Method Article

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

DOI:

10.3791/57651

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vivo, harekete geçirmek, yayılması ve bağışıklık hücreleri tüm fonksiyonu bir ortamında üç boyutlu (3D), örneğin lenf düğümleri veya doku oluşur. Tarihe kadar iki boyutlu (2D) yüzeyler, hücre kültürü plakaları veya coverslips gibi çoğu vitro sistemde güveniyor. En iyi şekilde kopyalama fizyolojik şartlarda vitroiçin biz basit 3D kollajen matris kullanmaktadır. Kollajen hücre dışı matriks (ECM) ana bileşenlerini ve yaygın olarak 3B matrisleri oluşturmak için kullanılan. 3D görüntüleme için (tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji yüksek satın alma hızı, büyük penetrasyon derinliği, düşük beyazlatma ve photocytotoxicity bulunmamaktadır. Ayrıca, ışık sayfalık mikroskobu özellikle uzun vadeli ölçüm için avantajlıdır. Burada nasıl ayarlamak ve insan bağışıklık hücreleri, Örneğin birincil insan sitotoksik T lenfositler (CTL) işlemek en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar ve doğal öldürücü (NK) hücreleri canlı hücre görüntüleme için ışık sayfalık mikroskobu ile kullanım için 3D kollajen matris ve sabit örnekleri. Resim alma ve çözümleme hücre göç prosedürü sunulmaktadır. Belirli bir odak kritik adımlar ve numune hazırlama ve veri analizi için etkenler vurgulamak için verilir. Bu iletişim kuralı bir 3D kollajen Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam ve bağışıklık hücreleri için sınırlı değildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçiş hakkında birçok bilgi hücreleri gelir üzerinden 2D deneyleri1,2,3, hangi normal bir cam veya plastik yüzey bir kültür/görüntüleme yapılmaktadır çanak. Ancak, fizyolojik bir senaryo, çoğu durumda, hücre dışı matriks (ECM) belirleyici bir rol oynayan bir 3D microenvironment gerektirir. ECM sadece uygun hücre morfolojisi korumak için 3D yapısı temel sağlar ama aynı zamanda yaşam sinyalleri veya bir en uygun birçok hücre4,5 / işlemesi için yön ipuçları sunmaktadır. Bu nedenle, bir 3D çevre hücresel işlevler ve davra....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada insan malzeme (lökosit azaltma sistem odaları insan kan bağış) ile yürütülen araştırma Yerel Etik Komitesi (bildirim 16.4.2015 (84/15; dan tarafından yetki Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) ve karşılık gelen kuralları izler.

1. hazırlanması etkisiz kollajen çözüm (500 µL)

  1. Soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm (10.4 mg/mL) 400 µL hücre kültür başlık altında bir steril 1,5 mL tüp aktarın. Yavaş yavaş, 50 µL 10 x (pH 7,0-7,3) PBS'ye soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm 400 µL soğutulmuş ekleyin. Çözüm yavaşça tüp fayans tarafından karıştırın.
    Not: Bölüm 1 tüm adımları bir hücre kültür başlık altında yapılmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkıntı oluşumu T hücre göç sırasında aktin bağımlı olan son derece dinamik bir süreçtir. Birincil insan CTL oluşumu çıkıntı görselleştirmek için geçici11' den önce açıklandığı gibi CTL aktin sitoiskeleti etiketlemek için erimiş mEGFP protein transfected. Bir gün transfection sonra hücreleri kollajen matris içinde gömülü. Görüntü yığınları alınan her 40 s ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak 37 ° C'de 1 µm boyutunda adım. Şekil 2A ve .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vivo hücreleri, özellikle bağışıklık hücreleri, çoğunlukla bir 3D microenvironment deneyim, ancak çoğu vitro deneyleri bir 2D yüzeyi, hücre kültürü kaplamalar, Petri yemekler veya coverslips, örneğin devam etmektedir. Kanıt ortaya çıkan geçiş desen bağışıklık hücrelerinin 2D ve 3D senaryoları17arasında farklılık gösterir. Ayrıca, tümör hücrelerinin ifade profilleri de 2D ve 3D kültürlü doku18,19,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir mali veya ticari çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz klinik Hemostaseology Enstitüsü ve kan nakli tıp donör kan sağlamak için teşekkür ederiz; Carmen Hässig ve Cora hoca mükemmel teknik yardım için. Biz için değiştirilmiş değerleri vektör Jens Rettig (Saarland Üniversitesi), Roland Wedlich-Söldner (Münster Üniversitesi) orijinal LifeAct-yakut inşa etmek için ve Christian Junker (Saarland Üniversitesi) LifeAct-mEGFP yapı oluşturmak için teşekkür ederiz. Bu proje Sonderforschungsbereich 1027 (proje A2 BQ) ve 894 (projeye A1 M.H.) tarafından finanse edildi. Işık sayfalık mikroskop DFG tarafından finanse edildi (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, sığır kollajen çözeltisiGelişmiş Biomatrix #5133-20MLKollajen matrisi
0.5 M NaOH ÇözeltisiFibricol çözeltisini nötralize etmek içinMerck1091381000
Ultra-Düşük erime noktalı agarozAffymetrix32821-10GMDüşük c [Col] Dynabeads'de numune hazırlama
El değmemiş İnsan CD8 T Hücreleri KitiThermo Fisher11348DPBMC Dynabeads İnsan T-Aktivatöründen Birincil İnsan CD8 + < / sup> T hücrelerinin izolasyonu
T Hücresi Genişlemesi ve Aktivasyonu için İnsan T-Aktivatörü CD3 / CD28Thermo Fisher11132DCTL popülasyonlarının aktivasyonu
İnsan rekombinant interlökin-2Thermo FisherPHC0023Kültürlenmiş CTL
P3 Birincil çözüm kitininLonzaV4XP-30XXTransfeksiyon
α-PFN1 antikoru, tavşan, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Turuncu Plazma zarı LekeThermo FisherC10045Floresan hücre etiketi
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinThermo Fisher14190250
IF Sığır serum albüminiSigmaA9418-100GIF
Keçi ve alfa; Tavşan 568, IgG, tavşanThermo FisherA-11011IF
Işık Tabakası Z.1 (Işık tabakası mikroskobu)ZeissN.A.
Hücre kültürü başlığıThermo FisherHeraSafe KS
Hücre kültürü inkübatörü HERACell 150i Termo BalıkçıN.A.
Santrifüj 5418 ve 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette ipuçlarıVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tüplerSarstedt  62.554.002
Kılcal damarlar 50 & LVWR (Marka)613-3373Zeiss LSFM numune hazırlama
Kılcal damarlar için pistonVWR (Marka)BRND701934"Teflon uçlu pullar" LSFM numune hazırlama
MColorPhast pH uçlarıMerck,nötralize Fibricol
BD Plastipak 1 mL şırıngaların1095430001 Z230723  ALDRICH, Alternatif numune hazırlama
, Kil modelleme (Hasbro, Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris dosya dönüştürücüBitplanehttp://www.bitplane.com  adresinde bulunabilir.Görüntüleme dosyalarını Imaris dosya formatına dönüştürün
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplanehttp://www.bitplane.com  adresinde bulunabilir.3D ve 4D görüntüleme verilerinin analizi
uyarılması , pH'ını test etmek için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light sheet Microscopy3D Collagen MatrixHuman Immune CellsCell Migration TrackingSample PreparationImage AcquisitionLive Cell ImagingFixed Sample AnalysisCytotoxic T LymphocytesNatural Killer Cells

Related Articles