Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı

12.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57675

⸱

4 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application, National Demonstration Center for Experimental Plant Production Education, Beijing University of Agriculture, 2College of Plant Protection, State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Pest Monitoring and Green Management, China Agricultural University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, bitki virülans bitki patojeni ile test etmek için bir iletişim kuralı mevcut Magnaporthe grisea. Bu rapor mantarlar yalıtır pathotypes büyük ölçekli tarama için katkıda bulunmak ve moleküler ıslahı sırasında bitkilerin dirençli mekanizmaları anlamak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet.

Özet

Bitkiler tarafından patojen mantarlar olası tehditlere karşı kendilerini savunmak için güçlü bir sistemi sahip. Heilbroner önemli bitkiler, ancak, böyle patojenler mücadele için geçerli önlemler çok muhafazakar kanıtladık ve, böylece, değil yeterince etkili ve potansiyel olarak çevresel riskler doğurabilir. Bu nedenle, kontrol bitki hastalıklarının doğal olarak dayanıklı Pangenez tanımlaması, yalıtım ve direnç genleri karakterizasyonu ve moleküler üreme yoluyla yardımcı olan ana bilgisayar-direnç faktörleri tanımlamak son derece gereklidir dayanıklı çeşitlerin. Bu bağlamda, işte doğurmak ve bitki direnç genleri geliştirmek için doğru hızlı ve büyük ölçekli aşılama yöntemi kurmanız gerekir. Pirinç mantar patojen Magnaporthe grisea nedenleri ciddi hastalık belirtileri şok ve kayıp verim. Son zamanlarda, M. grisea bitki mantar patojen etkileşim mekanizmaları eğitim için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, biz geliştirme, M. griseaiçin belirli bir bitki virülans test yönteminin raporu. Conidial süspansiyon ile sprey aşı ve yaralama aşılama miselyum küpleri veya conidial süspansiyon damlacıkları ile bu yöntem sağlar. Yaralama aşılama yöntemi müstakil pirinç yaprakları için önemli bir adım olan ana bilgisayar penetrasyon direnci tarafından neden herhangi bir müdahale önler bitki yaprakları, yaraya yapmaktır. Bu sprey yaralama/iletişim kuralı M. grisea yalıtır pathotypes hızlı, doğru ve büyük ölçekli tarama için katkıda bulunur. Bu entegre ve sistematik bitki bulaşma yönteminin içinde bitki patoloji konuların geniş bir bakış açısı kazanmak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet verecek.

Giriş

Pirinç patlama, M. griseatarafından neden pirinç çeşitleri Dünya çapında1,2için en ciddi hastalıklardan birisidir. Conidia üretim ve yüzey eki, conidia çimlenme ve appressorium oluşumu, penetrasyon peg ve bulaşıcı hypha farklılaşma, bir oluşum hangi ana bitkiler M. grisea bulaşan işlemi içerir ve bir hastalık yaymak 3. tüm bu aşamaların birçok diğer bitki patojenik mantar yaygındır ve gerçekten de, herhangi bir tek kademeli bir abluka ana bitkiler enfeksiyonu önler. Ekonomik önemi ve genetik tractability sayesinde M. grisea bitki mantar patojen etkileşimleri1,4mekanizmaları eğitim için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, bu gelişim aşamalarında M. grisea olarak moleküler temeli eğitim mantar patojen ve kimlik tarama ve tasarımı roman için aday hedef genlerin temel moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olacak Mantar ilaçları5.

Son raporlar M. grisea enfeksiyon ile ilgili ön penetrasyon aşamaları, özellikle conidiation, appressorium formasyonu, penetrasyon mandal ve bulaşıcı büyüme3, moleküler mekanizmaları üzerinde odaklanmıştır 6. bu nedenle, M. grisea enfeksiyon sınamak için detaylı bir protokol geliştirmek için önemlidir. Burada, biz karşı conidial bir süspansiyon ve yaralar aşılama M. griseamycelial fişleri ile sprey-aracılı enfeksiyon deneyleri kullanan enfeksiyon testi için detaylı bir yöntem mevcut. Bu raporda, kültür conidiation çözüm püskürtme için hazırlanması ve M. griseaile bitkilerin mycelial tak-aracılı aşı suşları, protokol odaklanır. Aşağıdaki adımları aşağıda ayrıntılı ve tüm iş akışı yöntemi gösterilen bir şematik açıklanmış ve tipik bir lezyon gösterilir rakamlar 1 ve 2, sırasıyla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. sprey aşı M. grisea Conidia süspansiyon

  1. Mantar kültürü M.grisea için
    1. Yulaf ezmesi domates agar (OTA) kültür orta mantar suşları için hazırlayın.
    2. Yulaf ezmesi 30-50 g ağırlığında, bu 800 mL distile/deiyonize su (GKD2O) ekleyin ve karışımı için 30 dk içinde elektrik pot kaynatın.
    3. Gazlı bez bir parça aracılığıyla kabı içine haşlanmış yulaf ezmesi suyu filtre.
    4. Ölçek filtrate 150 mL domates suyu ve agar 20 g ekleyin ve eklemek GKD2O kadar 1000 mL.
  2. Deneysel malzeme hazırlanması
    1. Pirinç (Oryza sativa) çeşidinde Lijiangxintuan-heigu (LTH) GKD2O 3 d için yaklaşık 50 tohumları tadını çıkarın veya arpa yaklaşık 50 tohumları ıslatın (Hordeum vulgare cv altın söz) GKD2O 1 d için.
    2. Pirinç veya arpa tohumları içinde nemli gazlı bez sarın ve onları çapı 10 cm x 10 cm 28 ° C'de yaklaşık 30 Petri yemeklerinde nemli filtre kağıt üzerinde çimlenme Pirinç tohum çimlenme süresi yaklaşık 2-3 d, arpa tohum çimlenme süresi yaklaşık 2 d. Sera içinde bağıl nem oranı yaklaşık % 70 olduğunu.
    3. Pirinç veya arpa Fideler autoclaved Çömlekçilik toprak ve sulama kullanmak kaplarda bitki ve sonra onları vermikülit bir tabaka ile kaplayın.
    4. Bitkiler bir uygun glasshouse veya büyüme yaklaşık 1 için 25 ° C'de kabine koyun ~ 2 hafta.
    5. Filtre kağıdı çevrelerin 3 kat (her daire bir 8 cm çapında olmalı) Steril Cerrahi makas ile kesme ve 100 mm Steril plastik tabaklar koyun.
    6. GKD2O filtre kağıdı emmek için her yemeğin için ekleyin.
    7. Filtre kağıdı tamamen ıslak olduğundan emin olun ama hiçbir ilave su ekleyin.
    8. Bir vakum pompası ile herhangi bir fazla suyu kaldırın.
    9. Place 2 steril kürdan pirinç/arpa desteklemek için kültür çanak içine bırakır; Kürdan uzay ~ 2-3 cm arayla.
    10. Tohum Ekim sonra 2 hafta pirinç yaprakları toplamak veya tohum Ekim sonra yapraklarını arpa 7 d almak.
    11. 4 - 6 yaprak fidan pirinç/arpa kullanarak ~ 5 cm üst alt kısmındaki kök kesmek ve yaprakları toplamak.
  3. Sprey aşı Protokolü
    1. OTA plakaları termostatik kuluçka (25 ° C) ~ 4 d için mantar strain kültür.
    2. GKD2bir 0.5 - 5 mL pipet her 4 bayat plaka kullanarak O ~ 2 mL ekleyin.
    3. Bir aşı döngü ile mycelia enkaz mycelia M. grisea vahşi tipi zorlanma ve mutant suşu kazı.
    4. Mycelia enkaz toplamak ve yeni bir OTA tabağa aktarın. Mycelia enkaz ve darbe kuru temiz tezgah al.
    5. Gazlı bez bir sera 25 ° c (14 saat) gün ve 23 ° C conidia büyüme için 24-48 h gecelik (10 h) için gerekli nem sağlamak için 3 kat ile plaka kapak.
    6. Her yemek için GKD2O 2 mL ekleyin ve conidia yavaşça bir filtrasyon objektif kağıt 2 katmanı üzerinden takip steril pamuk temizleme bezi ile kazımak. Kültür ortamının yuzeysel değil dikkatli olun.
    7. Conidia süspansiyon 100-1000 µL pipet ile yeni bir 50 mL tüp içine aktarın.
    8. 5000 x g 25 ° C'de en az 5 dk santrifüj
    9. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 2 x 104 conidia mL başına %0,025 (v/v) ara-20 çözüm vermek için resuspend. Ara-20 genellikle yaklaşık 10-20 mL çözümdür.
    10. Spor süspansiyon el püskürtücü dökün.
    11. Yaklaşık 10 mL conidial süspansiyon üzerine 2 haftalık pirinç fidan veya arpa pirinç yaprakları yaprakları 7 bayat arpa fidan spay ve onları kontrol tertibatları (v/v) ara-20 çözüm % 0,025 ile 25 ° c ~ 24 h. sprey için karanlık, nemli bir odasında kuluçkaya.
    12. 12 h bir photoperiod için 25 ° c floresan ışığı altında başka bir nemli odasına yapraklarını aktarın.
    13. 5 d, hastalık belirtileri aşılama sonra kaydedin. ~ 6 cm uzunluğunda hastalıklı pirinç/arpa bıçaklar inceleyin. Standart değerlendirme skorlama sistemi uluslararası pirinç Araştırma Enstitüsü (IRRI) için patlama direnci için göre yapılır. Patlama direnci için Puanlama sistemini ayrıntılarını Tablo 1' de gösterilmiştir.
    14. Yaprak test suşlarının enfeksiyon değerlendirmek için fotoğraf. Enfeksiyon lezyonlar 3.6 cm2başına sayısına göre değerlendirildi.

2. aşı miselyum küpleri veya damlacıklar Conidial süspansiyon, M. grisea yaralama

  1. Anatomik bir iğne kullanarak, üç 2-3 cm ana damarlar müstakil pirinç/arpa yaprak uzun yaralarda kazımak; yaprakları nüfuz değil için dikkat ediniz.
  2. Alıntı yaprakları kürdan üzerinde koymak ve %0.02 (v/v) ara-20 çözüm damlacıkları bir tabaka oluşturmak için yaprakların üzerine sprey.
  3. 0.5 cm x 0.5 cm mycelial tak her M. grisea zorlanma (vahşi-türü, mutasyona uğramış, tamamlayıcı suşları veya diğer test suşlarının) için bir OTA plaka kes.
  4. Mycelial fiş koymak veya 25 µL damlacıkları conidial süspansiyon üzerine yaralı bırakır ve yapraklar 3-8 d için nemli bir odasında 25 ° C'de kuluçkaya.
  5. 5-7 d sonrası aşılama, lezyonlar inceleyin. Sprey aşı yöntemi için olduğu gibi muayene yöntemi aynıdır (bkz. Adım 1.3.13).
  6. ~ 6 cm uzunluğunda hastalıklı pirinç/arpa bıçaklar incelemek ve fotoğraf onları test suşlarının enfeksiyon değerlendirmek için. Enfeksiyon lezyonlar 3.6 cm2başına sayısına göre değerlendirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm iş akışı tekniği için Şekil 1' de gösterilen. 14 günlük eski duyarlı pirinç fidan üzerinde bitki enfeksiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir (O. sativa cv CO-39) veya duyarlı 7 bayat arpa bırakır (H. vulgare cv altın söz)7,8,9. Enfeksiyon pirinç yapraklarda sınamak için bir conidial askıya (1.0 x 105 Sporlar/mL) M. grisea vahşi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bitki hastalık direnç genleri fungal patojenlerin1,12de dahil olmak üzere patojenlerin enfeksiyon önlemede önemli bir rol oynamaktadır. Pirinç patlama patojen nüfus yapıları doğasını anlamak ve bitki direnç genleri4belirlemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, hastalık direnci genotip ve avirulence genotip sürekli ekili olabilir hastalığı dayanıklı bitkiler tanımlamak için büyük ölçüde tarım bitkilerin ana çeşitlerinin incel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser özel bilimsel araştırma projesi Pekin Tarım Üniversitesi (YQ201603) ve bilimsel proje Pekin Eğitim Komitesi (KM201610020005) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Filtre kağıdıGE Healthcare markası(İsveç)   
50 mL tüpCORNING(Amercia)430290
SantrifüjEppendorf(Amercia)5804R
Kültür kabıThermofisher(Amercia)150326
0,5-5 mL pipetEppendorf 
100-1000uL pipetEppendorf4920000083
Vakum pompasıLeyboldD25B
Diseksiyon iğnesiFST26000-35
İnkübatörMEMMERTPYX313
Aşılama halkasıGreiner Bio One731175
103113874920000105

Kaynaklar

  1. Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
  2. Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401(2009).
  3. Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
  4. Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
  5. Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
  6. Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
  7. Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
  8. Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
  9. Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
  10. Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
  11. Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430(2016).
  12. Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
  13. Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
  14. Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
  15. Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
  16. Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
  17. Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
  18. Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sprey İnokülasyonuKonidyal SüspansiyonMiselyal PlugAyrılmış Pirinç YapraklarıPatotip TaramasıPirinç Yanıklık HastalığıBitki Patojen Etkileşimi
Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.