Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Zamanında ve etkin reperfüzyon tehlikesi koroner arter ST segment olan hastalarda miyokard enfarktüsü boyutunu azaltmak için en iyi strateji miyokard infarktüsü yükseltilmiş olduğunu. Ancak, reperfüzyon başına daha fazla cardiomyocyte ölüm, reperfüzyon hasarı bilinen bir olay neden olabilir. Mitokondri zar potansiyel (MMP) azalma veya mitokondrial depolarizasyon, mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış evrensel reperfüzyon hasarı son adımı olarak kabul ve sorumludur mitokondri ve cardiomyocyte ölüm. JC-1 MMP değerine bağlı olarak mitokondri içinde biriken bir lipofilik katyonik boya var. Yüksek MMP, daha Dizayn Merkezi-1 mitokondri içinde birikir. Mitokondri artan miktarlarda JC-1 yeşil floresans emisyon vardiya tarafından yansıması olabilir (~ 530 nm) kırmızı (~ 590 nm). Bu nedenle, kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranı azaltma mitokondri depolarizasyon belirtebilirsiniz. Biz MMP ölçmek için Dizayn Merkezi-1 avantajı veya hipoksi/reoxygenation akış sitometresi tarafından tespit edildi sonra insan kardiyak miyositler mPTP açılış al.
Giriş
Koroner kalp hastalığı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. İskemik yaralanma azaltmak ve ST-segment olan hastalarda enfarktüsü boyutu sınırlama miyokard infarktüsü yükseltilmiş için seçim zamanında ve etkili miyokardiyal reperfüzyon birincil perkütan koroner girişim (PCI)1üzerinden tedavisidir, 2. Ancak, reperfüzyon son enfarktüsü boyutu3ilâ yüzde 30'hesap ek hasara neden olur. Evrensel mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP) sadece iskemi/reperfüzyon sırasında mitokondrial hasar ve hücre ölümü Central'da değil kabul edilmektedir (ı / R), ama aynı zamanda4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlanması reaktifler ve çözümleri
- İnsan kardiyak miyositler (HCMs) tam orta Myocyte büyüme orta 500 ml üretici yönergelerine göre 25 mL Myocyte büyüme orta ek karışımı ekleyerek hazırlayın. 4 ° C ve kullanmadan önce 37 ° c sıcak mağazasında.
- Tongxinluo (TXL) çözüm hazırlamak TXL süper ince toz serum/glikoz-Alerjik içinde eriterek tarafından Dulbecco'nın kartal Orta (DMEM) değiştiren ve TXL konsantrasyon 400 µg/ml DMEM (daha fazla bilgi için bkz:11) ekleyerek ayarlayın. 4 ° C ve kullanmadan önce 37 ° c sıcak mağazasında.
- JC-1 hisse senedi çözüm (200 x), 4 mL Ultrasaf Su ve 15 mL santrifüj tüpü karanlıkta arabe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MMP değişiklikleri değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 tahlil yapmadan önce deneyler koşulları başarıyla onaylamak için araştırmacılar tarafından ayarla yürütülen bu önerilir. Normal grup ile karşılaştırıldığında akış sitometresi sonuçları (resim 2), tarafından gösterildiği gibi hipoksi/reoxygenation (H/R) önemli ölçüde HCMs (Annexin V + /PI±), apoptozis indüklenen hücre tabanlı modeli ben kurmuş gösteren / R (45.00 ± %2.13 vs. 11.50 ± %0.18 normal grubunda,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, biz H/R. tespit için Dizayn Merkezi-1 tahlil tarafından maruz kalma sonra MMP hücre değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut, hücre MMP mitokondrial boyut, şekil ve tek bileşenli floresans etkileyebilir yoğunluğu gibi faktörlerin bağımsız 14sinyalleri. Sonuç olarak, JC-1 tahlil sonuçlarını görece güvenilirdir. Ayrıca, uygun ve zaman kazandıran JC-1 tahlil gerçekleştirmek için. Bu tahlil malzemeleri ve Kimyasalları için düşük bir gereklilik vardır ve gen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu çalışmada ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (No. 2017YFC1700503), gelen hibe tarafından desteklenen Ulusal temel araştırma programı (973 programı), Çin (No.2012CB518602), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 81370223 ve No 81573957) ve öngörüyor yenilikçi Araştırma Vakfı Pekin Birliği Medical College (2016-1002-01-02).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| JC-1 ile mitokondriyal membran potansiyel test kiti | Beyodtime, Çin | C2006 | Kitte JC-1 stok çözeltisi (200 kez;), stok boyama tamponu (5 kez) ve CCCP (10mM) |
| Tongxinluo ultra ince toz | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Çin | 071201 | |
| Annexin V-FITC / PI Kiti | Becton-Dickinson, ABD | 556547 | |
| DMEM | bulunmaktadır.Yaşam Teknolojileri, Grand Island Biological Company, ABD | 11966-025 | |
| İnsan kardiyak miyosit | Promocell, Almanya | C-12810 | |
| Miyosit Büyüme Ortamı (SupplementMix) | Promocell, Almanya | C-39275 | |
| Miyosit Büyüme Ortamı (Kullanıma hazır) | Promocell, Almanya | Miyosit Büyüme Ortamı SupplementMix | |
| BiyoM ve Eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Fransa | 96127 | 2.5L | |
| Katalizör (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAZ KİMYASAL& nbsp; ŞİRKET, A.Ş. , Japonya | C-1 | |
| Anaerobik indikatör | BioM & eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Fransa | 96118 | |
| Akış sitometresi | Becton-Dickinson, ABD | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Yazılımı | Becton-Dickinson, ABD | Sürüm8.0.1 | |
| Numune tüpü | Corning bilimi, ABD | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, ABD | SH30256.01 |
Kaynaklar
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for th....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
