Yöntem makalesi

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

DOI:

10.3791/57725

⸱

13 Temmuz 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamanında ve etkin reperfüzyon tehlikesi koroner arter ST segment olan hastalarda miyokard enfarktüsü boyutunu azaltmak için en iyi strateji miyokard infarktüsü yükseltilmiş olduğunu. Ancak, reperfüzyon başına daha fazla cardiomyocyte ölüm, reperfüzyon hasarı bilinen bir olay neden olabilir. Mitokondri zar potansiyel (MMP) azalma veya mitokondrial depolarizasyon, mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış evrensel reperfüzyon hasarı son adımı olarak kabul ve sorumludur mitokondri ve cardiomyocyte ölüm. JC-1 MMP değerine bağlı olarak mitokondri içinde biriken bir lipofilik katyonik boya var. Yüksek MMP, daha Dizayn Merkezi-1 mitokondri içinde birikir. Mitokondri artan miktarlarda JC-1 yeşil floresans emisyon vardiya tarafından yansıması olabilir (~ 530 nm) kırmızı (~ 590 nm). Bu nedenle, kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranı azaltma mitokondri depolarizasyon belirtebilirsiniz. Biz MMP ölçmek için Dizayn Merkezi-1 avantajı veya hipoksi/reoxygenation akış sitometresi tarafından tespit edildi sonra insan kardiyak miyositler mPTP açılış al.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koroner kalp hastalığı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. İskemik yaralanma azaltmak ve ST-segment olan hastalarda enfarktüsü boyutu sınırlama miyokard infarktüsü yükseltilmiş için seçim zamanında ve etkili miyokardiyal reperfüzyon birincil perkütan koroner girişim (PCI)1üzerinden tedavisidir, 2. Ancak, reperfüzyon son enfarktüsü boyutu3ilâ yüzde 30'hesap ek hasara neden olur. Evrensel mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP) sadece iskemi/reperfüzyon sırasında mitokondrial hasar ve hücre ölümü Central'da değil kabul edilmektedir (ı / R), ama aynı zamanda4 sinyal kardiyoprotektif yakınsak bir hedeftir , 5. mPTP açılış iç mitokondri zar potansiyel (MMP)4depolarizasyon hakkında getirmek gibi tespit ettik 5 ' 5 ', kullanarak mPTP açılış 6, 6 '-Pekala-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) tahlil.

JC-1 tahlil hem nitel hem de nicel bir cytofluorimetric yöntemidir ve bir tek mitokondri6düzeyinde MMP analiz ederek daha da doğrulandı. JC-1 kırmızı turuncu renkli emisyon (590 ± 17.5 nm) matris ile normal MMP mitokondri için verimli bir araya getirilmiş biçimi olarak, var; MMP kaybı ile Dizayn Merkezi-1 salma 530 ± 15 Nm ile yeşil floresans verimleri monomeric forma dönüşür. Bu nedenle, kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranında bir düşüş MMP azalma iskemi/reperfüzyon gibi koşulları göstergesi olabilir (ben / R).

JC-1 ek olarak, MMP da rodamine 123 ve 3, 3'dihexyloxadicarbocyanine iyodür [DiOC6(3)] gibi membran geçirgen lipofilik katyonlar ile çalışılmıştır. Ancak, bu iki problar için karşılaştırıldığında, JC-1 MMP analiz etmek için daha güvenilirdir. Rodamine 123 (özellikle de modu7,8Şoklama) nispeten yoksul duyarlılık ve zavallı özgüllük vardır. Rodamine 123 vardiyada bazen gözlemlemek/algılamak araştırmacılar veya ekipmanlar için zor kadar küçük. Ayrıca, tek bir hücrede farklı mitokondri bağlayıcı siteleri rodamine 123 için vardır ve bu kadar farklı floresan emisyonları9çok olabilir. MMP algılamak için tavsiye edilmez DiOC6(3) hassas plazma zarı10depolarizasyon için tepki olarak da.

Bu nedenle, burada biz Dizayn Merkezi-1 tahlil HCMs MMP hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra değerlendirmek için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması reaktifler ve çözümleri

  1. İnsan kardiyak miyositler (HCMs) tam orta Myocyte büyüme orta 500 ml üretici yönergelerine göre 25 mL Myocyte büyüme orta ek karışımı ekleyerek hazırlayın. 4 ° C ve kullanmadan önce 37 ° c sıcak mağazasında.
  2. Tongxinluo (TXL) çözüm hazırlamak TXL süper ince toz serum/glikoz-Alerjik içinde eriterek tarafından Dulbecco'nın kartal Orta (DMEM) değiştiren ve TXL konsantrasyon 400 µg/ml DMEM (daha fazla bilgi için bkz:11) ekleyerek ayarlayın. 4 ° C ve kullanmadan önce 37 ° c sıcak mağazasında.
  3. JC-1 hisse senedi çözüm (200 x), 4 mL Ultrasaf Su ve 15 mL santrifüj tüpü karanlıkta arabellek (5 x) boyama stokunun 1 mL 25 µL ekleyerek 5 mL JC-1 çalışma çözeltisi hazırlamak. Yukarı ve aşağı birkaç kez karışımı pipette ve 37 ° C için kullanmadan önce sıcak.
  4. Boyama arabellek arabellek (5 x) 50 mL santrifüj tüpü boyama stokunun 6 mL 24 mL Ultrasaf Su ekleyerek çalışma 30 mL hazırlayın. Bu çözüm buz gibi kullanın.

2. hipoksi/Reoxygenation Model kurulması

  1. HCM tam orta 6 iyi plaka ile iyi başına plaka 1.0 x 105 hücre. Yaklaşık %70 37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 hava içeren bir hücre kuluçka confluency ulaşmak için büyümek
  2. HCMs fosfat tampon serum (PBS) yıkayın. Farklı tedavilere tanıttığını (400 µg/mL TXL ya da değil) 2 ml serum/glikoz-Alerjik DMEM 30 dk önce hipoksi 37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 hava içeren bir hücre kuluçka için
  3. Ücretsiz oksijen çöpçülük ve hipoksi 18 h (Şekil 1A) ve orta11,12, oksijen gerilim ölçmek için anaerobik bir gösterge teşvik için kavanoza bir katalizör ile donatılmış bir hava geçirmez ve hipoksik (2,5 M) HCMs kuluçkaya 13, 37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 hava içeren bir hücre kuluçka
    Not: Bu ücretsiz oksijen kavanozun içinde kayıt atmak katalizör için yaklaşık 1,5 saat alır. Bu nedenle, kavanoz açılmadan önce 19.5 h için kavanoza HCMs tutulur. Normoxic ortamda açık mavi anaerobik göstergesinin rengini soluk beyaz hipoksik koşulu (Şekil 1B) olarak değiştirir.
  4. HCMs için 2 h %5 CO2 ve % 95 hava içeren 37 ° C'de ayarla bir kuluçka içine 6 iyi plaka hareket ettirerek reoxygenate.

3. akış sitometresi için HCMs hazırlanması

  1. % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm ve PBS 37 ° c sıcak
  2. Aspiratı orta her şey, PBS 1 mL hücrelerle durulama ve % 0.25 tripsin kuyunun duvar boyunca 0.5 mL ekleyin.
  3. Tüm HCMs (yaklaşık 1 dakika) neredeyse müstakil olana 37 ° C'de kuluçkaya.
  4. 1 mL DMEM tam orta (% 10 fetal Sığır serum ile DMEM orta) tripsin nötralize etmek için kuyu ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü aktarmak ve 500 x g 3 dakika oda sıcaklığında, centrifuging tarafından HCMs cips.
  5. Dikkatle süpernatant Pelet bozmadan Aspire edin.
  6. HCM tam orta ve JC-1 çalışma çözüm 0.5 mL 0.5 mL her tüp için ekleyin. HCMs yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend.
  7. Floresan göstergesidir ağartma önlemek için alüminyum folyo ile bütün tüplerin kapak ve HCMs (37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 hava içeren) normal koşullarda 20 min için kuluçkaya.
  8. Pelet HCMs 500 x g 4 ° C'de 3 dk de centrifuging tarafından
  9. HCMs buz gibi Dizayn Merkezi-1 boyama arabellek iki kez 2 mL ile yıkayın.
  10. Buz gibi boyama arabelleğinin örnek tüp (12 x 75 mm) cinsinden 300 µL son hacmine HCMs resuspend ve 30 dk içinde analiz için hücreleri kullanın.
    Not: karbonil siyanür m-klorofenil hydrazone (CCCP), solunum elektron taşıma zinciri, güçlü bir önleyici olumlu denetim için 20 µM bir konsantrasyon, 1 h için HCMs tedavi etmek için kullanın.

4. akış sitometresi Kur

  1. Akış Sitometresi başlatın ve yazılımın kendisine bağlı olduğundan emin olun.
  2. Akışkanlar başlatmasını gerçekleştirme, aktarım başlayacak ve breakoff kadar ayarla.
  3. Akış Sitometresi yazılım açık iki nokta çizim pencereleri.
    1. Select ileri ışık (FSC) X ekseni üzerinde ve yan dağınık ışık (SSC) sırasıyla büyüklükleri ve onların taneciklik hücrelerin özellikleri temsil etmek için ilk nokta Arsa Y ekseninde dağılmış.
    2. PE (575 ± 26 nm) algılama kanalın FITC (530 ± 30 nm) ve Y ekseni için Dizayn Merkezi-1 boya hücrelerdeki floresans yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ikinci nokta komplo Logaritmik ölçek kullanarak X ekseni seçin.

5. akış sitometresi ölçüm ve veri analizi

  1. Boruyu çıkarmak kol destek ve boş (bu değil boyalı HCMs Dizayn Merkezi-1) pozisyon bildirmek için Kaldır ' ı tıklatın örnek bu tüp. Tüp destek kolu çalışma konumuna döndürmek için Yükle ' yi tıklatın.
  2. Boş örnek tüp süspansiyon parçacıkların toplamak ve daha sonra daha fazla analiz ilk nokta Arsa (Şekil 3) hücre nüfus (P1) kapı için kayıt ' ı tıklatın.
  3. HCMs diğer örnek tüplerde toplamak ve floresan kanalları hücre nokta ikinci nokta çizim merkezi alanında bulunduğundan emin olun, voltaj ayarlayarak ölçümü optimize.
  4. Her örnek tüp istatistiklerini görüntülemek ve kırmızı floresans yoğunluk oranı bu yeşil floresan yoğunluğu tarafından bölerek her örnek MMPs hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MMP değişiklikleri değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 tahlil yapmadan önce deneyler koşulları başarıyla onaylamak için araştırmacılar tarafından ayarla yürütülen bu önerilir. Normal grup ile karşılaştırıldığında akış sitometresi sonuçları (resim 2), tarafından gösterildiği gibi hipoksi/reoxygenation (H/R) önemli ölçüde HCMs (Annexin V + /PI±), apoptozis indüklenen hücre tabanlı modeli ben kurmuş gösteren / R (45.00 ± %2.13 vs. 11.50 ± %0.18 normal grubunda,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz H/R. tespit için Dizayn Merkezi-1 tahlil tarafından maruz kalma sonra MMP hücre değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut, hücre MMP mitokondrial boyut, şekil ve tek bileşenli floresans etkileyebilir yoğunluğu gibi faktörlerin bağımsız 14sinyalleri. Sonuç olarak, JC-1 tahlil sonuçlarını görece güvenilirdir. Ayrıca, uygun ve zaman kazandıran JC-1 tahlil gerçekleştirmek için. Bu tahlil malzemeleri ve Kimyasalları için düşük bir gereklilik vardır ve gen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (No. 2017YFC1700503), gelen hibe tarafından desteklenen Ulusal temel araştırma programı (973 programı), Çin (No.2012CB518602), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 81370223 ve No 81573957) ve öngörüyor yenilikçi Araştırma Vakfı Pekin Birliği Medical College (2016-1002-01-02).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
JC-1 ile mitokondriyal membran potansiyel test kitiBeyodtime, ÇinC2006Kitte JC-1 stok çözeltisi (200 kez;), stok boyama tamponu (5 kez) ve CCCP (10mM)
Tongxinluo ultra ince tozShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Çin071201
Annexin V-FITC / PI KitiBecton-Dickinson, ABD556547
DMEMbulunmaktadır.Yaşam Teknolojileri, Grand Island Biological Company, ABD11966-025
İnsan kardiyak miyositPromocell, AlmanyaC-12810
Miyosit Büyüme Ortamı
(SupplementMix)		Promocell, AlmanyaC-39275
Miyosit Büyüme Ortamı (Kullanıma hazır)Promocell, AlmanyaMiyosit Büyüme Ortamı SupplementMix
BiyoM ve Eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Fransa961272.5L
Katalizör (AnaeroPack)MITSUBISHI GAZ KİMYASAL& nbsp; ŞİRKET, A.Ş. , Japonya  C-1
Anaerobik indikatörBioM & eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Fransa96118
Akış sitometresiBecton-Dickinson, ABDFACSAria 2
BD FACSDiva YazılımıBecton-Dickinson, ABDSürüm8.0.1
Numune tüpüCorning bilimi, ABD35205412*75mm
PBSHyclone, ABDSH30256.01
GENbox ile kullanılan C-22070

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
  3. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
  4. Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
  5. Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
  6. Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
  7. Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
  8. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  9. Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).
  10. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
  11. Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).
  12. Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
  13. Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
  14. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
  15. Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
  16. Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).
  17. Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
  18. Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
  19. Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
  20. Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
  21. Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
  22. Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
  23. El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).
  24. Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Flow Cytometry AssayJC 1 DyeRed Green RatioMitochondrial DepolarizationPermeability Transition PoreCell IsolationFluorescence Detection

İlgili makaleler