Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

7.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57546

⸱

11 Mayıs 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Özet

Omurilik motor nöronlar (MNs) böylece hareket ve karmaşık görevleri omurgalılarda kontrol innervating hedefleri, iletişim kurmak için onların aksonlar genişletir. Böylece, akson gidin, arborize ve periferik onların kas innervate motor geliştirme ve dejenerasyon sırasında nasıl hedefler moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir. Transgenik Hb9::GFP fare hatları uzun motor axon yörüngeleri embriyonik gelişim sırasında görselleştirmek için hizmet etmiş olsa da, terminal akson arborization tam spektrum ayrıntılı açıklamaları desen karmaşıklığı nedeniyle eksik kalır ve sınırlamalar geçerli optik mikroskobu. Burada, hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM) ve nitelik ve nicelik motor aksonlar geliştirme görselleştirmek için sağlam görüntü analizi bir araya getiren gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Bu sistem kolayca genetik mutantlar veya MN hastalık modelleri motor axon gezinti ve arborization yol açan yeni moleküler mekanizmalar açığa Hb9::GFP çizgilerle geçmek için kabul edilebilir.

Giriş

Omurilik MNs merkezi sinir sisteminin parçası olan ancak hareketini denetlemek için periferik kasları innervate. Gelişmekte olan omurilik içinde MN ataları (pMNs) notochord ve bitişik somites yayılan sinyaller göre kurulur. Tüm sonrası Mitotik MNs ayrıştırılan sonra pMNs, sonunda bir dizi omurilik1,2rostrocaudal ekseni boyunca MN türlerinden sebebiyet veren oluşturulur. Omurilik MNs arazi ve anatomik olarak de düzenlenmektedir. Morfolojik düzenleri onların anılan sıraya göre hedef konumunu çevre3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kas hedeflerine ulaştıktan sonra akson genişletmek ve şube için onları teşvik hücresel ve eksojen Nörotrofik faktör almak kas içine daha fazla. İnnervasyon ve dallanma kusurları nöromüsküler kavşak (NMJ) oluşturmak için başarısızlık için katkıda bulunabilir. Örneğin, gliyal kaynaklı Nörotrofik faktörler (GDNF)-indüklenen Pea3 axon arborization Kutanöz maximus (CM) içine için vazgeçilmez ve latissimus dorsi (LD) kas4,5. Buna ek olarak, DINE nakavt fare embriyo solunum yetmezliği ve ölüm hemen doğum6,7sonra neden diyafram, frenik sinir arızalı arborization gösterir. Bu nedenle, bu son adım MN olgunlaşma (Yani, aksonlar projeksiyon ve dallanma) nöronlar ve hedef hücreler arasındaki iletişimi sağlamak için önemlidir.

Arborization desenleri görüntülemek için araştırmacılar normalde confocal görüntüleme veya İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu kesitli veya bütün-bağlama örnekleri8,9,10kuralları. Bu mikroskobu tekniklerin her ikisi de kabul edilebilir çözünürlük ve derinlik penetrasyonu oluşturmak. İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu, iki alt-enerji fotonlar11eşzamanlı absorpsiyonu ile fluorophores uyarma içerir. İki fotonlu uyarma yakın kızılötesi radyasyon kullandığından, azalan uyarma sıklığını azaltılmış saçılma ve daha iyi doku penetrasyonu 1 mm doku, böylece daha büyük derinlik ile görüntülemede izin katkıda bulunur. Confocal mikroskobu odak out ve sinyalleri sadece odak düzlemi12içinde ışık toplar filtreleri kaldırır. Bu yaklaşım ile örnekleri farklı odak uçak görüntülerini bir Z-yığın fonksiyonu üzerinden üç boyutlu (3D) görüntü üretmek için kombine edilebilir. Yine de, sinyal şiddeti ışık çoğunu engellenir ve yüksek sayısal açıklık alan derinliği belirsiz olarak azalır. Daha da önemlisi, herhangi bir anda yalnızca bir uçak bile görüntüsü aydınlatma bütün numune alır bu yana her iki tekniğin de şiddetli duyarlilik ve fototoksisite katkı.

Bu eksikliklerini aşmak için LSFM hızlı, ışık verimli olmanın avantajı ile tercih edilen bir alternatif ve daha az Fototoksik13,14haline gelmiştir. Ayrıca, LSFM çok görünüm görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım Özellikle onlar 3D uzayda yaymak gibi motor aksonlar ve dispersiyon onların terminalleri görüntülenmesi için uygundur. Örnekleri x, y ve z eksenleri boyunca hareketler ve bir dikey ekseni çevresinde döndürme sağlar bir sahnede monte edilir çünkü LSFM diğer iki seçenek daha iyi performans. İkisi de montaj örnekleri düz bir slaytta gerektiren bu kurulum sadece örnek en az engellenen bir görünümünü aynı zamanda bir arzu edilen aydınlatma yol, İki fotonlu ve confocal mikroskobu, bir eksiklik seçimi sağlar. Bu nedenle, LSFM en uygun miktar motor sinir Terminal içinde fare embriyo ve akson arborization 3D görüntüleme için bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Canlı hayvanların hepsi onaylanmış ve IACUC Academia Sinica tarafından denetlenecektir belirli patojen ücretsiz (SPF) hayvan tesisinde, tutuldu.

1. fiksasyon

  1. Embriyo embriyonik gün 12.5 (E12.5) toplamak sonra başını kesmek ve onları alt.
  2. Embriyolar tek tek 24-şey levha ile 1 mL/taze hazırlanmış %4 paraformaldehyde fosfat tampon serum (PBS) x 1'in de gecede düzeltmek. Bir shaker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
  3. Sabit Embriyolardan en az 3 x, her biri için 5-10 dk, 1 mL 1 x PBS ile yıkama ve gecede 4 ° c üzerinde kalan paraformaldehyde kaldırmak için bir shaker kuluçkaya.

2. bütün Dağı Immunostaining

  1. Her embriyo % 0,5 1 ml permeabilize PBS-Triton-X-100 (PBST) bir gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde.
  2. Her örnek 1 mL 1 x PBS gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde FBS hazırlanan % 10 ile engelleyin.
  3. 1 mL anti-GFP birincil antikor ile embriyo kuluçkaya (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) 4 ° c sabit motor sinirler GFP sinyalinin yoğunlaştırmaya sallayarak ile 72 h için.
  4. Birincil antikor kuluçka sonra % 0,5 ile 1 mL yıkamak %0,5 değiştirme PBST bir shaker üzerinde 4 ° C'de 1-2 gün boyunca PBST en az üç kez.
  5. İkincil antikor 1 mL uygulamak (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) ve gecede 4 ° C'de sabit sallayarak ile karanlıkta kuluçkaya.
  6. 3 x 1 mL % 0,5 ile yıkayın bir shaker 2-3 gün boyunca üzerinde 4 ° C'de PBST. Örnekleri 1 x PBS 4 ° C'de görüntüleme önceki gün kadar devam et.
    Not: Takas, bağlı olarak bölüm embriyoların yansıması önce küçük parçalara embriyo disseke. Ön ayakları bu deneysel yaklaşım (şekil 1A) korunur.
  7. Bir ticari takas reaktif bir Kırılma indisi ışık oda sıcaklığında gecede, embriyo görüntüleme için şeffaf işlemek için korumalı bir 1,5 mL tüp 1,49 ND ile embriyo kuluçkaya.
    Not: Takas reaktif hacmi yaklaşık beş kez numune hacmi ki.

3. LSFM (2-3 h)

  1. Örnek kurulum
    1. 5 X / 0.1 ayarla aydınlatma optik ve 5 X / 0,16 algılama optik. Örnek sahibi ve örnek kılcal (1.5 mm iç çapı, yeşil) Montaj ve onları mikroskop yer.
      Not: ayrıntılı kurulum yordamları için mikroskop'ın işletim kılavuzuna bakın.
    2. Embriyo aşağıdaki gibi bağlayın:
      1. P200 pipet ucu kılcal damar çapını sığması uzakta üst kısmı keserek hazırlamak ve çıkarmak sivri bölüm (~ 3 mm) örnek ek için.
      2. Küçük bir alev kullanarak pipet ucu körelmenin sona eriyor.
      3. Alev söndürmek ve hızlı bir şekilde dikey olarak üzerine eritilmiş sonunda embriyo ekleyebilirsiniz.
      4. Örnek kapiller pipet ucuyla üst kısmındaki uygun.
    3. Enkaz veya baloncuklar temizlemek 1 dk için embriyo ile equilibrate odası arabellek izin.
    4. Görüntüleme yazılımı kullanarak, yerleştirme kapiller bulun sekmesi altında seçmek ve ayarlamak x, y, z eksenleri boyunca örnek kılcal konumlandırmak için.
    5. Yerleştirme örnek seçin ve embriyo üzerinde odaklanmak için 0,6 X yakınlaştırma. Görüntülü bacak uzun ekseninin iki ışık kaynağı (şekil 1B) ışık yolu ile hizalandığından emin olun embriyo döndürün.
  2. Resim alma
    1. Satın alma sekmesinin altındaki algılama hedefleri gibi ışık yolunu parametreleri tanımlamak, engelleme filtresi, ışın bölücü, fotoğraf makinesi ve lazer lazer.
      Not: Bu deneyde GFP kanal kullanılır (uyarma dalga boyu: 488 nm; emisyon filtresi: BP 505-545 nm, ışın splitter: SPS LP 560).
    2. Gölge azaltılması için Özet inceden inceye gözden geçirmek onay kutusunu işaretleyin.
    3. Satın alma ayarlarını tanımlayın: bit derinliği, 16 bit; Büyütme, 0,36-0,7 X; tek taraflı aydınlatma (sol/sağ) veya çift tarafı aydınlatma.
    4. Sürekli ' yi tıklatın ve lazer yoğunluğu, pozlama süresi, lazer güç ve hafif levha pozisyon daha net görüntüler elde etmek için ayarlayın.
      Not: Lazer güç duyarlilik en aza indirmek mümkün olduğunca düşük tutulur.
    5. Resim alma bitirmek için Dur tuşuna basın.
  3. Çok boyutlu edinme
    1. Z-yığın Z pozisyon için ilk ve son görüntü hareket ettirerek tanımlayın. Dilim numarasını ayarlamak için Optimal ' ı tıklatın.
    2. Seçili z-yığın kazanmak için Deneme başlatmak'ı tıklatın.
    3. Bittiğinde, resmi .czi biçiminde kaydedin.
  4. Görüntü işleme (isteğe bağlı)
    1. Çift tarafı aydınlatma uygulanırsa çift yan füzyon ile Lightsheet işleme kanal altında devam edin. MultiView işleme birden çok açılardan görüntüleri birleştirmek için çoklu gösterim aldıysanız gereklidir.
    2. Bir 2B görüntü En fazla yoğunluk projeksiyon kanalın altında projeksiyon eksen boyunca yüksek yoğunluğu piksel verilerini kullanarak oluşturun.
    3. Kopya kanal altında görüntüleri alt kümelerine özgün kümesinden seçmek için alt küme küme küme ' ı tıklatın.

4. miktar Axon Arborization (tek tek her sinir için 30 dk)

  1. Görüntü dosyasını görüntüleme analizi yazılımı açın (varsayılan olarak, görüntü XYZ veri içeren Surpass modunda ve 3D render görünümü olarak açılır).
  2. Görüntü renk, parlaklık, ayarlamak ve Ekran ayarlaması penceresi kullanarak kontrast (Edit | Ekran ayarlama göstermek) yerel yoğunluğu Karşıtlık'dayalı filamentler algılamak için.
  3. Eklemek yeni filamentler simgesine tıklayın ve açılan menüde Autopath (döngü) algoritma seçin.
  4. Faiz (Bu durumda, ilgi segmenting akson) seçin. Bittiğinde İleri ' yi tıklatın.
  5. Başlangıç ve tohum Puan dilim modunu kullanarak ölçülen en büyük ve en ince çapı ölçümleri atayarak tanımlayın.
  6. İlgi alanının kenarında bir başlangıç noktası atayın. El ile ekleme ya da kaldırma başlangıç noktası, elde etmek için ilk işaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve ardından üst karakter + sağ tıklatın olarak ilgi noktaları.
  7. Tüm görünür arborization işaretlenmiş emin olmak tohum puan için el ile eşikler seçin. İşaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve tohum noktaları el ile ekleyip sonra Shift + sol tıklayın olarak ilgi noktaları.
    Not: Arka plandaki gürültüleri ve sinyalleri komşu sinirler el ile kaldırmak önemlidir.
  8. Başlangıç noktası etrafında tohum noktalarını kaldırmakkutuyu işaretleyin.
  9. Bu çok uzakta olmaları ve bu arka plan gürültü temsil edebilir Puan hariç tutulmasına izin için Kaldır bağlantısı kesilmiş parçaları kontrol edin. Dışlama için üst sınırı tanımlamak için Gap uzunluğu en fazla sırada gösterir.
  10. Her Voksel arka plan yoğunluğunu tahmin etmek için bir Gauss filtre kullanan arka plan çıkarma için eşik ayarlayın.
  11. Dendrite çapı yaklaşık kesit alanı algoritmasıyla için Otomatik eşik ayarlayın.
  12. Omurga hesaplaması için adımları atlayın.
  13. İşlemi tamamlamak ve istenen stilini ve rengini seçin.
  14. Sadece yeniden oluşturulan aksonlar görüntülemek için Özellikler birim kutusunda onay kutusunu temizleyin.
  15. Detaylı İstatistikler sekmesinde seçin. Tel No kullanmak Dendrite Terminal Puan motor sinir terminallerine motor axon arborization bir göstergesi olarak ölçmek için.
    Not:-Ebilmek var olmak mülhak istatistiksel ek açıklama isterseniz.
  16. Yeniden oluşturulan axon görüntüsünü bir .tif dosyası olarak verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LSFM embriyo MN yörünge ve akson arborization Mouse ayrıntılı 3D görselleştirme sağlar. Parlak alan altında doku ticari takas reaktif batırılır sonra tamamen şeffaf görünür. Hiçbir büzülme veya örnek şişmesi reaktif görüntüleme önce takas depolama bir hafta kadar sonra fark edildi. Floresans kanal altında motor nöronlar transgenically ifade GFP (film 1) ile etiketlenir. Bazı örnek ayrıntıları axon yapısının bozulması. Örneğin, Şekil 2 düşük k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İletişim kuralı birkaç adımda belirli koşullar altında değişikliklere tabi olabilir. Örneğin, fiksasyon süresi 2 h paraformaldehyde taze yapılmış kullanarak 1 veya daha fazla gün için değişen embriyo yaşın üzerinde bağlıdır. Fiksasyon için protein crosslinking, hassas antikorlar için bütün Dağı immunostaining önce yürütülen metanol alternatif bir sabitleştirici ajan olarak kullanılabilir. Boyama üzerine bir yüksek sinyal gürültü oranı için deterjan toplama en iyi duruma getirmek gereklidir (0,1-0,5 arasında %). Ek yıkama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

LSFM deneyleri ve veri analizi kısmen enstrüman hizmet bölümü gelişmiş optik mikroskoplar kullanarak Academia Sinica ve Bayan Shu-Chen Shen yardımı ile yapıldı. Bayan Sue-Ping Lee Imaging Core tesis, IMB Imaris görüntü analizi ile önemli teknik destek için teşekkür ediyoruz. IMB'ın bilimsel İngilizce düzenleme Core el yazması inceledim. Bu eser Academia Sinica kariyer geliştirme Ödülü (CDA-107-L05), en (104-2311-B-001-030-MY3) ve NHRI (NHRI-EX106-10315NC) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hb9::GFPJackson laboratuvar005029Embriyonik gün 12.5 (E12.5)
%4 Paraformaldehit (PFA)embriyolarını toplayın200ml için: ddH2O'da 20ml 10X PBS, 8g PFA ekleyin. NaOH (10N) ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Filtre, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.
Fosfat tampon salin 10X (PBS 10X)1L için: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 ekleyin ve ddH2O ile doldurun. Otoklavlayın ve RT'de saklayın.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Fetal Sığır SerumuThermoFisher26140079
Koyun poliklonal anti-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 eşek anti-koyunInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 temizleme reaktifiSunJin LabRC149001
1.5ml mikro tüpSarstedt72.690.001
24 kuyu plakasıThermoFisher142475
5 SA Cımbızideal-tek3480641
İris Makas striaght keskin/keskinAesculapBC110R
Mikrocerrahi Neşterleri, tek kullanımlıkAesculapBA365
Diseksiyon mikroskobuNikonSMZ800
ShakerTKSRS-01
Lightsheet Z.1 mikroskobuCarl Zeiss Mikroskopi
Imaris 8.4.0 görüntü analiz yazılımıBitplane, Zürih, İsviçre
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP fareleri)The Jackson Laboratory005029

Kaynaklar

  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685(2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Işık Sayfası MikroskopisiHb9-GFP FareleriGörüntü Analiz YazılımıFilament NicelemesiÖrnek ŞeffaflaştırmaAntikor İnkübasyonuZ-Yığını Edinimi
Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.