Yöntem makalesi

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

5.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 Mart 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

Bu makalede

Özet

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Özet

İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri rejeneratif tıp ve insan gelişim süreçlerini incelemek için bir platform için umut verici bir hücre kaynağı vardır. Stepwise gelişimsel süreçleri beyannamedir farklılaşma pankreas hücreleri pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ de dahil olmak üzere oluşturmak için en önemli yollarından biri yönlendirilir (PDX1+) pankreas progenitör hücre. Geleneksel iletişim kuralları ile küçük koloniler farklılaşma geçişini kısa bir süre sonra Başlat. Ancak, koloniler veya toplamları, hücre farklılaşması için PDX1 engel heterogeneities eğilimli durumdadır+ hücreleri. Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri. Protokol dört adımlardan oluşur ve farklılaşma tohumlama Disosiye tek hücreleri tarafından başlatır. SOX17 indüksiyon+ kesin endoderm hücreleri PDX1 iki ilkel gut tüp işaretleri, HNF1β ve HNF4α ve nihai farklılaşma ifade tarafından takip edildi+ hücreleri. Mevcut Protokolü kolay kullanım sağlar ve geliştirmek ve verimsiz endodermal soy veya PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları farklılaşma verimliliğini stabilize+ hücreleri.

Giriş

Pankreas esas ekzokrin ve endokrin hücreleri oluşur ve onun disfonksiyon ya da aşırı pankreatit, diyabet ve pankreas kanseri gibi birçok hastalıklara neden olur. Pancreatopathy pathogeny aydınlatmak için pankreas hücrelerinin işlevini ve gelişim sürecinin analiz etmek gereklidir. Buna ek olarak, istikrarlı hücre kaynağı sağlam kalite ile hücre/doku takviyesi terapi kurmak için gereklidir. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri bu amaçlar için umut verici bir hücre kaynak vardır ve farklılaşma Protokolü pankreas hücreleri doğru çalışılmış1,2,3, oldu 4. Pankreas β hücrelerinin tüp üretimi son gelişmeler yetişkin insan ve bu hücreleri Haritayı terapötik etkinlik implantasyon diyabetik modeli fareler2,3içine üzerine β hücrelerinin üretimi taklit. Buna ek olarak, çözümleme İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) sağlıklı ve tip 1 diyabet hasta bağış üretilen β hücrelerinin stres5ne zaman altında dahil olmak üzere hiçbir işlevsel farklılıklar ortaya. Ayrıca, hastalık fenotipleri kısmen hasta elde iPSCs veya hasta6,7aynı sitedeki Genetik mutasyonlar yataklık hPSCs ile indüklenen pankreas hücrelerinde yeniden.

HPSCs pankreas hücreleri üretmek için gelişimsel süreçleri beyannamedir kademeli yönlendirilmiş farklılaşma kullanılır. Pankreas bölgesi Y-box 17 (SOX17) belirleme seks ifade erken embriyonun endoderm katmandan türetilir ve forkhead kutusu A2 (FOXA2)8. Tabanlı üzerinde fare çalışmaları, Hepatosit nükleer faktör 1-beta (Hnf1β) ve Hepatosit nükleer faktör 4-alfa (Hnf4α) ifade tarafından işaretlenir ilkel gut tüp endodermal katman oluşturur. İlkel gut tüp hisli ve solunum aygıtı, sindirim sistemi ve organları gelişir. Uzama sonra meşru pankreas bölge posterior foregut bölge oluyor 1 (PDX1)8,9,10transkripsiyon faktörü pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein ifade tarafından işaretlenmiş gibi. PDX1 dorsal ve ventral bölümlerini+ gut tüp kalınlaşmasına 1 (NKX6.1)8,11pankreas transkripsiyon faktörü 1 alt birim alfa (PTF1A) ve NK6 homeobox ortak ifade tarafından işaretlenen formu pankreas tomurcukları için. Bu ifade pankreas organogenesis morfolojik başlangıcı işaretler. Bileşenleri pankreas tomurcukları olan pankreas endoderm hücreleri epitelyal yapıları12 dallı bir borulu ağı ve sonunda insülin salgılayan β-hücreleri de dahil olmak üzere ekzokrin ve endokrin hücrelere ayırt etmek ve glukagon salgılayan α-hücreleri. PDX1 ifade ilk, o zaman tüm pankreas geliştirme görülmektedir ve yerelleştirme β ve δ hücreleri9,13,14gösterir meşru pankreas bölge tespit edilmiştir. Her ne kadar Pdx1+ Ptf1a veya Nkx6.1 ifade değil hücre alan ayırır Gastrik test, oniki parmak bağırsağı, extrahepatic safra kanalını ve bazı bağırsak hücreleri geç aşamada fareler9, PDX1 geliştirme ortasında içine+ hücrelerin CSF'den pankreas insanlarda erken gelişimsel aşamada kabul edilir.

Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri pankreas soy nesil için. Tohum tarafından Protokolü başlatır farklılaşma tek hücreler15,16,17ayrışmış. Genel olarak, farklılaşmamış hPSCs koloniler veya hücre toplamları süspansiyon veya yapışma olarak korunur. Sonuç olarak, kısa bir süre sonra passaging farklılaşma çoğu protokolleri başlatın. Koloniler veya toplamları durumda, hücre hangi engel kayma ve transkripsiyon heterogeneities18,19,20,21,22' ye, ancak, yatkındır kesin endoderm doğru ilk farklılaşma adım takip verimsiz farklılaşma tarafından PDX1 için+ hücreleri. Mevcut Protokolü geliştirmek ve farklılaşma verimlilik için kolay kullanım sunabilir verimsiz endodermal soy ve PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları23, + hücreleri 24 , 25.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

HPSCs kullanarak deneyler tıp bölümü ve lisansüstü tıp Fak., Kyoto Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. malzeme hazırlanması

Not: Tüm medya ve reaktifler hücre kültüründe steril bir ortam hazırlamak. Temel kültür ortamına oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce ısınmak. Orta farklılaşma reaktifleri ayrıntılarını RT. 6 h içinde kullanılan Malzemeler tabloiçinde listelenir.

  1. Farklılaşma (şekil 1A)
    1. Sahne 1A orta: Transfer RPMI 1640 orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, aktivin A, CHIR99021 ve Y-27632 1 x, 100 ng/mL, 3 mikron ve 10 mikron, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
    2. Sahne 1B orta: Transfer RPMI 1640 orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, aktivin A ve CHIR99021 1 x, 100 ng/mL, ≤1 mikron, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
      Not: CHIR99021 konsantrasyonu sahne 1A ortamı, daha düşük olması gerekir ve ayrıca gerekli değildir ancak cep numarasını artırır.
    3. 2. aşama orta: Transfer geliştirilmiş MEM (iMEM) orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek ve keratinosit büyüme faktörü (KGF) 0.5 x ve 50 ng/mL, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
    4. 3. aşama orta: Transfer iMEM orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, KGF, kafa, 3-Keto-N-aminoethyl-N'Ekle - aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) ve pipet için tarafından 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic asit (TTNPB) 0,5 konsantrasyonlarda x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 mikron ve 10 nM, anılan sıraya göre.
  2. Akış Sitometresi (FCM)
    1. 1 x Permeabilization/yıkama arabellek: Transfer su bir tüp tarafından bir pipet. Permeabilization/yıkama arabellek bir pipet tarafından 1 x konsantrasyon için ekleyin.
    2. FCM çözüm engelleme: 1 x Permeabilization/yıkama arabellek bir tüpün içine bir pipet tarafından Transfer. Eşek serum bir pipet tarafından %2 (vol/vol) bir konsantrasyon için ekleyin.
  3. Immunostaining
    1. Çözüm engelleme: Transfer Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) içine bir tüp tarafından bir pipet. Eşek serum ve Triton X pipet tarafından % 5 (vol/vol) ve %0,4 (vol/vol), konsantrasyonları sırasıyla ekleyin.

2. hPSC Posterior Foregut hücreler/pankreas ataları için farklılaşma (PDX1+ hücreleri)

Not: Steril teknikleri kullanarak tüm prosedürlerini yürütecektir. hPSCs tarafından hPSC bakım orta üreticinin yönergeleri17,26göre ile hPSCs için sentetik yüzey malzeme kaplı 6-şey plakaları sürdürülür. Hücreleri ulaştığınızda 50-%80 confluency (sahne 0) onları farklılaşma için kullanın.

  1. Membran matris kaplı plakalar hazırlayın.
    1. Transfer RPMI 1640 (4 °C) bir tüp içine 6 mL soğutmalı 4 °C buz üzerinde. 2 mg (4 °C) membran matrisinin soğutmalı 1 mL-pipet ipuçları ve de nazik 0,33 mg/mL membran matris yapmak pipetting tarafından karıştırın.
    2. Havalesiyle seyreltilmiş membran Matrix 2 mL 6-şey hücre kültür plakaların her şey için bir pipet. Plakayı yerleştirmek 37 °C 60-90 dk bir kuluçka için. Daha sonra tabakları RT (3 h içinde) kullanmak kadar devam et.
  2. HPSCs tohum ve farklılaşma için kesin endoderm (sahne 1A) başlatın.
    1. Kullanılan orta Aspire edin ve 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (RT) 2 mL 6-şey levhalar yaylıdır kültürlü hPSCs yıkamak için pipet tarafından iyi ekleyin.
    2. 0,5 mM EDTA Aspire edin ve pipet ile 0,5 mM EDTA iyi başına 2 mL ekleyin. Plakayı 37 °C 5 min için kuluçkaya.
    3. 0,5 mM EDTA Aspire edin ve hPSC bakım orta 1 mL 10 mikron ile desteklenmiş RT eklemek de pipet tarafından başına Y-27632. Yavaşça pipet ama hızlı bir şekilde ekmeye hücreleri plakaları ve olmalı hücreleri tek hücre içine ayırmak için bağlı. Hücre süspansiyon pipetting sırasında kabarcık yok.
    4. 50 mL santrifüj tüpü 10 mikron ile desteklenmiş RT hPSC bakım orta 4 mL içeren hücre süspansiyon transfer Y-27632. Yavaşça hücre süspansiyon pipette.
    5. Trypan mavi leke dışlama yordamı kullanarak hücre süspansiyon hücre saymak.
      1. Mix 15 μL hücre süspansiyon ve Trypan mavi 15 μL bir tüp.
      2. Tarafından 10 μL pipet Çoğalt slaytları sayma hücre üzerine Trypan mavi ile seyreltilmiş hücre süspansiyon 10 μL aktarın.
      3. Hücre bir otomatik hücre sayacı ile sayı saymak ve hücre süspansiyon hücre dansitesi hesaplayın. Canlılık olduğunu genellikle > % 98.
    6. Aliquot 50 mL santrifüj tüpü 1-1,5 x 6-şey tabak (105 hücreleri/cm2x 1-1.5) kuyu başına 106 hücre hücre süspansiyon.
    7. 50 mL tüp, 200 x g de RT için 5 dk santrifüj kapasitesi.
    8. Bir pipet kullanarak süpernatant Aspire edin ve 1 mL sahne 1A orta (RT) içeren hücreleri de resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette ve sahne 1A orta (Toplam, iyi 2 mL) başka bir 1 mL ekleyin.
    9. 2.1.2. adımda bir 1000 μL pipet tarafından hazırlanan hücre kültür plakaların Wells seyreltilmiş membran matris Aspire edin. Hemen bir sonraki adıma geçin.
    10. Yavaşça tekrar adım 2.2.8 hücre süspansiyon pipette. Hemen karıştırma sonra hücre süspansiyon (2 mL) 6-şey plaka her kuyunun içine aktarın. Plaka ışıktan korumak için alüminyum folyo ile plaka kapak. 10-15 dk için RT, tezgah temiz tabak yerleştirin.
      Not: Plaka tohum sonra hareket ettirmeyin.
    11. Yavaşça plaka bir 37 °C, % 5 CO2 kuluçka (oksijen atmosfer) ve 24 saat için kültür içine yerleştirin.
      Not: Plaka tohum sonra sallama.
  3. Farklılaşma kesin endoderm (sahne 1B) içine neden.
    1. Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL wells için pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
      Not: Herhangi bir ölü hücreleri monolayer kaldırmak için hafifçe her aspirasyon önce plaka sallayın.
    2. Bir pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve sahne 1B orta (37 °C) iyi başına 4 mL ekleyin. Yavaşça plaka 37 °C İnkübatör (oksijen atmosferini %5 CO2) ve 48 h için kültür içine yerleştirin.
    3. Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
      Not: Ölü hücreleri nazik her aspirasyon önce sallayarak monolayer kaldırın.
    4. Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve sahne 1B orta (37 °C) iyi başına 4 mL ekleyin. Yavaşça plaka İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve 24 saat için kültür içine yerleştirin.
  4. Farklılaşma (Aşama 2) ilkel gut tüp içine neden.
    1. Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin.
      Not: ölü hücreleri nazik her aspirasyon önce sallayarak monolayer kaldırın.
    2. Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve Stage 2 Orta iyi (37 °C) 4 mL ekleyin. Plaka 4 gündür İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve kültür yerleştirin.
  5. PDX1 içine farklılaşma neden+ hücreleri (Stage 3).
    1. Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
    2. Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve Stage 3 orta iyi (37 °C) 4 mL ekleyin. Plaka 3 gün boyunca İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve kültür yerleştirin.
  6. Pankreatik endokrin hücrelere farklılaşma neden.
    1. Endokrin hücre indüksiyon (12 gün sahne 5) ardından NKX6.1+ hücre indüksiyon (8 gün için Stage 4) yukarıda açıklanan protokoller3,16,26ile gerçekleştirin. Karakterize ve endokrin hücre farklılaşması immunostaining ve nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi doğrulayın.
      Not: Toyoda ve ark.16 ve Kimura vd.26 ayrıntılı deneysel yordamlar için başvurun. Tablo 1 qRT-PCR çözümlemesi için kullanılan astar serileri için başvurun.

3. Akış Sitometresi (FCM)

  1. Kullanılan orta Aspire edin ve 2 mL 0.5 mM EDTA kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve 0,5 mM EDTA eklenmesi bir kez yineleyin.
    Not: Yavaşça her aspirasyon önce monolayer hücrelerden herhangi bir ölü hücreleri kaldırmak için plaka sallamak.
  2. Hücreleri (yaklaşık 3-6 × 106 hücre başına iyi) ayırmak için 2 mL % 0.25 ekleyin şey başına 0,5 mM EDTA içeren tripsin. Plakayı 37 °C 5-10dk için kuluçkaya.
  3. Yavaşça olmalı hücreleri tek hücre içine hızlı bir şekilde ayırmak için ama pipet. Hücre süspansiyon pipetting sırasında kabarcık yok.
  4. Temel Orta (RPMI 1640 veya iMEM, RT) 8-10 mL ekleyin 0.5 x ek serum-Alerjik ve 10 mikron içeren Y-27632 başına iyi ve hücre süspansiyon karıştırın. Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. Santrifüj tüpü 300 x g de RT 5 min için kapasitesi.
  6. Süpernatant Aspire edin ve 2 mL 0.5 mm EDTA (RT) içeren hücreleri resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette.
  7. Santrifüj tüpü 300 x g de RT 5 min için kapasitesi.
  8. Süpernatant Aspire edin ve bir başlık altında 106 hücre başına 100 μL fiksasyon ve permeabilization arabelleği hücrelerle resuspend. Yavaşça bir başlık altında hücre süspansiyon pipette. Tüp RT için 30 dakika tutun.
  9. Tüp, 400 x g de RT 5 min için santrifüj kapasitesi.
  10. Bir başlık altında süpernatant Aspire edin ve 500 μL FCM engelleme çözüm hücrelerle başına 106 hücre resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette. Tüp RT için 30 dakika tutun.
  11. Hücre süspansiyon 50 μL bir tüp (yaklaşık 1 x 105 hücreleri) aktarın. 400 x g de RT 5 dk. Kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve seyreltilmiş birincil antikor 100 μL hücrelerle resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) FCM içinde çözüm engelleme ve kuluçkaya 4 °C için > 16 h.
  12. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve 1 perma/yıkama arabellek x 180 μL hücrelerle resuspend RT de 400 x g , tüp santrifüj kapasitesi.
  13. 400 x g de RT 5 dk. Kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve seyreltilmiş ikincil antikor 100 μL hücrelerle resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm engelleme FCM içinde. Hücreleri 60 dk için RT veya 4 °C için kuluçkaya > Işık koruma ile 16 h.
  14. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve 1 perma/yıkama arabellek x 180 μL hücrelerle resuspend RT de 400 x g , tüp santrifüj kapasitesi.
  15. 5 dk. Kaldır RT de 400 x g , tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve % 2 eşek serum DPBS içinde 180 μL hücrelerle resuspend.
  16. Hücre süspansiyon 5 mL yuvarlak alt polistren tüp üzerinde tutun 4 °C koruma ile bir hücre süzgeç (35 µm naylon mesh) ile gelen ışık kadar analiz aktararak filtre.
  17. Olumlu lekeli hücrelerin bir kısmı tarafından bir Akış Sitometresi27analiz.

4. Immunostaining

  1. Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
    Not: Yavaşça her aspirasyon önce monolayer hücrelerden herhangi bir ölü hücreleri kaldırmak için plaka sallamak.
  2. %4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL ekleyin (4 °C) bir başlık altında pipet kuyusunun başına. Plaka tutmak 4 °C 20 dk için.
  3. PFA pipet bir başlık altında çıkarın. DPBS 2 mL RT pipet bir başlık altında tarafından kuyuya ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
  4. İyi ücret engelleme çözüm 2 mL ekleyin ve plaka RT için 30 dk tutun.
  5. Kullanılan çözüm Aspire edin ve birincil antikor 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm iyi başına kapatmaktır. 60 dk için RT veya 4 °C için kuluçkaya > 16 h.
  6. Kullanılan çözüm Aspire edin, %0,4 içeren DPBS 2 mL ekleyin Triton X-100 ve RT 10 dk. tekrar aspirasyon, çözüm ve kuluçka bir kez eklenmesi için kuluçkaya.
  7. Kullanılan çözüm Aspire edin ve ikincil antikor 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm iyi başına kapatmaktır. RT ışık koruma ile 60 dk için kuluçkaya.
  8. Kullanılan çözüm Aspire edin, %0,4 içeren DPBS 2 mL ekleyin Triton X-100 (RT) ve ışık koruma 5 min için RT kuluçkaya. Aspirasyon, çözüm ve kuluçka ek iki kere tekrar edin.
  9. Farklılaşma verimliliği bir floresan mikroskop28altında incelemek için filmler al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yayılıyor hiPSCs (585A129,30) farklılaşma için uygun olan bir homojen monolayer (şekil 1B) form ve konsantre. Farklılaşmamış hiPSCs (sahne 0) ayrışmış ve düşük hücre yoğunluğu (105 hücreleri/cm2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PDX1 üretimi+ hücreleri oluşur birden çok adımı; Bu nedenle, uygun bir zamanda hücreleri tedavi için önemlidir. Adımları arasında kesin endoderm indüksiyon verimliliğini büyük ölçüde son indüksiyon verimliliği etkiler, muhtemelen çoğalırlar salgılar ve/veya diğer bulaşıcı lineage (yani, mesoderm ve hücrelerindeki ektoderm), girişim tarafından faktörler belirli farklılaşma bozabilir. Eğer SOX17 oranı+ hücreleri %80 düşük günde 4 (sahne 1B), PDX1 için verimli bir indüksiyon+ hücreleri tehli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser kısmen Japonya toplumdan için promosyon, bilim (JSP'ler) Scientific Research (C) (JSP'ler KAKENHI Grant Number15K09385 ve 18 K 08510) aracılığıyla T.T. ve Grant-in-Aid JSP'ler araştırma Fellows (JSP'ler KAKENHI Grant numarası için finansman tarafından desteklenen 17J07622) A.K. ve tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) kendi araştırma yoluyla Japonya ajansı "IP'leri hücre araştırma, Araştırma Merkezi ağ rejeneratif tıp gerçekleşmesi için çekirdek Merkezi" K.O. için vermek Yazarlar Dr Peter Karagiannis yazı okumak için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-Keto-N-aminoetil-N ve prim; -aminokaproildihidrosinnamoil siklopaminToronto Araştırma KimyasallarıK171000CYC
4 - [(E) -2- (5,6,7,8-Tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalinil) -1-propenil] -benzoik asitSanta Cruz BiyoteknolojiSC-203303TTNPB
50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific339652
Anti-CDX2 antikoru [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, & kez; 1/1000 seyreltme
B-27 Takviyesi (50 & kez;)Thermo Fisher Scientific17504-044Serumsuz takviye
BD FACSAria II Hücre SıralayıcıBD BiosciencesAkış sitometrisi
Biyomedikal dondurucuSANYOMDF-U538-30 & ° C için; C depolama
TC10 / TC20 için Hücre Sayma Slaytları, Çift OdacıklıBIO-RAD1450011Sayma slayt camı
HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇOK KUYULU PLAKA, 6 KUYULU, PS, ŞEFFAFGreiner bio-one657165Farklılaşma kültürü için / 6 oyuklu plaka
Hücrekültürü içinTOMYAX-310
RT-qPCR içinSantrifüjTOMYMX-305
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
TEMİZ TEZGAHSHOWA KAGAKU S-1601PRVTemiz tezgah
Corning CellBIND 6 oyuklu plakaCorning3335hPSC'lerin/6 oyuklu plakanın besleyicisiz kültürü için
Corning Matrigel Bodrum Membran Matrisi Büyüme Faktörü AzaltılmışCorning354230Bodrum membran matrisi
Corning Synthemax II-SC YüzeyCorning3535hPSC'lerin besleyici içermeyen kültürü için / hPSC'ler için sentetik yüzey malzemesi
KriyostatLeicaLeica CM1510 SAgregaların immün boyaması için.
Cytofix/Cytoperm KitiBecton Dickinson554714Perma/Yıkama tamponu  Geçirgenlik/Yıkama tamponu. Cytofix/Cytoperm tamponu, fiksasyon ve geçirgenlik tamponudur.
Dako kalemDakoS2002Agregaların immün boyaması için
dNTP karışımı (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088RT-qPCR için
Eşek anti-Keçi IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055İkincil antikor ve kez; 1/500 seyreltme
Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036İkincil antikor ve kez; 1/500 seyreltme
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040İkincil antikor ve kez; 1/500 seyreltme
Eşek SerumuMerck MilliporeS30Eşek serumu
D-PBS(-) Ca veya MgNacalai tesqueolmadan14249-95DPBS
Essential 8 Orta ThermoFisher ScientificA1517001hPSC'ler/hPSC bakım ortamının besleyicisiz kültürü için
Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Geçmeli KapaklıCorning3522355 mL hücre süzgeçli yuvarlak tabanlı polistiren tüp
Filtre Ucu, 1.000 & LWatoson124-1000SPipetlerle birlikte kullanın
Filtre Ucu, 20 & LWatoson124-P20SPipetlerle birlikte kullanın
Filtre Ucu, 200 & LWatoson124-P200SPipetlerle birlikte kullanın
Floresan MikroskobuKeyenceBZ-X700İmmün boyamayı için
Forma Steri-Cycle CO<>sub2< / sub> inkübatörüThermo Fisher Scientific370Aİnkübatör
HNF-1 ve beta; Antikor (C-20)Santa Cruz Biyoteknolojisc-7411Anti-HNF1 ve beta;, & kez; 1/200 seyreltme
HNF-4 & alfa; Antikor (H-171)Santa Cruz Biyoteknolojisc-8987Anti-HNF4&alfa;, & kez; 1/200 seyreltme
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Çekirdek boyama ve süreler için; 1/200 seyreltme
İnsan PankreasıRT-qPCR içinAmbion AM7954
İnsan PDX-1/IPF1 AntikoruR& D SistemleriAF2419Anti-PDX1, keçi IgG ve kez; 1/200 seyreltme
İnsan SOX17 AntikoruR& D SystemsAF1924Anti-SOX17, & kez; 1/200 seyreltme
Geliştirilmiş MEM Çinko Seçenek ortamıThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Kuluçka odasıCosmo Bio10DOAgregaların immün boyalanması için
Lateks Muayene EldivenleriAdachi
MAS kaplı sürgülü camMatsunami Cam83-1881İçin Agregaların İmmün Boyanması
MicroAmp Fast 96 kuyulu Reaksiyon PlakasıRT-qPCRUygulamalı Biyosistemler/Thermo Fisher Bilimsel4346907
OlympusCKX41N-31PHPHücre kültürü için
MicrotubeWatoson131-515CS
Monoklonal Anti-&alfa;-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, & zamanlar; 1/200 seyreltme
RT-qPCRNanodrop 8000Thermo Fisher Scientific
Özel yapım Oligo RT-qPCR dizisi için "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" şeklindedir.
Paraformaldehit, tozNacalai tesque26126-54PFA, fiksatif, DPBS
İlaç buzdolabındaSANYOMPR-5144 & derece; C saklama
P GILSONPipet
Rekombinant İnsan KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Rekombinant İnsan NogginPeproTech120-10CNOGGIN
Rekombinant İnsan/Fare/Sıçan Aktivin A R& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101RT-qPCR
RNaz içermeyen DNase Seti için (50)QIAGEN79254RT-qPCR
RNeasy Mini Kitiçin QIAGEN74104RT-qPCR için
RPMI 1640 L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Gerçek Zamanlı Sızdırmazlık FilmiTakaraNJ500RT-qPCR
için Serolojik pipetler 10 mLCostar/Corning4488Hücre kültürü için
Serolojik pipetler 25 mLCostar/Corning4489Hücre kültürü için
Serolojik pipetler 5 mLCostar/Corning4487Hücre kültürü için
Sox2 (D6D9) XP Tavşan mAbHücre sinyalizasyonu3579SAnti-SOX2 ve zamanlar; 1/200 seyreltme
StepOnePlusUygulamalı Biyosistemler/Thermo Fisher RT-qPCR için
SükrozNacalai tesque30406-25Agregaların immün boyanması için
TB Green
Premix Ex Taq II 		RT-qPCRTakaraRR820B
BIO-RAD1450101J1Otomatik hücre sayacı
Tissue-Tek OCT bileşiği 4583 Sakura Finetechnical4583Agregaların immün boyaması için
Tissue-Tek Cryomold Kalıpları/AdaptörleriSakura Finetechnical4566Agregaların immün boyaması için
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Tripan MavisiBIO-RAD1450021
Ultra soğuk dondurucuSANYOMDF-U33V-80 derece için; C depolama
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-038için 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificiçin
içinSantrifüj : Toplam RNA Mikroskobu için Oligo dT FASMAC için seyreltilmiş Bilimsel TC20 Otomatik Hücre Sayacı için RT-qPCR Y-27632 Wako 251-00514 hazırlamak DPBS ile seyreltin

Kaynaklar

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PDX1 Pozitif H crelerhPSC DiferansiyasyonuDefinitif EndodermStromal Vask ler FraksiyonAk SitometrisiWestern BlotKonfokal MikroskopiH cre zolasyonuDoku SindirimiProgenit r H creler

İlgili makaleler