Yöntem makalesi

Yalıtım Borneo dan çene kemiğinde bezi rezervuar İçindekiler ' GC-MS ve MetaboliteDetector göre Volatilome analiz için karıncalar (karınca) patlayan

DOI:

10.3791/57652

⸱

26 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük işçi karınca türlerin Colobopsis explodens kendi çene kemiğinde bezi hipertrofik rezervuarlar sonraki solvent ekstraksiyon ve çözümleme gaz kromatografi-kütle spektrometresi tarafından depolanan balmumu benzeri içerik yalıtmak için kesmiştim. Ek açıklama ve kimlik uçucu bileşenlerin açık kaynak yazılım MetaboliteDetector kullanarak da açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazının amacı Colobopsis cylindrica (COCY) grubuna ait Borneo patlayan karıncalar' metabolomic analiz açıklayan bir protokolü sunmaktır. Bu amaçla, modeli C. explodens familyasından el. Küçük alt kast ait karıncalar hipertrofik belirgin çene kemiğinde bezleri (MGs) sahip. Bölgesel mücadele, karakteristik intihar 'patlama' gönüllü rüptürü tarafından gastral deri (autothysis) içinde rakip eklembacaklılar öldürmek için onların genişlemiş çene kemiğinde bezi rezervuar (MGRs) viskoz içeriğini kullanıyorlar. Biz işçi karıncalar balmumu benzeri MGR içeriği yanı sıra çözücü-orada bulunan uçucu bileşikler ile sonraki gaz çıkarımı için gerekli adımları listeleyen gastral bölümünü yalıtım için bu türün diseksiyon göster kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) analizi ve metabolitleri hulâsa içinde bulunan sözde tanımlaması. Diseksiyon yordamı soğutmalı koşullar altında ve MGR içeriği kimyasal bileşimi değişiklikleri en aza indirmek için herhangi bir diseksiyon arabellek çözüm kullanımı olmadan gerçekleştirilir. Orada bulunan uçucu metabolitleri, solvent bazlı çıkarma sonra sıvı-enjeksiyon-GC-MS ile örnekleri analiz etmek için gerekli adımları sunulmaktadır. Son olarak, veri işleme ve açık kaynak yazılım kullanımı ile sözde metaboliti kimliği MetaboliteDetector gösterilir. Bu yaklaşım ile grup profil oluşturma ve MGRs için COCY ait karıncalar uçucu metabolitleri tanımlaması GC-MS ve mümkün hale MetaboliteDetector yazılımı ile.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel iş akışı burada sunulan salgıları böceklerin içinde kimyasal bileşim genel incelenmesi hedefidir. Bu salgı bir bütün olarak veya bunların tek bileşiklerin ekolojik rolleri elucidating birincil amacı ile yapılır. Ayrıca, biz ilgili salgıları bulunan bileşikler temel metabolik yollar soruşturma ilgilendi. Onlar kaynakları şimdiye kadar keşfedilmemiş potansiyel biyoaktif bileşikler (tutkallar, antimicrobials, vb)1, , çünkü özellikle bezi içindekiler--dan karıncalar (Hymenoptera, karınca) yükselen faiz son yıllarda kazanmıştır 2. küçük işçi karıncalar COCY grup3,4 ' e ait bazı türlerin gaster5,6' ağız genişletmek onların hypertrophied MGRs bulunan böyle bileşikler sağlayabilir. Sözde düşman tarafından tehdit edildiğinde, işçi C. explodens 7 küçük ve bazı türler-ebilmek yapmak ile ilgili onların MGR kullanımı alışılmadık bir şekilde lehine İçindekiler: onlar kendileri yapışkan içeriğini çıkarmak için gastral onların duvar rüptür tarafından kurban MGRs patlama üzerine rakip, bunun üzerine sözde düşman gözaltına ve bile ölmek5,6,8,9. Geliştirme amacı ve burada sunulan yöntemleri bu karınca salgılanmasını geçici olarak toksik bileşenlerinin niteliği ve kimyasal bileşimi anlayış geliştirmek yardımcı oldu.

Bu amaçla, biz bir protokol balmumu benzeri MGR içeriklerini sonraki solvent ekstraksiyon ve analizleri GC-MS tarafından gastral kısmını elde etmek için C. explodens işçi karıncalar diseksiyon için mevcut.

GC-MS Analizi profil oluşturma ve uçucu metabolitleri (volatilome) dan böcekler tanımlaması için köklü yöntemlerinden biridir. Tipik analitler karıncalar ilgi cuticular hidrokarbonlar10, semiochemicals11, içerir ve genel olarak, biyolojik aktivitesi12ile bileşikler. Bütün hayvanlar veya vücut parçaları ve böcek13,14diseksiyon ile izole sıvı örnekleri alınabilir. Örnek hazırlama teknikleri orada bulunan metabolitleri çıkarımı çözücüler14 veya headspace-katı-faz-microextraction (HS-SPME)15kullanımı ile içerir.

Metabolomic çalışmalar için örnekleri hızla kimyasal bileşimi ve bileşiklerin miktar değişiklikleri en aza indirmek için doğrudan örnekleme sonra dondu hayati önem taşımaktadır. Bu çalışmada kullanılan karıncalar hızlı donma yerinde Lahmacundan soğuk paketleri ile doldurulmuş bir serin çanta tarafından öldürüldü. Örnekleri sonra laboratuvar Kuru buz üzerinde taşınan önce elektrik jeneratör tahrik, kullanarak-20 ° C dondurucuda bekletildi. Burada sunulan diseksiyon yordamı bu farklı COCY türler16,17,18için önce yapılmıştır gibi bütün karınca ya da gaster bir bütün olarak analiz olmadan MGR içeriği izole etmek için imkanı sunuyor. Ayrıca, sunulan Protokolü ayrıca doğrudan erişim ve çevresindeki bezleri ve dokular, zehir bezinin (VG)5,8, Dufour'ın bezi (DG)8veya diğer biyolojik çalışmalar oluşturmak veya bağırsak gibi analiz sağlar işleme veya karıncalar diseksiyon sırasında tanıttı mümkün çapraz-contaminations kontrol edin. Çözülme örnekleri tarafından veya kimyasallar kullanarak MGR içeriği kimyasal bileşimi diseksiyon sırasında değişiklikleri en aza indirmek için diseksiyon süreci üzerinde soğuk paketi (-20 ° C), herhangi bir ek arabellekler kullanmanıza gerek kalmadan gerçekleştirilebilmesi için optimize edildi, çözümleri veya solvent yıkama. Bu yöntemle elde edilen nitel ve nicel sorulara cevap için uygun örneklerindendir.

Veri çözümleme amacıyla sözde metaboliti ek açıklama ve kimlik MetaboliteDetector19metabolomics GC-MS tabanlı veri otomatik olarak analiz için geliştirilmiştir, açık kaynak yazılım ile yapılmaktadır. Tek iyon doruklarına chromatograms içinde mevcut bir deconvolution adım gerçekleştirir ve analiz örnekleri bulunan kimyasal bileşiklerin deconvoluted kitle spectra ayıklar algılar. Sözde MetaboliteDetector bileşikler tanımlaması kararlı saklama dizin (RI; yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanıp Kovats RI olabilir) yanı sıra deconvoluted kitle spectra ürününün benzerlik temel alır. RI ve spektral maç faktörü (ortak NIST biçiminde olmaları durumunda bu, alınabilir) varolan her iki başvuru kitaplıklarında karşı veya e karşı kurulan bir şirket içinde Kütüphane kontrol çapraz olabilir. Bu önerilen, (sözde) bileşik tanımlanması için e.g., tarafından kimyasal analiz çalışma grubu (CAWG), Metabolomics standartları girişimi (MSI), kurallara uygun olarak en az iki bağımsız ve ortogonal verilerinin nerede otantik bir bileşik göre (burada tutma zaman (RT) /RI ve kütle spektrumu) altında analiz aynı deneysel koşullar gerektiği gibi sigara roman metaboliti tanımlamaları20onaylamak için önerilen.

Tam deney COCY modeli türler C. explodensMGR içeriğine ama diseksiyon adımları da karınca gaster mevcut bezleri yalıtmak için adapte edilebilir. Biz volatilome MGR içerik, ayıklama, açıklayan iş akışı daha genel bölümlerini kapsamlı analiz için bir iletişim kuralı mevcut iken Ayrıca, GC-MS ölçme ve veri değerlendirme de analiz için ve (sözde) kullanılabilir Genel olarak uçucu metabolitleri tanımlaması.

Bu el yazması açıklanan deneyler böcekler üzerinde yürütülen beri etik onay gereklidir. Saha çalışması, karıncalar gibi kullanımları yayın için örnekleme uygun olarak bu proje Universiti Brunei Sultanlığı, Brunei'nın araştırma ve yenilik Merkezi ve Brunei'nın Orman Bakanlığı, Brunei düzenleyen kurallar vardır Sultanlığı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. karıncalar topluluğu

  1. Küçük işçi karıncalar bir aspiratör (Şekil 1) kullanımı ile toplamak.
  2. Örnekleme, hemen sonra karıncalar-20 ° C'de hızlı donma sabitleyin ve bu veya daha düşük bir sıcaklığa kadar analiz depolayabilirsiniz.

2. izolasyon MGR içindekiler ve DG gelen karıncalar

  1. Karıncalar diseksiyon önce aşağıdaki hazırlık:
    1. Cam Petri kabına ve metanol-su karışımı (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) ve dokuları kullanarak diseksiyon aletleri temiz.
      Dikkat: MeOH insanlara toksiktir. Her zaman etkilenmekten uygun eldiven ve önlük ve duman başlık altında temizleme işlemi.
    2. Donma soğuk paketi ve cam Petri dish ile-20 ° c
    3. Silikon/politetrafloroetilin (PTFE) septa ile vidalı kapakları dahil olmak üzere 1.5 mL kısa iş parçacığı şişeleri kitlelerin belirlemek ve buz doğrudan yanında mikroskop üstünde tutun.
      Not: Seçtiğiniz örnek şişeyi bir seçime bağlıdır. Burada, MGR içeriği doğrudan camdan yapılmış soğutmalı 1,5 mL tüpler konur. Plastik hedef metabolitleri sinyalleri ile müdahale eserler yol açabilecek bileşikler (Örneğin, ftalatlar) içerebilir.
    4. Donmuş soğuk pack haddelenmiş polistren köpük yapılan bir kutuya koyun. Üstünde tepe-in belgili tanımlık soğuk bohça Petri kabına yerleştirin ve donmuş bir karınca çanak içine koymak. Stereo mikroskop altındaki mount. Tüm karınca açıkça görülebilir kadar büyütme (20-40 X) ve odağı ayarlayın.
  2. Donmuş karınca için onun gastral bölmeleri bütünlüğünü denetleyin. Diseksiyon için sadece karıncalar sağlam gaster bölgesi (Şekil 2A, B) olan al. Düz gasters veya kendi vücut yüzeyler daha ayrıntılı bir çözümleme (Şekil 2C, D) arasında sertleştirilmiş MGR içeriğine izleri ile karıncalar hariç.
  3. Bir çift propodeum, fine uçlu forseps ile seçilen karınca kapmak (ilk karın kesim) ve petiole (ikinci karın segment), forseps diğer çifti ile. Gaster bölge hafifçe vücudun kalan kısmına karınca (Şekil 3A) uzak çekerek bağlantısını kesin.
  4. Şimdi ayrı karınca gaster tergite 4, ince uçlu forseps ile tutarak düzeltmek. Bir çift daha ince uçlu forseps ile tergite (petiole yanında bulunur) 1 al ve yavaşça (Şekil 3B) peeling tarafından çıkarın. Bu da tergites ve MGRs için 2 ve 3 (Şekil 3 c, D) gastral bölümüne kadar tekrarlayın (sarı renkli C. explodens işçi karıncalar, ama MG içeriği rengi beyazdan üzerinde sarı-kırmızı diğer türler ile değişebilir) için en görünür bölümü.
    Not: exoskeleton kaldırarak, MGR membran de kısmen kaldırılır.
  5. Diseksiyon iğne kullanılarak gastral yuvası (Şekil 3E) dışarı çizilmemesi tarafından eşleştirilmiş MGRs balmumu benzeri içeriğini yavaşça çıkarın. Sadece diğer bezlerin karınca gaster mevcut rüptür olmadan ayrılmış olabilir MGR içerik bölümlerini kaldırın. Daha fazla güç ya da çabaları MGR içeriği bir bütün olarak elde etmek için uygulanacak varsa, onun eksik kaldırma (Şekil 4) kabul edin.
  6. MGR içeriğini onlar üzerine sopa kadar yavaşça diseksiyon iğne ucu ile dokunarak seçin. O zaman bilinen ile soğutmalı 1,5 kısa iplik şişe içine MGR içeriğini aktarmadan Dara kitle.
    1. Yapışkan MGR içeriği diseksiyon iğne uç--dan kaldırmak için iğne ucu örnek şişeyi duvara taşımak ve onları duvara smear. Şişeyi kapatın ve sonraki MGR içeriği izole kadar buza koyun.
  7. Daha sonra bitişik DG (Bölüm 6) kaynaklanan bileşikler tarafından MGR içerik örnek mümkün çapraz bulaşma için kontrol etmek, ayrıca DGs karıncalar, bunların hala tek parça (Şekil 4) vardır ve bir ayrı HPLC şişe koymak onları toplamak.
  8. Her zaman temiz Petri kabına ve MeOH/H2O diseksiyon aletlerde (1 + 1 v/v), bezi bezi veya karınca karınca değiştirirken.
  9. Bir analitik örnek için rezervuar içeriği veya birden çok karıncalar bezlerinin birleştirin.
    Not: Bezleri veya bunların içeriğini bir analitik örnek için kullanılan sayısını deneme tasarımına bağlı olarak değişebilir. Burada, MGR içeriği ya da DGs beş karıncalar bir analitik örnek almak için havuza.

3. solvent çıkarma izole bezi İçindekiler

  1. Analitik örnekleri (burada, MGR içeriği veya bitişik bezleri beş karıncalar havuza alınmış) kitlelerin belirlemek.
  2. Buz gibi yüksek saflıkta etil asetat (EtOAc) 1:14 sabit bir oranını eklemek w/v ve girdap soğutmalı koşullarda; 5 min için örnekleri burada, thermostated bir laboratuvar 7 ° C'de gerçekleştirilir.
  3. Örnekleri için 3,820 x g 7 ° c de 10 dk santrifüj kapasitesi ve supernatants transfer (yaklaşık 55-75 µL MGR içerik özü beş karıncalar elde için) önceden soğutulmuş 1,5 mL kısa iş parçacığı kapsayan 0,1 mL mikro-ekler şişeleri. Sıkıca şişeleri vidalı kapakları ile delik ve kırmızı lastik/PTFE septa içeren kapatın.
    Not: analiz hemen gerçekleştirilemiyor, donma/çözülme döngüsü sırasında kimyasal değişiklikler riskini en aza indirmek için hazırlık hemen sonra örnekleri analiz etmek için analiz, ama tavsiye edilir kadar özü-80 ° C'de tutmak.

4. GC-MS

  1. Tam bir GC-MS ölçüm sırası, aşağıdaki çözümleri, her biri 1.5 mL kısa iş parçacığı şişe hazırlayın:
    1. Piyasada bulunan alkan standart çözümler 8 mg/L Pro bileşik son bir konsantrasyon sulandrarak RI calibrant karışım hazırlamak hekzan kullanarak.
    2. Solvent boş hazırlamak saf EtOAc oluşan.
  2. Yer 1) çözücü-boş, 2) RI calibrant karışımı, 3) MGR içerik içeren şişeleri ayıklamak ve 4) DG içerik gaz Kromatograf (GC) birleştiğinde Otomatik örnekleyici, soğutmalı tepsi (10 ° C) ayıklayın.
    Not: Bu zaman aralığı her şişe Otomatik Örnekleyici ölçüm önce tutulur en aza indirmek için tavsiye edilir. MGR içerik örnek gibi kritik örnekleri için şişe hemen önce analiz Otomatik Örnekleyici yerleştirilmesi.
  3. Her örnek için bir sütun hedef bileşenleri için uygun kromatografik ayırma için GC-MS içine 1 µL aliquot enjekte (burada: HP - 5MS UI sütun).
    1. Aşağıdaki gibi görünebilir uygun GC parametreleri ayarlayın:
      1. Taşıyıcı gaz helyum kullanın ve 1 mL/dak bir tutmak için 2 dk ilâ 10 ° C/dak bir rampa tarafından takip, 40 ° C'den başlayarak bir fırın sıcaklığı rampa 330 ° C, en az 7 karakterden oluşan bir bekleme süresi ile giriş sıcaklığı 270 ° için Set seti sabit sütun akışının ayarlayın C.
      2. Seçin ve gerekirse, yeterli tepe şekillerde neden split oranları GC-MS enjeksiyon için ve yoğunluklarını bileşikler (Şekil 5) ilgi için ayarlayın.
        Not: sunulan örnekte DG özü bir bölme oranı 2:1 ve RI calibrant karışımı splitless modunda ölçmek gerekli. MGR içerik özü bir bölme oranı 2:1 ve 50: 1 ikinci bir anda analiz edildi.
      3. 350 ° C'ye yardımcı sıcaklığı ayarlamak
    2. Kütle spektrometre (MS) parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: MS kaynak sıcaklığı 230 ° C, MS Quad sıcaklığı 150 ° C, tarama aralığı düşük kitle 30 yüksek kütlesi 500, çözücü ile gecikme 4.1 min (için solvent boş ve deneysel örnekleri) veya (RI calibrant karışımı için) 6.1 min , sırasıyla. Tarama hızı yaklaşık 3 taramalar/s için ayarlayın.
      Not: MS parametre, özellikle MS inceden inceye gözden geçirmek-, örnekleme oranı ve döngü süresi en yüksek malzeme çekme ve spektrum deconvolution etkileyebilir ve uygun verileri değerlendirme MetaboliteDetector yazılımı ile parametre ayarlarını seçerken dikkate alınmalıdır.
  4. Ölçüm tamamlandığında, veri olarak verin. AIA proje dosyası (GC ile teslim veri analiz yazılımı kullanımı ile yapılır) bir taşınabilir veri depolama aygıtında.
    1. Dosyayı seçin | AIA biçimine veri verme, sonra Create yeni bir dizin kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın. Aranan depolama konumu (Örneğin, USB flash sürücü) seçin ve Aç' ı tıklatın. Verilmesi ve ---> simge vurmak için dosyaları seçin. İşlemitıklandığında ile onaylayın.

5. metaboliti algılama ve kimlik MetaboliteDetector yazılım kullanımı ile

  1. Veri dosyalarının analiz başlamadan önce aç MetaboliteDetector, Araçlar | Ayarlarıve gerekli parametreleri (MetaboliteDetector Bireysel adet kalın olarak gösterilir) aşağıdaki gibi ayarlayın:
    1. Sayfa görünümü, Min için süre ölçeğini ayarlama ve eksen etiketleri seçeneğini etkinleştirin.
    2. Sayfasında Deconvolutionen yüksek ayarları için parametreler ayarlayın: en yüksek eşik: 10 ve en az en yüksek yükseklik (gürültü adet): 10. Temel ayarlamasını etkinleştirme onay kutusunu temizleyin. Metaboliti algılama için parametreleri ayarla: depo/Tara: 10, Deconvolution Genişlik (tarama): 5, gerekli yoğunluğu (temel pik %): 0 ve gerekli sayıda tepeler: 10.
    3. Sayfasında kimlikkütüphane arama seçeneğini ayarlayın: bileşik Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' ve NIST (NIST sqlite kütüphanesinin dahil olmak .lbr biçiminde). Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Max. RI fark: 10, kesme puanı: 0.9, Pure/Impure kompozisyon: 0.5, parça sayısı: 2, en az sayıda özdeş frag.: 1. kullanım ölçekli lib: Bilet; Benzerliği puan: Belirtimi benzerlik; Kitle filtre: m/z 207, 221, 281, 355 ve 1147 (için GC-sütun durağan faz doğan bilinen kirletici maddeleri).
    4. Sayfada Quantification parametrelerini ayarlamak: miktar iyonları sayısı: 3, en az mesafe sonraki iyonları arasında: 5 ve en az gerekli kalitesi haritası: 1. miktar iyonları 207, 221, 281, 355 ve 1147 hariç.
      Not: MS veri yüksek çözünürlüklü durumunda ayrıca sayfasında aşağıdaki parametreleri ayarlayın Centroid için: en yüksek eşik başlar: 10, en yüksek eşik bitiş: -5 ve maksimal satır taban çizgisi uzaklığı: 30, FWHM: 0,5.
  2. ' Dosyalarını. Oluşturulan içinde bulunan CDF biçimi. AIA proje dosyası olarak. NetCDF dosya seçerek MetaboliteDetector yazılımı içine | Alma | NetCDF alma. Klasör şeklinde simgesini seçin ve ardından dosyaları ithal ve işlenen örnek kategoriler için seçin: 1) çözücü-boş, 2) RI calibrants, 3) MGR içerik özü ve 4) DG içerik özü. Veri işleme başlamak için OK ile onaylayın. İşlemden sonra yakın görünen penceresinde seçin.
  3. RI kalibrasyon ve MGR hulâsa içinde bulunan bileşikler RI değerlerinin belirlenmesi için dosyasını seçin | Açık ve RI calibrants verileri içeren dosyayı seçin.
    1. RI calibrant dosya açıldıktan sonra Büyüteç simgesini seçin. Görünen pencere OKile onaylayın.
    2. Uygun RI kalibrasyon için tespit alkanes RI calibrant dosyasındaki aralığını denetleyin.
      1. Bu amaçla, en fazla bir kez tıklayarak ilk alkan (en düşük fiyat RT, Şekil 6ile) tespit kaynaklanan ilk zirve, altında görünen üçgen seçin.
      2. En yüksek spektrum benzerlik ile vurmak kontrol ('Belirtimi sim.', en fazla sayı = 1) alkan Kütüphane girişleri (Şekil 6) göre.
      3. Önerilen alkan bileşik kimliğini doğrulamak için Örneğin, NIST Kimya başladı22literatürde verilen kitle spektrum onun kitle spektrum karşılaştırın.
      4. Son alkan RI calibrant karışımı tespit son kromatografik görünen alkan tepe sayarak belirler.
    3. RI kalibrasyon için Araçlar | RI-Kalibrasyon Sihirbazı. İleri' yi seçin.
    4. Klasör şeklinde simgesine tıklayın ve kromatografik RI calibrant karışımı içeren dosyayı seçin. İleri' yi seçin.
    5. Alkan calibrants çıktı penceresinde girişleri içeren kitaplığı seçin.
    6. Tüm alkanes tespit Kütüphane maddeden RI calibrant dosyasında seçin ve'ı tıklatın >> simgesi. Seçtikten sonra >>, sonrakiseçin.
    7. Her tespit alkan görünen tablo için listelenen RTs denetleyin. Bu amaçla, ilgili üçgen (Şekil 7) tıklayarak her alkan için ana penceredeki tasvir RTs denetleyin. Gerekli (Şekil 8), düzeltmek, kalibrasyon tablosundaki RT el ile ilgili alana çift tıklatarak açılır menüsünü seçip doğru dik alternatif olarak önerilen tercih RT klavye (yardımıyla yazın Şekil 9).
    8. RT her alkan için doğru olduğunda, İleri' yi seçin. Sonraki RI kalibrasyon tablo gösterilen görünen penceresinde tıklatın.
    9. Yeşil + sembol görünen Kromatografik seçimi penceresinde seçin, solvent boş veri dosyası ve dosyaları bezinin özleri seçin ve İleri' yi seçin. Parametre ayarları aşağıdaki gibi görünen penceresinde ayarlayın: temel ayarı devre dışı bırakma, eşik zirve: 5, en az en yüksek Yükseklik: 5, depo gözleri/Tara: 10 ve Deconvolution Genişlik: 5. vurmak gelecek ve o zaman başlamak RI hesaplama gerçekleştirmek için seçili örnek dosyalarında bulunan bileşikler.
  4. Ek açıklama ve seçilen metabolitleri MGR özü tanımlaması için kendisi için RIS hesapladık (yukarıdaki adım 5.3.9), açıklandığı gibi ölçülen MGR içerik özü, veri dosyasını açın dosya seçerek | Açık ve aranan veri dosyasını seçerek.
    1. Araçlar | Ayarları | Deconvolution ve en az pik yüksekliği (gürültü adet) her iki yanı sıra en yüksek eşik 5'e değiştirin. Büyüteç simgesini seçin ve görünen uyarı penceresi tekrar OKile onaylayın.
    2. Bir tepe ilgi en altında görünen bir üçgen üzerine tıklayın ve onun kitle spektrum NIST simgesini seçerek NIST kütüphanede saklanan olanlar ile karşılaştırın.
    3. İlk çıkan hit NIST-arama (Şekil 10) seçin.
    4. Bileşik faiz elde edilen spektrum benzerlik üzerinde seçilen spektrum benzerlik skor ise (burada ≥ 0,9) bir NIST-girişine (Şekil 10) karşılaştırıldığında, RI bak (benzer durağan faz GC sütun, film kalınlığı ve sütun için çapı) Bu bileşiği (Örneğin, NIST Kimya başladı22) literatürde verilen.
    5. NIST başvuru RI (veya birden çok RI değer verildiğinde ortalama RIS) arasındaki göreli farkı ve deneysel olarak türetilmiş RI hesaplayın. Farkı eşittir veya Kullanıcı tarafından belirtilen maksimum toleranslı değeri (burada, ≤ ±1%), bileşik olarak tayin 'Açıklama'.
    6. Adımları 5.4.2–5.4.5 ilgi MGR örnek dosyanın içerdiği tüm bileşikleri için yineleyin.
    7. RI ve standart çözümler kitle spectra bileşik kimlik için karşılaştırın (Örneğin, 2-100 mg/L) Bu ek açıklama eklenen bileşikler için Bölüm 4'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında ölçülür.
    8. Bölüm 4'te açıklandığı gibi standart analiz ve alkan - MGR içerik bezi veri ve adım 4.4 ve 5.2 için açıklandığı gibi elde edilen verilerin işlenmesi.
    9. Standart araçları seçerek elde veri kalibre | RI-Kalibrasyon Sihirbazı | Sonraki ve aynı RI calibrant dosyası olarak kullanılan önce seçme. İleri' yi seçin, sonra tekrar seçin ve sonraki verileri içeren dosyayı standart çözümden yeşil + simgesini tıklatarak satın aldı. Sonraki ve o zaman başlamak için standart bileşim RI hesaplamak için vurmak.
      Not: Standart analizini hemen sonra örnek çözümleme gerçekleştirilemez, RI calibrants tekrar analiz etmek ve yeni RI kalibrasyon ve hesaplama için standart gerçekleştirmek için önerilir.
    10. Standart için ilgili dosyayı açın ve adım 5.4.2 açıklandığı gibi onun spektrum NIST kitaplığı ile karşılaştırması tarafından kimliğini onaylayın.
    11. Standart kimlik onay alındıktan sonra kütle spektrumu ve standart bileşik RI kurum içi kitaplığa ekleyin. Bu amaçla, yeşil + simge'yi tıklatın ve tercih edilen Kütüphane giriş girin. Kütle spektrumu eklemek için Tamam ve standart kütüphaneye bileşik RI ile onaylayın. Yeni giriş kütüphanede görülemez, Yenile düğmesini etkinleştirin.
      Not: RI kalibrasyon başarıyla gerçekleştirildi, RI MetaboliteDetector tarafından belirlenen ilgili kitaplığı kaydı içinde gösterilir. Standart Kütüphane giriini oluşturduktan sonra bu metaboliti MG özü tanımlaması RI kombinasyonuna göre ve spectra benzerlik mümkündür.
    12. MGR içerik verileri dosyayı yeniden açın. Araçlar | Ayarları | Kimlik. Şimdi, standart bileşik RI hesaplanır ve Kütüphane girişine eklendi gibi Benzerliği puan Spektrum benzerlik Kombine puanıiçin değiştirin.
    13. Büyüteç simgesini tıklatın ve adım 5.4.5 üçgen açıklamalı bileşik altında seçin.
    14. Tıkırtı isabet ve 'genel benzerlik puanı' için verilen değer kontrol (OSS, metaboliti dedektörü olarak 'Genel olarak simil.' tarafından kısaltılır), spektrum benzerlik ve RI benzerlik bir arada göz önüne alındığında (Şekil 11) puan edinildi.
      Not: bir hit içi kütüphanede bulunursa, ana penceresinin sağ tarafında görüntülenir.
    15. OSS Kullanıcı tarafından tanımlanmış eşiğin (burada ≥ 0,9, üçgen yeşil renk tarafından belirtilmiştir) ise, bileşik 'tespit' (Şekil 11) atayın.

6. onay MGR içerik özü DG içeriğe göre Contaminations için

  1. Kendisi için zaten bileşiklerin RIS hesaplanan DG örnek kalibre edilmiş dosyasını MetaboliteDetector (adım 5.3.9) ile açın.
  2. Kromatografik MG içerik sample ve DG ölçümü sonra elde edilen bir yerleşim için Araçlar | Kromatografik kaplaması ve iki ilgili eğe yolu ile yeşil + simgesini seçin. Tamamile onaylayın.
  3. Bindirmeyi görüntülemek için pencerenin altında görünen Kromatografik bindirme sayfasında seçin.
  4. Onay bileşiklerin MGR içerik arasında örtüşme özü (Şekil 12) ve DG içeriği ayıklamak ve üst üste gelen bileşikler daha fazla MGR içerik çözümleme dışı bırakmak.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. explodens bezi salgıları sözde metaboliti tanımlama için deneysel adımları listeleyen bir şematik iş akışı Şekil 13' te gösterilmektedir. Ayrıca, COCY işçi karıncalar sunulan deneme için kullanılan en önemli vücut parçaları, şematik bir genel bakış ek Şekil S1 A, Bsağlanır. Karıncalar diseksiyon sözde metaboliti kimlik MGR içerik kadar önemli adımlardan Ek Şekil S2gösterilmiştir.

MGR içeriği volatilome analiz için uygun yalıtmak için soğutmalı bir devlet boyunca taşıma, depolama ve aynı zamanda diseksiyon sürecinde devam edildi. Bu amaçla, karıncalar hemen onların topluluğu bir böcek aspiratör (Bölüm 1 ve Şekil 1) in situsonra kullanımı ile donduruldu. -20 ° C-dondurucu 2 gün için depolama sonra karınca örnekleri nerede hemen daha fazla analiz kadar-80 ° C'de bindirildi Avusturya'ya kuru buzda taşınan. Karıncalar MGR içeriklerini yalıtım için seçilecek uygun sergi yuvarlak bir gaster bölge ve sağlam (Şekil 2A) ve tergites (Şekil 2B) arasında görünür MGR gösterildiği gibi MGR içerik ile iyi stoklanmış en iyi durumda. Gasters daha fazla analiz için uygun olmayan karıncalar Şekil 2CiçindeDgösterilir. Ana adımları (adım 2.3-2.6) MGR içeriği yalıtım sürecine dahil COCY karıncalar Şekil 3' te gösterilmiştir. (Sarı olması durumunda C. explodens, ama renkler beyazdan kırmızı COCY grubuna ait diğer türler ile değişebilir) izole MGR içeriği Şekil 14' te gösterilmektedir.

Karıncalar onların MGR içerik için anatomi zaman değil ponksiyon veya herhangi bir diğer bezleri veya bağırsak (adım 2.5) rüptürü için özen gösterilmelidir. Şekil 4 MGR içerik yalıtım sonra hala iki diğer, bozulmamış bezlerin (DG ve VG) içeren bir disseke karınca gaster gösterir. Karınca bağırsak içeriği tarafından görünür kirlenme örneği Şekil 15' te gösterilen. Çapraz bulaşma MGR altında bulunan DG içeriğiyle tamamen kaçınamayız beri protokolünün bir parçası bu bezleri MGR içerik özü (Bölüm 6) gelen sinyalleri ile elde edilen sinyal karşılaştırılması için analiz etmek için tasvir edilir. Diseksiyon yordamı düzgün yapıldığında, yaklaşık 0,75-1.2 elde etmek mümkündür karınca MGR içeriği mg. Burada açıklanan iletişim kuralı için beş karıncalar içeriğini MGR 3.9-5,9 mg her yinelenen örnekleri almak için havuza.

İzole bezi rezervuar içeriği ile EtOAc (Bölüm 3) ayıklanmış ve GC-MS tarafından (Bölüm 4) analiz. C. explodens işçi karıncalar MG içerik özü ölçümü bir kromatografik tepeler ve kitle spectra sözde MGR içerik bileşikler (Şekil 5) onlarca oluşan içinde sonuçlanır. İki baskın metabolitleri 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (No 4) ve 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (No 5) aynı örnek analiz edildi neden olan sütun aşırı neden MG içerik özü daha yüksek bir oranı 50: 1 ( Ayır Şekil 5, Ankastre). Olası çapraz bulaşma MGR içerik DG bileşenlerinin tarafından Örneğin, ek Peaks'e yaklaşık dakika 29 (Şekil 12) başlayarak geç RTs sergilenmesi GC-MS kromatografik olarak görebilirler. Kromatografik tepeler ve bileşiklerin kitle spectra hariç MetaboliteDetector ile solvent-boş, kaynak GC sütun durağan faz veya DG karınca gaster mevcut içeriği ve daha sonraki işleme de bulundu Yazılım yaklaşık 110 MGR içerik bileşikleri bir sinyal gürültü oranı ≥ 10 ile sonuçlandı. Daha sonra metaboliti ek açıklama ve kimlik MetaboliteDetector yazılımı ile chromatograms kalibre edilmiş ve RI değerleri (adım 5.3 ve alt adımları, Şekil 6, Şekil 7 için ölçülen örnek dosyaları belirlenmiştir , Şekil 8 , Şekil 9). Tespit edilen sözde MGR içerik metabolitleri spektrum benzerlik NIST-Kütüphane, sunulan örnekte (adım 5.4 ve alt adımları, Şekil 10 MetaboliteDetector yazılım ayrılmaz bir parçası oluşan bir birleşimi temel açıklamalı ). Ayrıca, RI değerleri aynı veya benzer durağan faz için literatürde buldum film kalınlığı ve çapı GC sütunun bileşik ek bilgi (adım 5.4.4 ve 5.4.5) için kabul edildi. RIS ve kitle spectra ile sıkı eşleştirme ölçütleri ve standartlarının kullanımı tarafından ayarladıktan sonra bir standart bileşik (adımları 5.4.7-5.4.15 ve Şekil 11) için protokol bölümünde de açıklandığı gibi bu 10 kimliğini onaylamak mümkün algılanan metabolitleri %. C. explodens MGR içeriğini volatilome ayrıntılı bir rapor başka bir yerde yayınlanacaktır beri zaten bir önceki yayında Jones ve ark. tarafından tarif edilmiştir Bu metabolitler da çalışmanın odaklı 17 (tür burada KB02-108 belirlenmiş; Ayrıca Cook et al. bkz: 23). Tablo 1 saptanan bu bileşiklerin genel bir bakış sağlar.

Kromatografi sisteminde T1 ve T2 ile örgülü bir tüpün deneysel kurulum diyagramı.
Şekil 1: şematik bir böcek aspiratör çizim. Bir şişe veya kapsayıcı mühürler bir kapak iki delik, iki esnek tüp nerede koymak yapılır. Şişeyi iç yüzleri bir tüp (T1) açılışı böcekler engellemek iyi bir mesh ile kilitlendi. Ayrıca, deliği tüpün içine hava alışverişini kolaylaştırmak için yapılır. Tüp T2 sonu yakından örnekleme şişe alıyorum T1 tarafından sucked böcekler doğru çekti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

T1-T5 etiketli tergitler ile karınca segmentasyon diyagramı; 1 mm ölçeğinde mikroskop analizi.
Şekil 2: kırık gaster karşı sağlam. (A)sağlam gaster diseksiyon için uygun. (B) sağlam gaster MGR içerik, diseksiyon için de uygundur neredeyse tamamen dolu. (C) ve (D) içerikli çkarlyor ve sertleştirilmiş MGR (sarı), karınca gasters muhtemelen gaster deri yırtılması sırasında örnekleme sırasında kırık kırık. Bu karıncalar diseksiyon, ayıklama ve daha fazla analiz hariç tutulur. T: tergite. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Böcek karın diseksiyon işlemi, mikroskop görüntüsü, alet tanımlama, etiketli segmentler T1-T4.
Şekil 3: Major adımları diseksiyon sürecine dahil. Karınca vücudun kalan kısmına(a)ayrılması gaster bölgesi. (B) exoskeleton Peeling: tergite 1, tergite 2 (C) ve tergite 3, eşleştirilmiş sarı renkli MGRs içeriğini sonra neredeyse tamamen görünür (D) vardır. (E) bir diseksiyon iğne yardımıyla tarafından yapışkan MGR çıkarma. T: tergite. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bezleri (DG) ve vezikülü (VG) gösteren diseke Drosophila anatomisinin mikrografik görüntüsü, etiketli.
Şekil 4: karınca gaster yalıtım MGR İçindekiler sonra. Diğer iki bezlerin gaster içinde mevcut (VG: venom bezi ve DG: Dufour'ın bezi) görülebilir. MGR içerik (sol-overs) yalıtım-ebilmek var olmak seen sarıyla sonra kaldırıldıktan sonra her iki bölmeleri hala bozulmamış olmalı. Bu bezleri MGR içeriği aynı şekilde analiz edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik bolluğuna karşı tutma süresini gösteren, Noreugenin zirvelerini vurgulayan kromatografi grafiği.
Şekil 5: temsilcisi toplam iyon geçerli (TIC) kromatografik MGR içerik ekstresinin. İki en bol GC-MS zirveleri daha ne zaman daha yüksek bir bölme oranı (50: 1) normal 2:1 oranında yerine seçildi kromatografik tepeler, simetrik olarak şeklinde sonuçlandı (bkz: iç metin). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Gaz kromatografisi sonuçları; Alkan bileşikleri için alıkonma süresi ve spektral analiz, M/Z 128.
Şekil 6: RI calibrant kromatografik ilk tespit alkan belirlenmesi. İlk alkan tepe tepe maksimum altındaki üçgen seçilir. Alkan 6,31 min elutes ve en yüksek spektrum benzerlik (burada, 'Belirtimi sim.') kitaplığı girişi 'Alkane_C09' için gösterir. Alkan kimliğini onaylamak için kütle spektrumu bir kitaplığa (Örneğin, NIST Kimya başladı22) karşılaştırılır. Sunulan örnekte, nonane, moleküler iyon tarafından 128 m/z değeri ile tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kalibrasyon tablolu kromatografi grafiği; Bileşik ayırma için alıkonma süresi analizi.
Şekil 7: n-alkan standart karışımı kullanımı ile RI kalibrasyon. Veri dosyası açılmış RI calibrant ve seçilen 'RI-kalibrasyon-Wizard' işlevi. Tutma zamanı kalibrasyon tabloda tasvir RI için doğru eşleme kontrol edilmelidir. RT alkane_C09 için 6,31 min (nonane) doğru tabloda görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Gaz kromatografisi analizi; Alkanlar için bileşik alıkonma süreleri ve kalibrasyon verilerinin diyagramı.
Şekil 8: yanlış RTs kalibrasyon tablosunda görüntülenir. RTs düzgün görüntülenmiyor (ya yanlış bir RT değer veya eksik RT değer -1 gösterilir tarafından gösterilen). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kromatografi analizi; TIC grafiği; kalibrasyon kurulumu; saklama süresi verileri; kütle spektrometresi.
Şekil 9: kalibrasyon tablosundaki yanlış RTS el ile düzeltme. Yanlış değerleri el ile ilgili alkan için doğru RT ekleyerek Alkane_C39 için aşağıda gösterildiği gibi düzeltilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kütle spektrometresi analizi; TIC ve spektrum grafiği; Bileşik tanımlama işlemi gösterilmiştir.
Şekil 10: NIST kitaplığı girişleri için seçilen bileşik kütle spektrumu karşılaştırılması. En yüksek maksimum 6,16 min (RI 891) ve harekete geçirmek-in 'NIST-arama' işlevini (kırmızı daire) eluting seçtikten sonra bir spektrum benzerlik 0,99 2-heptanone için görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kromatografi diyagramı, TIC, spektral benzerlik analizi için tespit edilen ve kütüphane bileşiklerinin karşılaştırılması.
Şekil 11: metaboliti kimlik MGR içerik özü. Kütle spektrumu ve bileşik RI 891 örnek kromatografik eluting dan kaynaklanan RI RIS ve spectra ölçülen standart bileşikler içeren şirket içinde Kütüphane girişleri karşılaştırılır. Eğer 'Genel benzerlik skor' (OSS, metaboliti dedektörü 'Genel simil kütle spektrumu ve RI uygulama. ' kısaltılır) arasında bir bileşik içi kütüphanede ve örnek bir bileşik dosya ≥ 0,9, bileşik 'tespit 'olarak belirlenmiş. 2-heptanone içi Kütüphane giriş ve bileşik RI 891 eluting arasında OSS 0,96, 2-heptanone MGR içeriğindeki tanımlaması hangi sonuçlar çıkarmak işte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kromatografi grafiği; Dufour'un ve Mandibular bez özleri; pik karşılaştırması, alıkonma süresi analizi.
Şekil 12: bindirme TIC kromatografik bölüm (dk 29 dk 35) DG içeriği ayıklamak (kırmızı) ve MGR içeriği ayıklamak (mavi). (Sözde) bileşikleri çakışan karşılık gelen en yüksek alanlarda DG MGR içerik daha özü özü içeriği yüksektir; Bu bileşikler potansiyel DG kaynaklanan ve MGR içerik (minör) kirletici ayıklamak gibi bu nedenle kabul edilir. C. explodens MGR içerik özü, söz konusu olduğunda bir sözde DG kirlenme kaynaklanan kromatografik doruklarına yaklaşık 29 dk az bulunabilir ve kromatografik bu bölümü daha da MGR içeriği analizinden dışlanabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Karınca salgısı analizi akış şeması; GC-MS, metabolit tanımlama süreci, bez ekstraksiyon adımları.
Şekil 13: karınca örnekleri şematik akışından metaboliti ek açıklama/kimlik bezi rezervuar içerik için GC-MS analizden sonra ayıklar. Burada sunulan Protokolü yalıtım diseksiyon karınca ve GC-MS analiz yoluyla MGR İçindekiler başlayarak tüm deneysel adımları açıklar yanı sıra veri değerlendirme (siyah olarak belirtilir). Alternatif olarak, böcek salgı (gri renkle belirtilir) oluşturulan ve toplanan situ içinde de kullanabilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tohum gelişim diyagramı; ~1 mm ölçeğinde karşılaştırma; botanik çalışmalar için mikroskopi.
Şekil 14: izole balmumu MGR içeriği ayıklama önce. (B) onlar de olabilir, ama(a)iki MGRs içeriğini sopa birlikte yalıtım sonra ayrılmış. C. explodensiçinde MGR içerik rengini turuncu-sarı, ama diğer türler COCY grubunun kırmızı ile beyaz arasındadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adli analiz ve malzeme testinde kullanılan, yanık hasarını gösteren doku örneği yakın çekimi (~ 1 mm).
Şekil 15: çapraz-böceğin bağırsak (kahverengi) bileşenlerinin tarafından kirlenmiş bir izole MGR salgı Illustration. Bu tür MGR yalıtır çıkarma ve daha fazla analiz dışarıda bırakılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

KİMLİĞİMetabolitiÖnemsiz adıInChI dizeToplam formülüne
1Heptan-2-birInChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3C7H14O
2n-UndecaneInChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3C11H24
3n-HeptadecaneInChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3C17H36
41-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanoneMonoacetylphloroglucinolInChI = 1'ler / C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3C8H8O4
55,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-OneNoreugeninInChI = 1'ler / C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3C10H8O4

Tablo 1: EtOAc içinde tanımlanan metabolitleri ayıklamak C. explodens küçük işçi karıncalar izole MGR içindekiler. Seçili metabolitleri mevcuttur.

Ek Şekil S1. COCY karıncalar (küçük işçiler) ait en önemli vücut parçaları genel bakış Bu makale sundu. (A)MGRs sarı renk ile gösterilir. Onların gastral bölümü volatilome analizi için kullanılır. (B) MGRs gastral kısmı tergites 1-3 altında yer alır. T: tergite. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil S2. Şematik sunulan deneme bakış. Karınca diseksiyon metabolitleri MGR içeriğinde mevcut sözde tanımlaması kadar önemli adımlardan gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, biz C. explodens küçük işçi karıncalar hypertrophied MGRs içinde bulunan içeriği volatilome analiz etmek için bir iletişim mevcut. Burada kullanılan karıncalar 'patlama' ve kontrolsüz bir şekilde forseps ile dokunduğumda MGR içerikleri çıkarma beri bir "yumuşak" koleksiyonu Teknik olarak bir böcek aspiratör (Şekil 1) tarafından sağlanan kullanmak için tavsiye edilir. COCY karıncalar da dahil olmak üzere bazı karınca türler için Aksi takdirde (Örneğin, headspace formik asit birikimi tarafından) karıncalar kendi kendine zehirlenmesi oluşabilir bu yana karıncalar 50 mL flakon, başına beş bireyler için en fazla sayısını sınırlamak gerekli olabilir. Alanında karıncalar için dondurma, dondurulmuş soğuk paketleri ile doldurulmuş bir șık çanta kullanılabilir. Örnekleri olmalı hızla donmuş ve soğutmalı koşullar (Örneğin, -20 ° C,-80 ° C'de en iyi) altında saklanan ama öldürmek ve onların bezlerinin artan hasar bu yöntemle gözlenmiştir beri karıncalar sıvı azot içinde saklamak için tavsiye edilmez.

Sunulan arabellek - ve solventsiz diseksiyon metodoloji balmumu benzeri çene kemiğinde bezi rezervuar içeriği yanı sıra diğer bezlerin içinde donmuş işçi karıncalar mevcut almak için uygundur. C. explodensMGR içeriğini volatilome analiz için sürekli karınca (adım 2.1.4) soğutma ve çapraz-contaminations ile diğer bezi içeriği/sıvı mevcut MG örneklerin en aza indirilmesi diseksiyon sırasında dikkate alınması gereken önemli yönü vardır karınca gaster (2.5, adım Şekil 4ve Şekil 15). Donmuş karıncalar hatırı sayılır bir kısmı zarar görmüş olabilir, ya çünkü karıncalar 'örnekleme sırasında patladı' ya da laboratuvar örnekleme sitesinden kuru buzda taşıma sırasında zarar görmüş. Gaster bölge çalışmıyorsa bu karıncalar daha fazla analiz (Şekil 2C, D) için uygun değildir. Yalnızca eksik veya hatalı anten ve bacaklar, bu karıncalar hala çıkarma MGR içindekiler ve daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanılabilir. C. explodens karıncalar MGR içeriğini soğutmalı diseksiyon iğneler (adım 2.5, Şekil 3Eve Şekil 14) kullanımı ile yalıtmak için düz ileri bir balmumu benzeri tutarlılık var. Ek bakım yapışkan MGR taşıma sırasında içerik alınması gerekiyor. Bu şey onunla fiziksel temas yapışabilir ve de sık sık diğer örneklerin bulaşma riskini artırır diseksiyon forseps için uygun olacaktır. Sadece MGR içerik diseksiyon iğne ile dokunmak ve hemen çıkarma (adım 2.5 ve 2.6) için kullanılan cam şişe içine transfer gereklidir. Ayrıca, karıncalar veya bezi-türleri (adım 2.8) arasında geçiş yaparken diseksiyon ekipman MeOH/H2O karışımı ile temizlemek için tavsiye edilir.

Diğer karınca türler içeriğini bezi bile soğuk paketleri ile soğutma sırasında sıvı bir durumda mevcut olabilir. Bu durumda, membran ilk önce dahil olmak üzere tüm bezi izole ve daha sonra içerik elde etmek için delmiş. Sıvı salgılar Ayrıca ince kılcal pipetler yardımı ile temin edilebilir. Yaklaşık 4-5 mm (anten) olmadan ortalama vücut uzunluğuyla, C. explodens işçilerin COCY grup daha küçük türler için ait. Onların kez şişmiş gaster yaklaşık 2-2,5 mm uzunluğunda ve 1-1.5 mm genişliğinde oluşmaktadır. COCY grup böylece-far en büyük bilinen türlerin işçilerin yaklaşık 3 mm uzunluğunda ve 2.5 mm genişliğinde gaster boyutunu Gövde uzunluğu yaklaşık 8 mm boyutuyla ulaşabilirsiniz. Protokol iyi incelemek ve araştırmak bireysel karıncalar ve gasters farklı olarak bu boyutu için uygun diseksiyon aletleri COCY tür, burada kullanılan ve mikroskop daha küçük karıncalar veya daha küçük organları için geçerli olabileceğini adapte zorunda kalabilirsiniz. Ayrıca, karıncalar analitik örnek başına sayısı de var olmak artmak zorunda kalabilirsiniz.

Karınca MGR içerik için diseksiyon sırasında herhangi bir diğer bezleri veya bağırsak içeriği olan çapraz-örnek (adım 2.5, Şekil 4 ve Şekil 15) kontamine - zarar vermemesi için önemlidir. Gözle görülür en uygun durumda MGR içeriği, DG, çıkarma sonra yanı sıra VG sağlam (Şekil 4) tutulur. MGRs altında bulunan, DG, içeriği ile contaminations tamamen önlemek için zor olan. Bunun nedeni de bezi bütünlük kısmi bozulma laboratuvar örnekleme sitesinden kuru buzda taşıma sırasında içerebilir. MGR incelenen karıncalar bir dizi için fark etmiş gibi DGs örnekleme sırasında veya patlayan, sürecinde bozulmuş olanağı da sağlar. MGR (Bölüm 3 ve 4) içindekiler gibi DG içeriği aynı şekilde çözümlenebilir beri sonuçları elde edilen verileri analiz MGR içerik örnekleri (Bölüm 6) sonra karşılaştırılabilir. MGR içerik özleri C. explodens karıncalar elde edilen söz konusu olduğunda, aynı zamanda DG içinde bulunan bileşikler geç kromatografik (Şekil 12) elute başlar. DG mistaking önlemek için MGR bileşenlerinin için maddeler ve birleşimler, ilgili metabolitleri daha fazla çözümleme dışı bırakılabilir. Diğer karınca türler üzerine çalışmalar DGs de (yüksek) uçucu bileşikler1,24, hangi genellikle erken GC-kromatografik elute içerebilir bilinir.

COCY MGR içeriğini kimyasal bileşimi ile ilgili önceki çalışmalarda karıncalar, Bütün karıncalar veya onların bütün gasters analiz16,17,18,23, oysa yaşından burada MGR içeriği kendilerini karıncalar diseksiyon ile elde edilmiştir.

Disseke MGR içeriği analiz müfettişler biyokimyasal araştırmalar, orada bulunan metabolitleri tanımlaması da dahil olmak üzere geniş bir dizi gerçekleştirmek sağlar. C. explodensMGR içinde bulunan uçucu bileşenlerinin tanımlaması burada gerçekleştirilen çalışma odaklı beri GC-MS, analizleri (Bölüm 4) seçildi. Bunun için özleri ideal bir konuma sahip hemen hazırlık sonra ölçülen veya-80 ° C'de analiz kadar saklı. (Genişletilmiş) depolama (3,3 ve 4.2 adımlardan sonra bkz: Notlar) özler kimyasal değişikliklere neden olabilir unutulmamalıdır. MGR içeriği konsantrasyonu büyüklükte birkaç emir aralığını kapsayabilir beri MGR özleri farklı GC oranları bölme, analiz için gerekli olabilir. Karıncalar bir bölme oranı 2:1 kullanıldığında sütun aşırı neden Protokolü örneklemek için geçen MGR içerik olarak iki ana bileşikler ayıklamak beri bu örnek 50: 1 (adım 4.3.1.2and Şekil 5) daha yüksek bölünmüş oranında ikinci bir anda analiz edildi. Bölüm 4'de GC-MS parametre ayarları Malzemeler tablobelirtilen GC-MS cihazlar ile oluşturulan veri için uygundur. RI calibrants (adım 4.1.1) yanındaki bir çözücü boş (adım 4.1.2) aynı zamanda biyolojik olmayan eserler ve kirletici sonraki veri çözümleme sırasında tanımak için analiz edilmelidir. Metaboliti tanımlama için ek açıklama eklenen bileşikler (adımları 5.4.7and aşağıda) örnek özleri analiz etmek için kullanılan aynı GC-MS koşullar altında otantik standartları ölçmek önemlidir. Doğruluk ve son veri güvenilirliğini artırmak için tüm örnek Kategoriler (solvent-boş, RI calibrants, örnek özleri ve standartları) aynı ölçüm dizisi içinde analiz etmek için önerilir. Ayrıca, otantik standartları bir konsantrasyon için örnek özleri gözlenen karşılaştırılabilir, analiz edilmelidir. Bu RI değerleri ve örnek ve son olarak artan ve daha anlamlı metaboliti ek açıklama/kimlik için yol açacaktır standart kitle spectra arasındaki benzerlik doğruluğunu geliştirmek için yardımcı olur. Bu amaçla, standartları art arda farklı bölme faktörler kullanılarak ölçülebilir.

Metaboliti teşhis kodu, gelişmiş yazılım MetaboliteDetector spectra deconvolution ve RI ve spectra karşılaştırma için bir uygulanan NIST-Kütüphane de kurulan bir şirket içinde Kütüphane (Bölüm 5) olarak kullanılır. Bu MetaboliteDetector bir 64 bit LINUX tabanlı işletim sistemlerinde (Örneğin, KUBUNTU) çalıştırın ve oluşturulan kopyalamak için önerilir *. Yerel sabit diske taşınabilir veri depolama aygıtından CDF veri dosyaları (adım 4.4). MetaboliteDetector centroid veya profil netCDF formatında ham GC-MS veri alma yeteneğine sahiptir. Yazılım çoğu GC-MS araçların kayıtlı ham veri bu biçimi19dönüştürmek gerekir. Veri çözümleme başlamadan önce elde edilebilir belgili tanımlık şekil ve grafik kullanıcı arabirimi19,25, konusunda bilgi sahibi olmak önceki MetaboliteDetector yazılım sürümleri için edebiyat okumak için önerilir 26.

RI kalibrasyon ve örnek özleri mevcut bileşik doruklarına sonraki RI değer hesaplaması için RIS ve RI calibrants (burada, n-alkanes) spectra içeren kitaplığı kullanılır. Böyle bir kütüphane ya da kendi kendine kurulan olabilir veya önceden varolan bir ('CalibrationLibrary_Alkanes')-ebilmek var olmak downloaded27. RIS ve spectra n-C09 C39 için değişen Bölüm 4'te açıklandığı gibi analiz alkanes için sağlanan varsayılan calibrant kitaplığı içerir. Sağlanan Kütüphane detektörlü metaboliti doğrudan tüm verilerin kalibrasyon işlemine başlamak için çalışan kullanıcılar sağlar. Gerekirse, bu kütüphane de daha fazla alkanes için ek girişler ile uzatılabilir. Başvuru ve deneysel olarak türetilmiş RIS ve kitle spectra (bkz: adım 5.3 ve alt adımları, 7 şekil, Şekil 8, Şekil 9) benzerliğini temel alan, ek açıklama veya tanımlama bileşiklerin olabilir gerçekleştirilen (adım 5.4 ve alt adımları, Şekil 11). MetaboliteDetector ile otomatik bilgi işlem sonra Kullanıcı el ile doğru tepe malzeme çekme ve spektrum deconvolution için kitle spectra ilgi her sözde bileşiği 'üçgen' temel inceleyerek kontrol eder ki önemlidir. Ayrıca, GC-MS araçları ve veri oluşturulmasında kullanılan parametre ayarlarına bağlı olarak sunulan MetaboliteDetector ayarlardan adaptasyonlar gerekli olabilir. MetaboliteDetector yazılım bu el yazması, Örneğin, ayıklanan Ion geçerli (EIC) chromatograms görüntüsünü, chromatograms ihracat .csv olarak, otomatik toplu miktar açıkladı daha çok daha yararlı işlemleri gerçekleştirme yeteneğine sahiptir bileşikleri ve daha fazlası.

Bu el yazması sunulan Protokolü yalıtım bezleri veya bezi içindekiler--dan böcekler, volatilome analiz yanı sıra metaboliti kimlik odaklanan diğer araştırmacılar tarafından gerçekleştirilen deneyler için öneri olarak hizmet verebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için finansman Viyana bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF) LS13-048 için ISD aracılığıyla elde edildi. Özel teşekkür Diane W. Davidson (Utah Üniversitesi; şimdi emekli) için onun bilgisi Bornean COCY karıncalar hakkında bizimle paylaştığınız için gidin. İdareleri Kuala Belalong alan Araştırmalar Merkezi (KBFSC) ve proje onay için Universiti Brunei Sultanlığı (UBD) yanı sıra Brunei'nın Orman Bakanlığı ve Brunei'nın araştırma ve yenilik Merkezi karıncalar toplamak izin için teşekkür ederiz ve onay ve ihracat izni verilmesi. Özel teşekkür bizim araştırma kolaylaştırmak için UBD ve KBFSC personel, özellikle muhammed Salleh bin Abdullah yarasa, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei ve Kushan Tennakoon için gitmek.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tüp 50 ml, 115 x 28 mm, düz/konik tabanlı PPSarstedt62,559,001el yazmasındaki Şekil 1'e bakın
PVC BorularRehau290 4489el yazmasındaki Şekil 1'e bakın
Mesh, paslanmaz çelik, 0,63 mm mesh boyutuAntstore1000378el yazması Şekil 1'e bakın
DondurucuSeverinKS 9890 -20 ° C veya alt
polistiren köpük kutu, iç boyutlar 155 mm x 100 mm x 45 mmThorsten Koch4260308590481
Petri kabı, cam, 100 mm x 15 mmAldrichBR455742
Soğuk paket 150 mm x 100 mmElite Çantalar1998-20 ° C'ye kadar dondurun; C
Kırılmış buzlu
1,5 mL Kısa İplikli Şişeler, 32 x 11,6 mm, şeffaf cam, 1. hidrolitik sınıf, geniş açıklıkLa-Pha-Pack11090500
1,5 mL Kısa İplikli Şişeler için vidalı kapaklar, kapalı, Silikon beyazı/PTFE kırmızı septum, 55 derece kıyı A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151799
StereomikroskopBresser5806100
Forseps, Süper İnce Uçlu kavisliMedizinische Instrumente May, Norman MayPI-0005B
Forseps, Süper İnce Uçlu düzmaviINOXBL-3408
Diseksiyon iğnesi 140 mm, sivri, düzHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110301
Metanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haë nfisher bilimsel15654740
Damıtılmış su
Rotizell-Tissue-Tü cherCarl Roth GmbH + Co.KG0087.2
Asetik asit etil ester ROTISOLV ≥ 99,8 %CarlRoth GmbH + Co.KG4442.1-20 °C'ye kadar donma; C
Vortex Genie 2neoLab7-0092
1,5 mL Kısa İplikli Şişeler için 0,1 mL mikro uçlar, 31 x 6 mm, şeffaf cam, 1. hidrolitik sınıf, 15 mm uç La-Pha-Pack06090357
1,5 mL Kısa İplikli Şişeler için vidalı kapaklar, delikli, RedRubber / PTFE septum, & nbsp; 45 derece kıyı A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151819
Alkan standart çözüm C < sub>8< / sub>-C 20< / sub>Sigma-Aldrich 04070
Alkan standart çözümü C21-C40Sigma-Aldrich 04071
n-Hekzan SupraSolvMerck104371
GC-otomatik numune alma cihazı, örneğin MPS2XL-TwisterGerstel
Agilent Gaz kromatografı 6890 NAgilent
Deveboynu Bölünmez AstarRestek22406
Helyum (5.0 - F50)Messer102532501
GC kılcal kolon HP-5MS UI 30 m ve kez; 0,25 mm ve süreler; 0.25 ve mikro; mAgilent19091S-433UI
Agilent Kütle Seçici Dedektör 5975BAgilent
MSD ChemStation Veri Analizi Uygulama yazılımı Agilent
MetaboliteDetector yazılımı (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)Hiller Kindir:
MetabolitDetectorHiller Kİndirme: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
NIST kütüphanesi için MD Dönüştürme AracıHiller Kindir: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
kova için http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 Kalibrasyon Kitaplığı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
  2. Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
  3. Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).
  4. Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
  5. Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
  6. Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
  7. Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
  8. Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
  9. Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
  10. Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).
  11. Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
  12. Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
  13. Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).
  14. Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
  15. Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
  16. Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
  17. Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
  18. Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
  19. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  20. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  21. Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
  22. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
  23. Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
  24. Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
  25. Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
  26. Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
  27. Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GC MS AnaliziMetaboliteDetector Yaz l mKar nca DiseksiyonuSolvent EkstraksiyonuEtil Asetat EkstraksiyonuGaz KromatografisiK tle SpektrometrisiMetabolit Tan mlama

İlgili makaleler