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles