Method Article

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

DOI:

10.3791/57698

⸱

May 7th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan - beyin bariyerini (BBB) çeşitli patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bariyer dokudur. Bu uyaranlara kaynaklanan bu tür değişiklikler büyük ölçüde ilaç dağıtım beyne modüle ve, uzantısı tarafından (CNS) hastalıkları merkezi sinir sistemi tedavisinde önemli sorunlar neden. Farmakoterapi, etkileyen birçok BBB değişiklikler lokalize ve endotel hücre düzeyinde ifade proteinleri içerir. Gerçekten de, böyle bir bilgiye BBB fizyolojisi sağlığı ve hastalıkları üzerinde insan bu membran proteinlerinin büyük ilgi yol açtı. Bir temel bilim araştırma açısından bu deneysel hayvan--dan hasat beyin dokusundan yüzdeki yalıtım için basit ama güçlü ve tekrarlanabilir bir yöntem için bir gereklilik anlamına gelir. Taze izole yüzdeki membran örnekleri hazırlamak için bu örnek hazırlıklar endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ama nörovasküler birimi (astrocytes, microglia, nöronlar, varlığında diğer hücre tipleri sınırlı esastır perisitlerden). Bir yararı protein ifadesi deneysel bir nüfus içinde gerçek değişkenliği yakalamak için bireysel hayvanlardan örnekleri hazırlamak için yeteneğidir. Bu el yazması kullanılmaktadır sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntem ile ilgili ayrıntılar sağlanmaktadır. Örneklerinden elde edilen, microvessel zenginleştirme dextran örnek arabellekte nerede dahil dört Santrifüjü adımlar kullanılarak elde edilir. Bu iletişim kuralı diğer laboratuvarlar için kendi özel uygulamalar tarafından kolayca adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı oluşturulan örnekleri üzerinden BBB yanıt fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara karşı anlayış büyük ölçüde yardımcı olabilir protein analizi deneyler sağlam deneysel veri vermeye gösterilmiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan - beyin bariyerini (BBB), merkezi sinir sistemi (MSS) ve sistemik dolaşımı arasındaki arayüzü var ve beyin homeostazı bakım içinde önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, BBB işlevleri tam olarak kontrol çözünen konsantrasyonları beyin hücre dışı sıvı ve verimli bir şekilde beyin dokusu tarafından CNS1önemli metabolik taleplerini yerine getirmek için gerekli olan bu besin kaynağı. Öncelikle mikrovasküler endotel hücre düzeyinde var, BBB, potansiyel olarak zararlı xenobiotics yapamadığı sağlarken beyin parankimi erişmek bazı maddelerin etkinleştirmek ayrık mekanizmaları sahip olması gereken bu roller ima birikir. Nitekim, beyin mikrovasküler....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamlar ana hatlar aşağı bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) ve hayvan araştırma için uygun: In Vivo deneyler (varış) yönergeleri raporlama. İletişim kuralı için yordamsal akışı şekil 1' de tasvir edilir.

1. kurulum yordamı için

  1. Beyin microvessel arabellek (BMB) hazırlayın. Temiz bir ölçek 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA ve 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (yani, Tris) Bankası ağırlığında tarafından başlatın. 1.0 L deiyonize su ekleyin. Manyetik karıştırıcı kullanarak BMB arabellek bileşenleri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel akışı sıçan beyin yüzdeki izolasyonu ve microvessel membran örnekleri hazırlanması için şekil 1' de gösterilmiştir. Burada sunulan yordamını kullanarak--dan sıçan beyin sağlam yüzdeki başarılı yalıtım gösterilmiştir (şekil 2A). Bu gemiler Santrifüjü dextran ve hemen ultrasantrifüj membran örnekleri (yani, aşağıdaki tamamlanma adımının 4.10) hazırlamaya başlamadan önce tamamlanmasının ardından elde edilmiştir. Bu görüntüd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, taze sıçan beyin dokusundan izole yüzdeki membran protein örnekleri hazırlama basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. İzole microvasculature sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve/veya membran hazırlıklar nesil için çeşitli yaklaşımlar içinde edebiyat13,20,21,22 bildirilmiştir , 24. microvessel yalıtım Protokolü yukarıda açıklanan ilke olarak benzer ols.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser PTR için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-NS084941) ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ADHS16-162406) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. WA geçmiş bir ulusal kurumları sağlık eğitim Grant'ın (T32-HL007249) için önceden doktora bir randevudan destek aldı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Proteaz İnhibitörü KokteyliSigma-Aldrich#P8340Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
D-mannitolSigma-Aldrich#M4125Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
EGTASigma-Aldrich#E3889Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
Dekstran (MW 75,000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125Mikrodamarları beyin parankiminden ayırmak için santrifüjleme adımlarında kullanılan Dextran
ZetaminMWI Hayvan Sağlığı# 501072Genel anestezik
KsilazinBatı Tıbbi Malzeme# 5530Genel anestezik
% 0.9 salin çözeltisiWestern Medical SupplyN/AGenel anestezi seyreltici
Filtre Kağıdı (12,5 cm çap)VWR# 28320-100Beyin dokusundan meninkslerin çıkarılması için kullanılır
Santrifüj TüpleriSarstedt# 60.540.386Dekstran santrifüjleme adımları için kullanılan tek kullanımlık tüpler
Pierce & trade; Coomassie Plus (Bradford) TestiThermoFisher Scientific#23236Membran preparatlarında protein konsantrasyonunun ölçümü
Wheaton Overhead Power HomojenizatörDWK YaşamBilimleri#903475Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir
10.0ml cam havan ve havaneli doku öğütücüDWK YaşamBilimleri#358039Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir
Hidroklorik AsitSigma-Aldrich#H1758Tamponların pH ayarlaması için gereklidir
Sığır Serumu AlbüminiThermoFisher Scientific# 23210Bradford Testi için protein standardı
Standart ForsepsGüzel Bilim Araçları# 91100-12Beyin dokusunun diseksiyonu için kullanılır
Friedman-Pearson RongeursGüzel Bilim Araçları# 16020-14Beyni izole etmek için kafatasını açmak için kullanılır
50 ml konik santrifüj tüpleriThermoFisher Scientific# 352070İzolasyonu takiben beyin dokusunun toplanması için kullanılır
Cam Pastör PipetleriThermoFisher Scientific# 13-678-20CDekstran dönüşlerini takiben hücresel kalıntıların aspirasyonu için kullanılır
Etanol, susuzSigma-Aldrich# 459836Doku öğütücüyü temizlemek için kullanılır; damıtılmış su
ile% 70 oranında seyreltilmişUltrasantrifüj tüpleriBeckman-Coulter#41121703Numunelerin ultrasantrifüjlenmesi için kullanılır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain MicrovesselsDextran CentrifugationMembrane PreparationBlood Brain BarrierRat Brain TissueWestern Blot AnalysisProtein EnrichmentMicrovessel IsolationCentrifugation StepsEndothelial Cell Markers

Related Articles