Yöntem makalesi

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57660

⸱

29 Temmuz 2018

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

Bu makalede

Özet

Karbonhidrat iyon sinyalleri maldı kütle spektrometresi reform kristal yapılar tarafından örnek hazırlama sürecinde güçlendirmeye yönelik bir protokol gösterilmiştir.

Özet

Numune hazırlama karbonhidrat kütle spektrometresi (MS) analizi kritik bir süreçtir. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI) MS seçtiğiniz karbonhidrat analiz yöntemi olsa da, zavallı iyon sinyal ve veri tekrarlanabilirlik karbonhidrat örnekleri ciddi sorunlar olmaya devam etmektedir. Karbonhidrat kantitatif analiz için üstün veri kalite sağlayan etkili bir analitik Protokolü gereklidir. Bu video sinyal yoğunluğu artırmak ve veri değişim karbonhidrat MALDI-MS en aza indirmek için örnek hazırlanması protokolleri gösteriyor. Kurutma ve örnek damlacıkları kristalleşme sonra kristal morfoloji metanol kitle spektrometrik analiz önce reformlar yaptı. Karbonhidrat sinyalinde geliştirme maldı görüntüleme kütle spektrometresi ile (IMS) incelenir. Deneysel sonuçlar kristal reformasyon kristal yapıları ayarlar ve karbonhidrat analitler yeniden dağıtan gösterir. Geleneksel MALDI-MS, reform karbonhidrat kristal türleri morfoloji metanol gösterir önemli ölçüde daha iyi sinyal yoğunluğu, iyon görüntü dağıtım ve veri istikrar ile kurutulmuş damlacık hazırlama yöntemi ile karşılaştırıldığında. Burada gösterildiği protokollerin örnek kompozisyon değişiklikleri içermeyen beri onlar çeşitli karbonhidrat ve matrisleri genellikle tabidir.

Giriş

Karbonhidrat analiz önemli ve zorlu bir konudur. Karbonhidrat ve onların türevleri yaşayan organizmalar1,2,3önemli roller oyun olarak. Bu moleküllerin yapıları karmaşık ve çürümeye yatkındır. Birçoğu açıkça ayrılık ve algılama zorluklar nedeniyle karakterize olamaz. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI) kütle spektrometresi (MS) biomolecules, duyarlılık ve anlaşılır sonuçları4, geniş bir analizi uygulanmış olduğundan ne kadar karbonhidratlar MALDI-MS kullanarak analiz devam ediyor Böyle molekülleri5düşük iyonlaşma verimliliği nedeniyle büyük bir meydan okuma olacak. Kimyasal derivatization karbonhidrat6,7iyonlaşma verimliliğini artırmak için sık kullanılan bir yöntemdir, ancak zaman ve örnek tüketen tür yordamlar vardır. Ayrıca, derivatized karbonhidrat iyonlaşma verimliliğini hala proteinlerin daha düşüktür. Bu nedenle, karmaşık prosedürler olmaksızın MALDI-MS karbonhidrat sinyallerinin geliştirilmesi için yöntemler geliştirilmesi gereklidir.

Kantitatif analiz MALDI-MS uygulamaya zor bir konudur. Bir büyük MALDI-MS onun duyarlılığı ve veri tekrarlanabilirlik eleştirel örnek hazırlama protokolleri ve deneysel parametreleri kullanır bir sorundur. Birçok durumda, kantitatif analiz MALDI-MS tarafından türdeş olmayan örnek türleri Morfoloji ve analit dağıtım nedeniyle güvenilmez olduğunu. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) maldı matris ile hazırlanan örnekleri iyi bilinen bir örnektir. DHB yavaş yavaş ortam bir ortamda kristalize zaman, çünkü sonuç örnekleri düzensiz türleri morfoloji ölçüde matris kristalleri içine analit şirketleşme, tahmin edilemez. Böyle örnekleri normalde büyük iğne şekilli ve güzel kristalleri oluşur. DHB uçucu solvent ve/veya ısıtmalı örnek plaka kullanılarak hazırlanan zaman hızlı bir kurutma işlemi daha homojen iyi kristaller ve daha iyi nicel sonuçları8,9,10ile sonuçlanır. Bu teknik maldı örnekleri "rekristalizasyon" bilinir. İyileşme analitler hızlı kristalizasyon işlemi sırasında daha iyi birleşme iyi matris kristalleri içine atfedilir. Biz de örnek hazırlama ortamını ayarlama karbonhidrat sinyal ve geliştirilmiş nicel sonuçları11,12heterojen azalma göstermiştir. Bu çalışmaların bulguları örnek morfoloji karbonhidrat sinyal kalitesini belirlemede önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Günlük analiz için genel bir strateji geliştirmek için geliştirilmiş karbonhidrat duyarlılık sağlayan bir verimli örnek reformasyon yöntemi gereklidir.

Sistematik olarak örnek Morfoloji ve karbonhidrat duyarlılık MALDI-MS bir son raporu13arasında korelasyon inceledik. Birkaç önemli karbonhidrat kullanılarak sonuçlar elde ve en iyi sinyal geliştirme recrystallizing tarafından yerine getirilir matrisleri Haritayı maldı örnekleri kurutulmuş. Geleneksel kurutulmuş damlacık (DD) yöntemi kullanılarak hazırlanan örnekleri morfolojisi metanol (MeOH) ile hızlı rekristalizasyon tarafından reform. Detaylı örnek hazırlama protokolleri burada gösterildiği. Protokol örnek plaka Önkoşullanma, örnek ifade ve rekristalizasyon ve kütle spektrometresi analizleri de dahil olmak üzere üç ana adımlardan oluşur. Kullanılan karbonhidrat sialyl-lewis bir (SLeA) ve maltoheptaose (MH) içerir. DHB modeli matris kullanılır. Karbonhidrat sinyal yoğunluğu ve kayma dağıtım belirgin rekristalizasyon sonra geliştirilmiş sonuçlar gösterir. Böyle bir yöntem örnekleri 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) ve α- cyano-4-hydroxycinnamic asit gibi diğer popüler matrisleri ile uygulanabilir. Bu yöntem kolayca laboratuvar rutin karbonhidrat analiz için entegre edilebilir genel bir yaklaşım olarak hizmet vermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. örnek plaka Önkoşullanma

  1. Örnek plakası temizleme
    1. Temizleme sırasında kontaminasyon örnek plaka için nitril eldiven giymek.
    2. El-yıkama deterjan solüsyonu (1,0 mg/mL) 100,0 mL örnek plakalı.
    3. El-distile-deiyonize su (DDW) ile örnek tabak yıkama.
    4. Örnek plaka yüzeyi MeOH 30,0 mL ile yıkayın.
    5. Örnek plaka tamamen suya batırılır kadar 600 mL kabı ve dolgu ile DDW örnek plaka koymak.
    6. Kabı bir ultrasonik koymak ( tablo malzemelerigörmek) banyo ve örnek plaka 15 dk (200 W, 40 kHz) için solüsyon içeren temizleyicide.
    7. Örnek plaka almak ve basınçlı azot kullanarak su damlaları darbe.
    8. MeOH 0.2 µL MeOH diğer noktalar yayılır olup olmadığını denetlemek için örnek plaka üzerinde mevduat.
      Not: MeOH diğer noktalar ile birleştirir adımları 1.1.3-1.1.5 işlemini yineleyin; Eğer değilse, sonraki adıma geçin.
  2. Kurutma odası sıcaklık düzenleme
    1. Kurutma odası istikrarlı koşullar altında damlacıkları,11,12,13daha önce açıklandığı gibi kuru için kullanın. Özellikle, Ou, Y.-M 2.1-2,5 adımlarda açıklandığı ayrıntılı yordamı kullanın. vd. 201612. Kısaca:
      1. Kurutma odası oda sıcaklığında azot düşük bağıl nem ortam sağlamak için sürekli akış hızında tarafından tasfiye.
      2. Isı kontrollü bakır bloğunda kurutma odası tarafından düzenlenen örnek plaka sıcaklık sabiti normal - (25 ° C) veya hızlı kurutma koşulları (50 ° C), devam et.
  3. Matris ve analit çözümleri hazırlanması
    1. Matris çözümleri hazırlanması
      1. DHB % 50 Asetonitril (ACN) dağıtılması: %50 0.1 M çözüm hazırlamak için DDW.
    2. Karbonhidrat analitler hazırlanması
      1. SLeA 10-4 M çözüm hazırlamak için DDW geçiyoruz.
      2. Bir 10-4 M çözüm hazırlamak için DDW MH geçiyoruz.

2. örnek ifade ve rekristalizasyon

Not: Küçük ve düzenli miktarlarda örnekleri analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş yordamlar burada açıklanmıştır. Çözümler yatırma önce numune plaka sıcaklığı istenilen sıcaklıkta stabil emin olun. Örnek diğer örnek noktalar rekristalizasyon sırasında karşılamak için büyük bir alana yayılırsa, yeni bir örnek hazırlamak veya 1.1 arasındaki adımları yineleyin.

  1. Küçük bir miktar (0.1 µL) örnek analizi için
    Not:     örnek ve zaman tüketimi en aza indirmek için aşağıdaki adımları geliştirilmiştir. Kantitatif analiz sınırlı veya miktar analiz için hızlı IMS ile gerçek örnekleri için uygundur.
    1. DHB çözüm ve 0,25 SLeA µL veya MH çözüm microcentrifuge tüp içinde 0.25 µL premix.
    2. Girdap 3 için bir girdap Mikser kullanarak karma çözüm s.
    3. Spin aşağı 2 için mini santrifüj karışık çözümde s (2000 x g).
    4. Premix çözüm 0.1 µL çizmek ve hemen örnek plaka üzerinde mevduat bir pipet kullanın.
      Not: Örnek küçük bir miktar yatırırken, Yapmak değil tutmak premix çözüm için 10 pipet ucu s.
    5. Örnek kurumasını bekleyin. Tipik kurutma kez Tablo 1' de listelenmiştir.
    6. MeOH 0.2 µL şu kurutulmuş örnek nokta yatırmak için bir pipet kullanın. Örnek alacak ıslak ve kuru hemen.
      Not: İfade yordamı 3'te tamamlandığını emin olmak MeOH önemli buharlaşma kaybı olmaması için s.
    7. Bir mikroskop kullanarak örnek inceleyin. Kristal türleri morfoloji olarak beklenen (bakınız Şekil 1 örneğin istenen sonuçları) yoksa, yeni bir örnek hazırlamak için 2.1.1-2.1.6 kadar olan adımları tekrarlayın.
    8. Nitril eldiven giymek ve dikkatle kurutma odası örnek tabaktan dışarı almak.
  2. Düzenli bir miktar (1 µL) örnek analizi için
    Not: Aşağıdaki adım karbonhidrat örnekleri ile genellikle kullanılan maldı örnek miktar polimerlerin en üst düzeye çıkarma geliştirilir. Rutin ve kantitatif analizleri için uygun bir süreçtir. Rekristalizasyon işlemi örnekleri ve matrisleri büyük alanlar için eşit olarak yeniden dağıtır.
    1. DHB çözüm ve 2.5 µL SLeA veya bir microcentrifuge tüp çözümde MH 2.5 µL premix.
    2. Girdap 5 için bir girdap karıştırıcılı premix çözüm s.
    3. Spin aşağı 2 için mini santrifüj karışık çözümde s (2000 x g).
    4. Premix çözüm 1.0 µL çizmek ve hemen örnek plaka üzerinde mevduat bir pipet kullanın.
      Not: yok kalan kullanım kılavuzuyla çözüm tekrar örnekleri yatırma sonra.
    5. Örnek kurumasını bekleyin. Tipik kurutma kez Tablo 1' de listelenmiştir.
    6. Şu kurutulmuş örnek nokta MeOH 1,5 µL yatırmak bir pipet kullanın. Örnek alacak ıslak ve kuru hemen.
      Not: Yüksek örnek plaka sıcaklık (50 ° C) durumlarda, rekristalizasyon adım 5 içinde yapılmalıdır s MeOH buharlaşma pipet ipucunda en aza indirmek için.
    7. Bir mikroskop kullanarak örnek inceleyin. Kristal türleri morfoloji olarak beklenen (bakınız Şekil 1 örneğin istenen sonuçları) yoksa, yeni bir örnek hazırlamak için 2.2.1-2.2.6 kadar olan adımları tekrarlayın.
    8. Nitril eldiven giymek ve dikkatle kurutma odası örnek tabaktan dışarı almak.

3. kütle spektrometresi veri toplama ve Analizi

Not: Analiz bir maldı İyon kaynağı ile donatılmış bir ticari uçuş zaman kütle spektrometre (Tablo reçetesi) kullanılarak gerçekleştirilir. Araç ön en iyi duruma getirilmiş ayıklama gecikme ve lazer enerjisi ile belirli kontrol yazılımı (Tablo reçetesi) tarafından işletilmektedir. Spectra m/z kitlesel bir dizi ile doğrusal modu kaydedilir = 0-1500. Örnek potansiyel ±25 plakadır keV ve her spektrum ortalama 10 lazer çekim. Kullanıcıların araç optimizasyonu ve uyumlu yazılım kullanarak örnek analiz yapmak ve araç üreticisinin yönergelerini izleyin.

  1. Araç kontrol yazılımı açın (bkz. Tablo malzeme).
  2. Örnek plaka kütle spektrometre yerleştirin.
  3. Önceden en iyi duruma getirilmiş veri toplama yöntemi yazılımı seçin.
  4. Tüm örnek bölge görüntüleme yazılımı kullanarak IMS için kayıt ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: IMS yapıyor yoksa bu adımı atlayın.
  5. Veri toplama kontrol yazılımı toplu modunda başlatın.
  6. İyon görüntüleri veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra görüntüleme yazılımı kullanarak çizmek.
  7. Kitle spectra analiz yazılımı kullanarak analiz ( Tablo malzemelerigörmek) verileri bir iyon görüntü kaydedilirse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

SLeA temsilcisi SEM görüntüleri DD kullanılarak hazırlanan DHB ile karışık ve rekristalizasyon Yöntemler Şekil 1' de gösterilmektedir. Tipik bir DHB morfoloji DD yöntemi tarafından hazırlanan büyük iğne biçimli kristaller RIM ve örnek noktalar ortasına ince kristal yapıları var. İğne şeklindeki böyle kristallerinin tipik uzunluğu ~ 100 µm ' dir. MeOH tarafından rekristalizasyon sonra örnek eşit iyi pul gibi kristallerle kaplı geniş bir alanı vardır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Örnek heterojenite maldı-Bayan DD çok önemli bir sorun en sık kullanılan örnek hazırlama yöntemi, ama sonuç kristalleri son derece heterojen olmasıdır. Böyle örnekleri zavallı atış-to-shot ve örnek örnek sinyal tekrarlanabilirlik göster. Bu nedenle, veri toplama sırasında "tatlı noktalar" örnek alanlarda arama ortak bir maldı deneylerde yöntemidir. Miktar rutin analizleri için uygun olmayan türdeş olmayan böyle örneklerindendir.

Mevcut çalışmada, maldı örnek morfoloji rekristalizasyon tarafınd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar hiçbir katkıda bulunanlar var.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif< / güçlü >
Deterjan tozuAlconox242985
MetanolMerck106009
AsetonitrilMerck100003
2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB)Alfa AesarA11459
sialil-lewis A (SLeA< / sup>)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
Pipet uçlarıMettler Toledo17005091
Mikrosantrifüj tüpüAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q su arıtma sistemiMilliporeZMQS6VFT1
Pudrasız nitril eldivenMicroflexSU-690
600 mL beherDuran2110648
Ultrasonik temizleyiciDeltaDC300H
HigrometreWisewind5330
Azot gazı akış ölçerDwyerRMA-6-SSV
K-tipi termokupllarDigitron311-1670
Vorteks karıştırıcıBilimsel Endüstriler  SI-0236
Mini santrifüjSelect BioProductsForce Mini 
PipetRaininpipet-lite XLS
StereomikroskopOlympusSZX16
Sıcaklık kontrollü kurutma odasıBu laboratuvar
Ultraflex II TOF/TOF kütle spektrometresiBruker Daltonics
MTP 384 hedef plakası cilalı çelik BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Sürüm 3.4Bruker DaltonicsControl yazılımı
Fleximaging Sürüm 2.1Bruker DaltonicsGörüntüleme yazılımı
Flexanalysis Sürüm 3.4Bruker DaltonicsAnaliz yazılımı

Kaynaklar

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MALDI K tle SpektrometrisiKarbonhidrat AnaliziKristal Yeniden Olu umuMetanol UygulamasSinyal Art r mG r nt leme K tle SpektrometrisiKurutulmu Damla Y ntemiUltrasonik BanyoMikroskop ncelemesi

İlgili makaleler