Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Üretimi cardiomyocytes tanımlanmış kalp alan kökenli ve fonksiyonel insan pluripotent kök hücreler elde edilen kalp ataları büyük miktarda hücre tabanlı kardiyak terapiler ve hastalık modelleme için önceden gerekli olduğunu. Son zamanlarda kimliği genler gerekli ve omurgalı geliştirme sırasında ilk kalp alan ataları belirtmek yeterli olduğunu göstermiştir. Bu farklılaşma protokolü bu bulgular güçlendirir ve ID1 overexpression beraber aktivin A güçlü belirten cues olarak ilk kalp alan benzeri (FHF-L) ataları üretmek için kullanır. Önemlisi, ortaya çıkan ataları verimli (~ 70-%90) ventrikül benzeri cardiomyocytes ayırt etmek. Burada ayrıntılı bir yöntem 1) oluşturmak ID1-overexpressing hPSCs ve 2) ayırt ölçeklenebilir miktarda cryopreservable FHF-L ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes açıklayın.
Giriş
Büyük ölçekli üretim insan pluripotent kök hücre (hPSCs)-türetilmiş kardiyak ataları ve cardiomyocytes olan kök hücre tabanlı terapiler1,2,3 ve hızlı karakterizasyonu modelleme hastalığı için önceden gerekli Kardiyak farklılaşma4,5,6 ve Fizyoloji7,8düzenleyen yeni yollar. Her ne kadar bir dizi çalışmalar9,10,11,12
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. ID1 virüs hazırlık ve enfeksiyon
- ID1 overexpressing lentivirus birlikte transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G ve pCDH-EF1-ID1-PGK-PuroR oluşturmak (Addgene: plazmid #107735) HEK293T hücreye. Viral parçacıkların toplamak, filtrate, süpernatant arındırmak ve olduğu gibi Kitamura vd. -80 ° C'de depolayın (2003) 19. alternatif olarak, ID1 lentivirus ticari olarak pCDH-EF1-ID1-PGK-PuroR lentivirus üreten bir satıcıya göndererek üretmek.
Uyarı: Lütfen lentiviral güvenlik düzenlemeleri ve standart operasyon iletişim kuralları izleyin.
Not: Önemli: en iyi virüs titresi-meli var olmak hiç olmazsa 108 -109 Tran....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
HPSCs nesil ID1 satırları
hPSCs ID1 overexpression (Şekil 1A) arabuluculuk bir lentivirus bulaşmış. Bir kez hPSCID1 oluşturulur, transgene ifade qRT-PCR (Şekil 1B) sayılabilir. Yalnızca hPSCID1 satırları ID1 mRNA GAPDH of 0.005 kat büyük seviyelerde ifade farklılaşma için kullanılmalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Başarılı saptamaları için yakından yukarıda listelenen yönergeleri izleyin emin olun. Ayrıca, burada biz güçlü etkisi farklılaşma sonuçlar anahtar parametreleri vurgulayın. Bir farklılaşma başlamadan önce aşağıdaki üç morfolojik parametreleri dikkat edilmelidir: hPSCsID1, yüksek hücresel sıkıştırma ve yüksek bir izdiham bir kök morfolojisi (> % 90) gün 0 kültürünün. Bu konuda en iyi farklılaşma koşulları en iyi ayrışmış kaplama hPSCsID1 tek hücreler olarak oluşturulur ve onları sıkıca forma izin büy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz yararlı tartışmalar Colas laboratuvar üyeleri ve kritik değerlendirme şekilde alt alta yazılmalıdır teşekkür ederim. Bu çalışmada NIH/NIEHS R44ES023521-02 tarafından desteklenen ve Dr Colas CIRM DISC2-10110 verir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ACTC1 antikoru | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Kök Hücre Teknolojileri | Hu Recom Activin A | |
| Antibiyotik Antimikotik (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 takviyesi insülini olmadan Thermo | Fisher Scientific A1895601 | ||
| B27 takviyesi - A vitamini Thermo | Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antikoru | R& D Sistemleri | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Kök Hücre Teknolojileri | 7930 | Kriyoprezervasyon reaktifi |
| DMEM yüksek Glikoz Mediatech | 10-013-CV | ||
| DPBS, Ca & ile Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membran potansiyel kiti ve nbsp; | Thermo Fisher Scientific | F10488 | Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için lütfen McKeithan ve ark. 2017 |
| KnockOut Serum Replasmanı | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Büyüme Faktörü Azaltılmış | Corning | 356231 | Kaplama reaktifi |
| mTeSR1 medya kiti | Kök Hücre Teknolojileri | 5850 | |
| PBS, Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | ||
| Puromisin & | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Kök Hücre Teknolojileri | 5872 | Enzim içermeyen ayrışma reaktifi |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antikoru | Abcam | ab14106 | |
| Tiazovivin | Kök Hücre Teknolojileri | 72254 | RHO / ROCK yolu inhibitörü |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzim içeren ayrışma reaktifi |
| Tyrodes çözelti karışım paketleri | Sigma | T2145-10X1L | (Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için lütfen McKeithan et al. 2017'ye bakın) |
Kaynaklar
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
