Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Karbonhidrat analiz önemli ve zorlu bir konudur. Karbonhidrat ve onların türevleri yaşayan organizmalar^1,2,3önemli roller oyun olarak. Bu moleküllerin yapıları karmaşık ve çürümeye yatkındır. Birçoğu açıkça ayrılık ve algılama zorluklar nedeniyle karakterize olamaz. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI) kütle spektrometresi (MS) biomolecules, duyarlılık ve anlaşılır sonuçları⁴, geniş bir analizi uygulanmış olduğundan ne kadar karbonhidratlar MALDI-MS kullanarak analiz devam ediyor Böyle molekülleri⁵düşük iyonlaşma verimliliği nedeniyle büyük bir meydan okuma olacak. Kimyasal derivatization karbonhidrat^6,7iyonlaşma verimliliğini artırmak için sık kullanılan bir yöntemdir, ancak zaman ve örnek tüketen tür yordamlar vardır. Ayrıca, derivatized karbonhidrat iyonlaşma verimliliğini hala proteinlerin daha düşüktür. Bu nedenle, karmaşık prosedürler olmaksızın MALDI-MS karbonhidrat sinyallerinin geliştirilmesi için yöntemler geliştirilmesi gereklidir.

Kantitatif analiz MALDI-MS uygulamaya zor bir konudur. Bir büyük MALDI-MS onun duyarlılığı ve veri tekrarlanabilirlik eleştirel örnek hazırlama protokolleri ve deneysel parametreleri kullanır bir sorundur. Birçok durumda, kantitatif analiz MALDI-MS tarafından türdeş olmayan örnek türleri Morfoloji ve analit dağıtım nedeniyle güvenilmez olduğunu. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) maldı matris ile hazırlanan örnekleri iyi bilinen bir örnektir. DHB yavaş yavaş ortam bir ortamda kristalize zaman, çünkü sonuç örnekleri düzensiz türleri morfoloji ölçüde matris kristalleri içine analit şirketleşme, tahmin edilemez. Böyle örnekleri normalde büyük iğne şekilli ve güzel kristalleri oluşur. DHB uçucu solvent ve/veya ısıtmalı örnek plaka kullanılarak hazırlanan zaman hızlı bir kurutma işlemi daha homojen iyi kristaller ve daha iyi nicel sonuçları^8,9,10ile sonuçlanır. Bu teknik maldı örnekleri "rekristalizasyon" bilinir. İyileşme analitler hızlı kristalizasyon işlemi sırasında daha iyi birleşme iyi matris kristalleri içine atfedilir. Biz de örnek hazırlama ortamını ayarlama karbonhidrat sinyal ve geliştirilmiş nicel sonuçları^11,12heterojen azalma göstermiştir. Bu çalışmaların bulguları örnek morfoloji karbonhidrat sinyal kalitesini belirlemede önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Günlük analiz için genel bir strateji geliştirmek için geliştirilmiş karbonhidrat duyarlılık sağlayan bir verimli örnek reformasyon yöntemi gereklidir.

Sistematik olarak örnek Morfoloji ve karbonhidrat duyarlılık MALDI-MS bir son raporu¹³arasında korelasyon inceledik. Birkaç önemli karbonhidrat kullanılarak sonuçlar elde ve en iyi sinyal geliştirme recrystallizing tarafından yerine getirilir matrisleri Haritayı maldı örnekleri kurutulmuş. Geleneksel kurutulmuş damlacık (DD) yöntemi kullanılarak hazırlanan örnekleri morfolojisi metanol (MeOH) ile hızlı rekristalizasyon tarafından reform. Detaylı örnek hazırlama protokolleri burada gösterildiği. Protokol örnek plaka Önkoşullanma, örnek ifade ve rekristalizasyon ve kütle spektrometresi analizleri de dahil olmak üzere üç ana adımlardan oluşur. Kullanılan karbonhidrat sialyl-lewis bir (SLe^A) ve maltoheptaose (MH) içerir. DHB modeli matris kullanılır. Karbonhidrat sinyal yoğunluğu ve kayma dağıtım belirgin rekristalizasyon sonra geliştirilmiş sonuçlar gösterir. Böyle bir yöntem örnekleri 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) ve α- cyano-4-hydroxycinnamic asit gibi diğer popüler matrisleri ile uygulanabilir. Bu yöntem kolayca laboratuvar rutin karbonhidrat analiz için entegre edilebilir genel bir yaklaşım olarak hizmet vermektedir.

1. örnek plaka Önkoşullanma

1. Örnek plakası temizleme
   1. Temizleme sırasında kontaminasyon örnek plaka için nitril eldiven giymek.
   2. El-yıkama deterjan solüsyonu (1,0 mg/mL) 100,0 mL örnek plakalı.
   3. El-distile-deiyonize su (DDW) ile örnek tabak yıkama.
   4. Örnek plaka yüzeyi MeOH 30,0 mL ile yıkayın.
   5. Örnek plaka tamamen suya batırılır kadar 600 mL kabı ve dolgu ile DDW örnek plaka koymak.
   6. Kabı bir ultrasonik koymak ( tablo malzemelerigörmek) banyo ve örnek plaka 15 dk (200 W, 40 kHz) için solüsyon içeren temizleyicide.
   7. Örnek plaka almak ve basınçlı azot kullanarak su damlaları darbe.
   8. MeOH 0.2 µL MeOH diğer noktalar yayılır olup olmadığını denetlemek için örnek plaka üzerinde mevduat.
      Not: MeOH diğer noktalar ile birleştirir adımları 1.1.3-1.1.5 işlemini yineleyin; Eğer değilse, sonraki adıma geçin.
2. Kurutma odası sıcaklık düzenleme
   1. Kurutma odası istikrarlı koşullar altında damlacıkları,^11,12,13daha önce açıklandığı gibi kuru için kullanın. Özellikle, Ou, Y.-M 2.1-2,5 adımlarda açıklandığı ayrıntılı yordamı kullanın. vd. 2016¹². Kısaca:
      1. Kurutma odası oda sıcaklığında azot düşük bağıl nem ortam sağlamak için sürekli akış hızında tarafından tasfiye.
      2. Isı kontrollü bakır bloğunda kurutma odası tarafından düzenlenen örnek plaka sıcaklık sabiti normal - (25 ° C) veya hızlı kurutma koşulları (50 ° C), devam et.
3. Matris ve analit çözümleri hazırlanması
   1. Matris çözümleri hazırlanması
      1. DHB % 50 Asetonitril (ACN) dağıtılması: %50 0.1 M çözüm hazırlamak için DDW.
   2. Karbonhidrat analitler hazırlanması
      1. SLe^A 10^-4 M çözüm hazırlamak için DDW geçiyoruz.
      2. Bir 10^-4 M çözüm hazırlamak için DDW MH geçiyoruz.

2. örnek ifade ve rekristalizasyon

Not: Küçük ve düzenli miktarlarda örnekleri analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş yordamlar burada açıklanmıştır. Çözümler yatırma önce numune plaka sıcaklığı istenilen sıcaklıkta stabil emin olun. Örnek diğer örnek noktalar rekristalizasyon sırasında karşılamak için büyük bir alana yayılırsa, yeni bir örnek hazırlamak veya 1.1 arasındaki adımları yineleyin.

1. Küçük bir miktar (0.1 µL) örnek analizi için
   Not: örnek ve zaman tüketimi en aza indirmek için aşağıdaki adımları geliştirilmiştir. Kantitatif analiz sınırlı veya miktar analiz için hızlı IMS ile gerçek örnekleri için uygundur.
   1. DHB çözüm ve 0,25 SLe^A µL veya MH çözüm microcentrifuge tüp içinde 0.25 µL premix.
   2. Girdap 3 için bir girdap Mikser kullanarak karma çözüm s.
   3. Spin aşağı 2 için mini santrifüj karışık çözümde s (2000 x g).
   4. Premix çözüm 0.1 µL çizmek ve hemen örnek plaka üzerinde mevduat bir pipet kullanın.
      Not: Örnek küçük bir miktar yatırırken, Yapmak değil tutmak premix çözüm için 10 pipet ucu s.
   5. Örnek kurumasını bekleyin. Tipik kurutma kez Tablo 1' de listelenmiştir.
   6. MeOH 0.2 µL şu kurutulmuş örnek nokta yatırmak için bir pipet kullanın. Örnek alacak ıslak ve kuru hemen.
      Not: İfade yordamı 3'te tamamlandığını emin olmak MeOH önemli buharlaşma kaybı olmaması için s.
   7. Bir mikroskop kullanarak örnek inceleyin. Kristal türleri morfoloji olarak beklenen (bakınız Şekil 1 örneğin istenen sonuçları) yoksa, yeni bir örnek hazırlamak için 2.1.1-2.1.6 kadar olan adımları tekrarlayın.
   8. Nitril eldiven giymek ve dikkatle kurutma odası örnek tabaktan dışarı almak.
2. Düzenli bir miktar (1 µL) örnek analizi için
   Not: Aşağıdaki adım karbonhidrat örnekleri ile genellikle kullanılan maldı örnek miktar polimerlerin en üst düzeye çıkarma geliştirilir. Rutin ve kantitatif analizleri için uygun bir süreçtir. Rekristalizasyon işlemi örnekleri ve matrisleri büyük alanlar için eşit olarak yeniden dağıtır.
   1. DHB çözüm ve 2.5 µL SLe^A veya bir microcentrifuge tüp çözümde MH 2.5 µL premix.
   2. Girdap 5 için bir girdap karıştırıcılı premix çözüm s.
   3. Spin aşağı 2 için mini santrifüj karışık çözümde s (2000 x g).
   4. Premix çözüm 1.0 µL çizmek ve hemen örnek plaka üzerinde mevduat bir pipet kullanın.
      Not: yok kalan kullanım kılavuzuyla çözüm tekrar örnekleri yatırma sonra.
   5. Örnek kurumasını bekleyin. Tipik kurutma kez Tablo 1' de listelenmiştir.
   6. Şu kurutulmuş örnek nokta MeOH 1,5 µL yatırmak bir pipet kullanın. Örnek alacak ıslak ve kuru hemen.
      Not: Yüksek örnek plaka sıcaklık (50 ° C) durumlarda, rekristalizasyon adım 5 içinde yapılmalıdır s MeOH buharlaşma pipet ipucunda en aza indirmek için.
   7. Bir mikroskop kullanarak örnek inceleyin. Kristal türleri morfoloji olarak beklenen (bakınız Şekil 1 örneğin istenen sonuçları) yoksa, yeni bir örnek hazırlamak için 2.2.1-2.2.6 kadar olan adımları tekrarlayın.
   8. Nitril eldiven giymek ve dikkatle kurutma odası örnek tabaktan dışarı almak.

3. kütle spektrometresi veri toplama ve Analizi

Not: Analiz bir maldı İyon kaynağı ile donatılmış bir ticari uçuş zaman kütle spektrometre (Tablo reçetesi) kullanılarak gerçekleştirilir. Araç ön en iyi duruma getirilmiş ayıklama gecikme ve lazer enerjisi ile belirli kontrol yazılımı (Tablo reçetesi) tarafından işletilmektedir. Spectra m/z kitlesel bir dizi ile doğrusal modu kaydedilir = 0-1500. Örnek potansiyel ±25 plakadır keV ve her spektrum ortalama 10 lazer çekim. Kullanıcıların araç optimizasyonu ve uyumlu yazılım kullanarak örnek analiz yapmak ve araç üreticisinin yönergelerini izleyin.

1. Araç kontrol yazılımı açın (bkz. Tablo malzeme).
2. Örnek plaka kütle spektrometre yerleştirin.
3. Önceden en iyi duruma getirilmiş veri toplama yöntemi yazılımı seçin.
4. Tüm örnek bölge görüntüleme yazılımı kullanarak IMS için kayıt ( Tablo malzemelerigörmek).
   Not: IMS yapıyor yoksa bu adımı atlayın.
5. Veri toplama kontrol yazılımı toplu modunda başlatın.
6. İyon görüntüleri veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra görüntüleme yazılımı kullanarak çizmek.
7. Kitle spectra analiz yazılımı kullanarak analiz ( Tablo malzemelerigörmek) verileri bir iyon görüntü kaydedilirse.

SLeA temsilcisi SEM görüntüleri DD kullanılarak hazırlanan DHB ile karışık ve rekristalizasyon Yöntemler Şekil 1' de gösterilmektedir. Tipik bir DHB morfoloji DD yöntemi tarafından hazırlanan büyük iğne biçimli kristaller RIM ve örnek noktalar ortasına ince kristal yapıları var. İğne şeklindeki böyle kristallerinin tipik uzunluğu ~ 100 µm ' dir. MeOH tarafından rekristalizasyon sonra örnek eşit iyi pul gibi kristallerle kaplı geniş bir alanı vardır. "Pul" kristalleri uzunlukları kabaca 20-50 µm. Recrystallized örnekleri bu geleneksel DD örnekleri tarafından üretilen daha büyük etkili yüzey alanları sağlamak vardır.

IMS sonuçları, pul gibi kristalleri genellikle daha yüksek karbonhidrat sinyal şiddeti ve daha homojen bir kayma dağıtım neden gösterir. Geleneksel DD örnekleri, örnek noktalar çevre çoğunlukla karbonhidrat iyon sinyalleri dağıtılır. Şekil 2 SLe IMS sonuçlarını gösterirA ve MH ve MeOH rekristalizasyon olmadan. Rekristalizasyon sonra örnek SLeA dağılımı ve MH sinyalleri maç alan parlak görüntü ile de noktalar. Ayrıca, tüm recrystallized karbonhidrat örnekleri önemli geliştirmeler sinyal şiddeti DD örneklerinden elde edilen bu sonuçlar üzerinde göster. Daha yüksek sinyal şiddeti ve homojenliği nedeniyle, rekristalizasyon belirgin kantitatif analiz veri kalitesini artırır.

Rekristalizasyon tarafından karbonhidrat sinyal şiddeti arttırmak için her iki pozitif ve negatif iyon modu etkilidir. Şekil 3 sodiated (pozitif iyon modu) sinyal yoğunluğu ve deprotonated (negatif iyon modu) karbonhidratlar bu DD örnekleri ile ilgili recrystallized örnekleri karşılaştırır. Ortalama olarak, SLeA ve MH örnekleri in rekristalizasyon sodiated sinyalleri 3,9 ve 3.3, etkenlere göre sırasıyla artırır. SLeAdeprotonated için iyon sinyal genellikle rekristalizasyon sonra yaklaşık 4.7 bir faktör tarafından geliştirilmiştir.

Şekil 1. SLeA SEM görüntüleri DHB matris ile hazırlanmış. Örnekleri kurutulmuş damlacık ve rekristalizasyon yöntemleri ile hazırlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Temsili resim kütle spektrometresi ile hazırlanmışbir ve MH SLe, sonuçlarını kurutulmuş damlacık ve rekristalizasyon yöntemleri. İyon görüntüleri sodiated veya deprotonated analitler dağılımları temsil eder. Tüm alan parlak ve iyon görüntüler aynı ölçeğinde gösterilecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Karbonhidrat sinyal yoğunluklarda farklı örnek hazırlama yöntemleri ile elde edilen. Siyah barlar: sodiated SLeA (m/z: 843); Kırmızı çubuklar: deprotonated SLeA (m/z: 819); mavi çubuklar: sodiated MH (m/z: 1175). Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Deneysel parametreleri ve kurutma koşullar altında farklı örnek plaka temperatures.x

Yazarlar ifşa gerek yok.