Method Article

Aortopathy aort anevrizması β-aminopropionitrile-indüklenen ve diseksiyon, fare modeli nicel mikro-CT Analizi

DOI:

10.3791/57589

⸱

July 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Division of Vascular Surgery, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji radyoopak .Kurşun bazlı silikon kauçuk fare damarlara aort çapı miktar aort anevrizması ve diseksiyon, bir fare modeli için sıvı için kullanma.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aort anevrizması ve diseksiyon önemli morbidite ve mortalite nüfus ile ilişkilidir ve son derece öldürücü olabilir. Aort hastalığı hayvan modelleri mevcut iken, damarlara in vivo görüntüleme sınırlı olmuştur. Son yıllarda, mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) büyük ve küçük damarları görüntüleme için tercih edilen bir yöntemi olarak ortaya çıkmıştır in vivo ve ex vivo. Vasküler döküm yöntemi ile birlikte, biz başarıyla frekans ve β-aminopropionitrile-tedavi C57/Bl6 farelerde aort patoloji dağılımı ayırdetmek için mikro-CT kullanmıştır. Bu yöntemin teknik sınırlamalar zavallı hayvan hazırlık, gemi boyutu miktar için uygun yöntemleri uygulanması ve sigara-Beka Bu yordam tarafından perfüzyon kalitesini varyasyonları içerecek. Bu makalede anevrizması ve diseksiyon, fare modeli aortopathy nicel karakterizasyonu için bir kurşun tabanlı radyoopak silikon kauçuk intravasküler perfüzyon için bir metodoloji ayrıntıları. Aort patoloji görselleştirme ek olarak, bu yöntem diğer vasküler yatak vivo içinde veya vasküler yatak kaldırıldı öldükten sonra incelenmesi için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aort diseksiyonu insidansı başına 100.000 yıl13 vaka var. Aort diseksiyonu aneurysmal hastalıklar 10.000'den fazla kişinin ölümünden Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl, Batı ülkelerinde2' deki tüm ölümlerin % 1-2 için muhasebe hesap ve. Aort diseksiyonu damar intimal tabaka kan aort duvar fizyolojik baskılar altında katmanları yayılması ile bir yırtık tarafından başlatılır. Yükseltilmiş hasta nabız basınçları artmış insidansı diseksiyon ve komplikasyonlar ile ilişkilidir. Artan duvar kesme stres bir anevrizma oluşumu3,4' e lider aort duvar genişleme ile ilişkilidir. Aort diseksiyonu sonuçlarını tıkanıklığı kan akımı uzak organlara beyin, böbrek, bağırsakları ve bacaklarda, kronik anevrizma rüptürü veya Ölüm5,6,7oluşumu da dahil olmak üzere içerir.

Şu anda, hala kötü biyokimyasal ve hücresel işlemleri başlatma ve aort anevrizmalarının ve diseksiyonu dahil anlaşılır. Aort anevrizması ve diseksiyon tekrarlanabilir hayvan modelleri onların patofizyolojisi anlama anahtarıdır. Β-aminopropionitrile (BAPN) kolajen ve elastin cross-linking engeller ve önemli ölçüde damar duvar hücre dışı matriks ve onun biyomekanik bütünlüğü6yapısını değiştirmek için gösterilen bir lysyl oksidaz inhibitörü olduğunu, 8. BAPN ile tedavi kemirgenler aort anevrizması ve diseksiyon9,10ortak hayvan modeli olarak kullanılmıştır.

Vasküler görüntüleme yöntemleri vasküler patoloji belirlenmesi, gemi a_ılabilinirse teyit ve organ perfüzyon değerlendirilmesi instrumental vardır. Son zamanlarda, mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) damarlara fareler ve benzer şekilde ölçekli hayvanlar eğitim için kullanılmıştır. Kemik, intraluminal kan doğal olarak nispeten x olduğu gibi bilgisayarlı tomografi tarafından kan damarlarının Aksiyel görüntüleme sınırlıdır. Ancak, intravasküler kontrast ajanlar ile birleştirildiğinde, mikro-CT makro-anatomik vasküler patoloji11incelenmesi için hayvan vasculatures detaylı üç boyutlu rekonstrüksiyon sağlar.

Seçili kontrast ( Tablo reçetesigörmek) kurşun kromat ve Kurşun sülfat içeren bir radyoopak silikon kauçuk ajandır. Bir katalizör varlığında perfüzyon bunu hızlı bir şekilde damarlara damarlara arka plan doku aksine son derece radyoopak yapma gemiler, makro-anatomik mimarisinde minimal değişiklikler ile bir döküm oluşturmak üzere sertleşir zaman röntgenlerle inceledi. Bu kontrast Ajan avantajlı çünkü işlemek kolay ve doku bozulması ve gemi kaybı genellikle vasküler döküm korozyon ile ilgili kırılması nedeniyle önler. En az büzülme12ile tedavileri, damarları kandan temizlenir patent kalır ve hayatta kalma sigara deneylerde hayvan makro-damarlara doğru bir değerlendirme için izin. Önceki iş başarıyla radyoopak silikon kauçuk-kontrast hayvan çalışmaları çeşitli kullandı. Özellikle, koroner, glomerular, plasenta ve beyin dolaşımları11,12,13,14,15 görselleştirme içinde uygulanabilirliği gösterilmiştir. Bu yazıda, biz kurşun tabanlı radyoopak silikon kauçuk kantitatif aort patoloji BAPN kaynaklı bir fare modeli mikro-CT tarafından karakterize damar içi perfüzyon için açık sol ventriküler ponksiyon metodolojisi detay

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşleme hayvan protokollerde kurumsal hayvan bakım ve Maryland Üniversitesi, Baltimore (hayvan iletişim kuralı numarası 0116024) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve AAALAC uluslararası standartlara göre yapılmıştır.

1. hazırlanması reaktifler

  1. Heparin
    1. 1000 250 µL seyreltik U/mL heparin sülfat 50 ml fosfat tamponlu tuz 5 U/mL nihai bir konsantrasyon yapmak.
    2. Heparinized (5 U/mL) sıcak fosfat tamponlu tuz, 37 ° C'ye ayarla bir su banyosunda damarlara kan yerini alacak
    3. Gerekli tüp bağlanarak basınç kontrollü pompa hazırlamak ve 10 mL şırınga, heparinized-serum arabellek için 1 ve 1 kontrast Aracısı için 2 boş.
    4. Boru sıcak heparinized fosfat tamponlu tuz ile doldurun ve hava kabarcıkları basınç pompası boru üzerinden kaldırın.
  2. Karşıtlık aracı
    Not: Lütfen kontrast Ajan kit bileşenlerinin için Malzemeler tablo için bakın.
    1. Pigmentli bir bileşik bir 1:6 boya Dilüent oranı elde etmek için bir eritici karıştırın.
    2. Kullanımdan hemen önce (adım 2.3.12), 200 µL seyreltilmiş pigmentli bahçedeki her 5 mL aliquot kür bir ajana onları (Hacmen % 4) iyi ekleyip karıştırın.
      Not: Üretici 40 dk çalışma zamanı olduğunu bildirdi. Silikon kauçuk kontrast Ajan kür Ajan eklenmesinden sonra 20 dk polimerize başlar gibi çözüm hemen önce onun infüzyon hazırlamak önemlidir.
  3. BAPN içme suyu
    1. β-aminopropionitrile (BAPN) 3 g/L (daha önce açıklanan literatürde protokolleri uyarlanmıştır)9,16,17son bir toplama oluşturmak için içme suyunda geçiyoruz.
    2. Sonra onları 4 hafta-in yaş perfüzyon zaman mikro-CT için kadar fareler bir gruba BAPN içeren içme suyu yönetmek

2. cerrahi müdahale

  1. Hayvan hazırlık
    1. Fareler 3 haftalıkken sütten, onları bir 12 h ışık/12 s karanlık döngüsü korumak ve standart kemirgen chow besledin. BAPN tedavi grubu için taze hazırlanmış BAPN içme suyu için 16-26 hafta ad libitumyönetmek. Standart içme ile denetim hayvanlar ad libitumsu sağlar.
  2. Anestezik tekniği
    Not: 24 h CT analizi, aşağıdaki yordamı önce gerçekleştirilir. Cerrahi işlemler örnek bir ölüm sonrası intrakardiyak perfüzyon için hazırlamak için geçerli duruma geldiğinden.
    1. Bir anestezi indüksiyon tank ile % 100 O2 ve %3 isoflurane hassas Buharlaştırıcı teslim yoluyla teşvik. Anestezi indüksiyon sonra isoflurane durdurma ve odası O2ile yıkayın. 2-%2,5 isoflurane ve 1 L/dk O2 burun konisi ile anestezi korumak.
    2. İndüksiyon odası ve sağlamlılık personel korumak için bir kömür tutucu için atık gaz adsorpsiyon için ekleyin. Yeterli bir anestezik uçak zararlı uyaranlara (ayak tutam) yanıt olduğunu göstererek sağlamak.
    3. Cerrahi bir tepsi ve gerekli cerrahi aletler oluşan bir operatif alanı hazırlamak.
    4. Hayvan cerrahi alanına aktarın ve dorsal recumbency içinde konumlandırın.
  3. Operatif Teknik
    1. Makas kullanarak, bir ensizyon deri ve yumuşak doku deri ve yumuşak doku göğüs kemiği örten aracılığıyla genişletme sternal çentik için kasık symphysis arasında orta dan olun.
    2. Makas kullanarak, göğüs boşluğuna girmek için xiphoid işleminde diyafram bir delik oluşturun.
    3. Makas ventral göğüs duvarı diyafram bilateral incelemek için kullanın.
    4. Göğüs kemiğinin hemen sternal sınırda kaburga ayırmak için nodern kıkırdak kesti.
    5. Göğüs kemiği (yakınındaki xiphoid işlemi) ucu iyi bir kan durdurucu sargı kelepçe uygulamak ve fare başının üzerine konumlandırılmış hemostat cranially taşıyın. Bu timus ve uzak kalp ve daha fazla manipülasyon için büyük damarlarının açığa kalp, göğüs kemiği geri çek.
    6. Keskin kalp ve göğüs duvarı arasında herhangi bir ek parçalara.
    7. 10 mL heparinized fosfat tamponlu tuz (5 U/mL) ile önceden yüklenmiş bir şırınga 27'lik IV kateter iğne bağlanabilir ve hava kabarcıkları basınç pompası tüpler kaldırmak için arabellek ile tüm boru doldurunuz.
    8. Kabarcıklar sıvı doğrultusunda küçük gemi dolum engelleyebilir gibi sıvı hazırlarken dikkatli olun. Bu tam bir doldurma ve eserler için son görüntüleme tanıtımı için gerekli ses düzeyini değiştirme kesik damarları dışarı sızmaya kontrast Ajan neden olur gibi hayvan hazırlık sırasında hasar damarlarının sayısını sınırlayın.
    9. Bir dik açılı mengene ile stabilize 27 lik bir iğne ile sol ventrikül delik. Hemen sağ ventrikül veya heparin çözüm ve kan boşaltmak için inferior vena kava deşmek.
      Not: Heparin bir antikoagülan olarak hayvanın ölümünden sonra damarlarının pıhtı kan önlemek için kullanılır.
    10. Hayvan 2 mL/dakika tek şırınga pompa kullanarak sabit bir hızda sıvı. Görünür organlarının sarararak dikkat edin. Venöz dolaşım boşaltma perfusate kan (yaklaşık 5-6 mL) boşalana kadar perfüzyon devam. Pompa kes.
    11. IV kateter boru iğne pozisyonu sol ventrikül bozmaya değil dikkat çekici 10 mL şırıngadan çıkarın.
    12. Hemen sonra tam kan kaybı, kontrast Ajan çözüm 5 mL aliquots ayırabilir ve kür ajan şu anda ekleyebilirsiniz (bkz. Adım 1.2). Onları iyice karıştırın. 5 mL kadar kontrast Ajan karışımı bir 10 mL şırınga çizmek ve o hayvanla sıvı.
    13. Venöz çözüm çıkmadan görülebilir ne zaman gemiler (atar ve toplar damarlardaki) tam doldurmak için infüzyon noktası geçmiş devam. Koroner arterler, pulmoner arterler, bağırsak ve karaciğer damarlara döküm ajan görselleştirme dahil olmak üzere başarılı bir perfüzyon belirtileri arayın.
    14. Kontrast Ajan oda sıcaklığında yaklaşık 20 dk sonra tedavi edecek. Kür, üzerine gerektiği gibi bireysel organları, hasat ve % 10 tarafsız tampon formalin içinde düzeltmek. Örnekleri için mikro-CT ertesi gün tarama kullanılmazsa tüm leşleri düzeltmek. Mürekkep sonraki gün kullanılacaksa, onları metal bir tepsi üzerinde konumlandırın ve 4 ° C'de gecede tedavi için bir buzdolabında koyun.

3. mikro-CT tarama ve parametreleri

Not: Belirli görüntü edinme parametreleri kullanma içinde belgili tanımlık makine bağımlı olacaktır.

  1. X-ışını bilgisayarlı tomografi görüntüleri her fare bir x-ışını tüpü gerilim 55 kVp, 150 μA mevcut, 2.19 sistem yakınlaştırma faktörü ve bir CCD kamera piksel binning faktör 2 kullanarak bir mikro-CT tarayıcı kullanarak perfüzyon ertesi günü elde etmek. Bu 29 µm etkili piksel boyutunu verir.
    1. Fare leşi sırtüstü mikro-CT tarayıcı açayım ve bir izci X-ray tarama elde edilir.
    2. Dedektör görüş alanı 57.4 mm 37.1 mm (transaxial) x (Aksiyel) aort tam boy görüntü için gövde üzerinde odaklanın.
    3. 2 derece ve projeksiyon 2800 MS başına bir kez bir rotasyon artışı ile 180 resim projeksiyonları elde etmek.
  2. Değiştirilmiş bir Feldkamp algoritma kullanarak görüntüleri yeniden; 29 29 µm3 x 29 x yeniden oluşturulan Voksel boyutudur (dilim kalınlığı = 29 µm) Multimodal 3D görselleştirme eklenti burada kullanılan yazılımı kullanarak.

4. son işlem ve işleme

  1. CT veri uygun yazılımı kullanarak bir DICOM biçimine dönüştürün.
  2. Anevrizma mevcut olup olmadığını belirlemek için görüntüleri analiz. Torasik aort, azalan aort en geniş noktada küçük eksen çapı ölçmek ve abdominal aort daha önce18 (Şekil 1) açıklandığı gibi.
    Not: bizim çalışmada, iki bağımsız gözlemciler tarafından (bir kör) görüntüleri analiz edildi anevrizma mevcut olup olmadığını belirlemek için bir DICOM görüntüleyici kullanarak. İkincil eksen çapı Torasik aort ve abdominal aort yukarıda açıklanan19 (Şekil 1) azalan aort en geniş noktada ölçüldü. BAPN tedavi edilmezse farelerin aneurysmal arteryel kesimleri yaş eşlemeli denetim değerleri olarak hizmet veren normal gemi çapları kurulan demek.
  3. Anevrizma aort parçaların çapları başvuru çapının % 50 daha fazla için yerelleştirilmiş veya diffüz genişleme olarak tanımlanır. Bunlar üzerinde yukarıdaki ölçümler dayalı bulun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı değerlendirmek için 20 erkek yetişkin fareler, karışık arka plan olarak yukarıda açıklanan19 ve 20-30 hafta-in yaş, ile ya da ezelî BAPN tedavi, bir kurşun tabanlı radyoopak silikon kauçuk ile derin (bkz: malzemeler tablo ) yukarıda ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak. Ertesi gün mikro-CT tarama yapıldı (resim 1 ve Şekil 2). Fareyi herhangi bir göre ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-CT görüntüleme son derece detaylı ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hayvan modellerinde vasküler patoloji sağlamak için kullanılabilir. İntravasküler kontrast-artırılmış medya aracılığıyla, bir kan damarı lümen gibi sigara gelişmiş yumuşak doku artırılması insanlardan farklı. Lazer Doppler, microangiography, manyetik rezonans anjiyografi, sırasında Histoloji confocal veya iki fotonlu mikroskobu ile vasküler yatak değerlendirmek için kullanılan, onlar genellikle çalışma sınırlı bir alan üzerinde odaklanmak ve/veya iki b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mark Smith radyografik görüntüleme ile yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kardiyovasküler hastalığı (BOA), Amerikan Kalp Derneği (SMC) ve NIH R35 Grant (DKS) disiplinlerarası araştırma NIH T32 Grant tarafından desteklenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrofilFlow Tech, IncMV-122Sarı kullanıyoruz, istenildiği gibi farklı bir renk sipariş edilebilir. Kit, MV-Bileşik, MV-Seyreltici ve MV-Kürleme Maddesi içerir.
Heparin (1000 U/mL)Sagent Pharmaceuticals25021-400-10
Fosfat tamponlu salinCorning21-031-CV
IsofluranVet One, MWI502017
3-Aminopropionitril fumarat tuzuSigma-AldrichA3134
Tek şırınga pompasıFisher Scientific14-831-200
27 gauge kafa derisi damar seti iğneExel Int2670927G x 3/4 ", 12" tüp
Inveon Mikro-CT tarayıcıSiemens Medikal Çözümler
Osirix MDPimxmeo SARLSürüm 8.0.2
Inveon Araştırma İşyeriSiemens Medikal ÇözümlerSürüm 4.2
Kemirgen ChowHarlan Teklad2018sx

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meszaros, I., et al. Epidemiology and clinicopathology of aortic dissection. CHEST. 117 (5), 1271-1278 (2000).
  2. Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1-116 (2011).
  3. Li, J. S., Li, H. Y., Wang, L., Zhang, L., Jing, Z. P. Comparison of beta-aminopropionitrile-induced aortic dissection model in rats by different administration and dosage. Vascular. 21 (5), 287-292 (2013).
  4. Huffman, M. D., Curci, J. A., Moore, G., Kerns, D. B., Starcher, B. C., Thompson, R. W. Functional importance of connective tissue repair during the development of experimental abdominal aortic aneurysms. Surgery. 128 (3), 429-438 (2000).
  5. Wu, D., Shen, Y. H., Russel, L., Coselii, J. S., LeMaire, S. A. Molecular mechanisms of thoracic aortic dissection. Journal of Surgical Research. 184 (2), 907-924 (2013).
  6. Bruel, A., Ortoft, G., Oxlund, H. Inhibition of cross-links in collagen is associated with reduced stiffness of the aorta in young rats. Atherosclerosis. 140 (1), 135-145 (1998).
  7. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl oxidase induces vascular oxidative stress and contributes to arterial stiffness and abnormal elastin structure in hypertension: Role of p38MAPK. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (7), 379-397 (2017).
  8. Kumar, D., Trent, M. B., Boor, P. J. Allylamine and beta-aminopropionitrile induced aortic medial necrosis: Mechanisms of synergism. Toxicology. 125 (2-3), 107-115 (1998).
  9. Ren, W., et al. β-Aminopropionitrile monofumarate induces thoracic aortic dissection in C57BL/6 mice. Scientific Reports. 6, 28149(2016).
  10. Kanematsu, Y., et al. Pharmacologically-induced thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice. Hypertension. 55 (5), 1267-1274 (2010).
  11. Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Jr Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J Vis Exp. (60), e3740(2012).
  12. Cortell, S. Silicone rubber for renal tubular injection. Journal of Applied Physics. 26 (1), 158-159 (1969).
  13. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1267-R1279 (2002).
  14. Marxen, M., et al. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Medical Physics. 31 (2), 305-313 (2004).
  15. Yang, J., Yu, L. X., Rennie, M. Y., Sled, J. G., Henkelman, R. M. Comparative structural and hemodynamic analysis of vascular trees. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (4), H1249-H1259 (2010).
  16. Jia, L. X., et al. Mechanical stretch-induced endoplasmic reticulum stress, apoptosis, and inflammation contribute to thoracic aortic aneurysm and dissection. The Journal of Pathology. 236 (3), 373-383 (2015).
  17. Kurihara, T., et al. Neutrophil-derived matrix metalloproteinase 9 triggers acute aortic dissection. Circulation. 126 (25), 3070-3080 (2012).
  18. Dillavou, E. D., Buck, D. G., Muluk, S. C., Makaroun, M. S. Two-dimensional versus three-dimensional CT scan for aortic measurement. Journal of Endovascular Therapy. 10 (3), 531-538 (2003).
  19. Muratoglu, S. C., et al. LRP1 protects the vasculature by regulating levels of connective tissue growth factor and HtrA1. Arterioclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33, 2137-2146 (2013).
  20. Badea, C. T., Dragova, M., Holdsworth, D. W., Johnson, G. A. In vivo small animal imaging using micro-CT and digital subtraction angiography. Phys Med Biol. 53 (19), R319-R350 (2008).
  21. Zhou, Y. Q., et al. Ultrasound-guided left-ventricular catheterization: A novel method of whole mouse perfusion for microimaging. Laboratory Investigation. 84, 385-389 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro CT AnalysisAortic AneurysmMouse ModelVascular CastingLead based ContrastImage QuantificationAortic DissectionBAPN TreatmentPerfusion ProtocolCT Scanning

Related Articles