CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Heather M. Kudyba; David W. Cobb; Anat Florentin; Michelle Krakowiak; Vasant Muralidharan

doi:10.3791/57747

Yöntem makalesi

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

DOI:

10.3791/57747

⸱

18 Eylül 2018

Heather M. Kudyba^*¹^,² , David W. Cobb^*¹ , Anat Florentin¹^,² , Michelle Krakowiak¹ , Vasant Muralidharan¹^,²

¹Department of Cellular Biology, University of Georgia, ²Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş¹yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırak....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. falciparum sürekli kültür insan RBCs kullanımı gerektirir ve biz ticari satın alınan ünite kan tüm tanımlayıcıları çıkardı ve anonimleştirilir faydalanır. Kurumsal değerlendirme Komitesi ve biyogüvenlik Office Georgia Üniversitesi, bizim protokolleri gözden geçirilmiş ve onaylanmış bizim laboratuarda kullanılan tüm iletişim kuralları.

1. bir gRNA sıra seçimi

CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) gidin ve ' Fasta hedef 'seçin. 'Hedef'altında 200 baz çifti 3' sonundan itibaren açık okuma çerçevesi bir genin (ORF) ve 200 baz çifti başlar, Gen 3' UTR-yapıştırın. 'In'altında 'P. falciparum' <....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan bu yöntem yanı sıra bir kalkan mutasyon örneği plazmid şematik resim 1' de gösterilmiştir. Transfection sonra mutant parazitler nasıl bir örnek olarak, HA -glmS yapı entegrasyonu denetimi PCR sonuçlarını Şekil 2' de gösterilir. Klonlama bir tabak temsilcisi bir görüntüsünü parazitler huzurunda orta renk değişimi göstermek için Şekil 3 ' te gösterilmiştir. Bir ayirt tahlil ve weste.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA -glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyonların etiketleme de dahil olmak üzere ç.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O'Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gene Pulser Xcell Elektroporatör	Bio-Rad	1652660
Gene Pulser Xcell Elektroporatör	Bio-Rad	165-2086	Ayrı ayrı sarılmış olanları satın alıyoruz
Sodyum Asetat	Sigma-Aldrich	S2889-250g
DSM1	Hediyesi Akhil Vaidya laboratuvarı	Ganesan'dan et al. Mol. Biyokimya. Parazitol. 2011 177:29-34
TPP Doku Kültürü 6 Kuyulu Plakalar	MIDSCI	TP92006
TPP 100 mm Doku Kültürü Kapları (12 mL Plaka)	MIDSCI	TP93100
TPP Doku Kültürü 96 Kuyulu Plakalar	MIDSCI	TP92096
TPP Doku Kültürü 24 Kuyulu Plakalar	MIDSCI	TP92024
NEBuffer 2	New England Biolabs	#B7002S
NEBuffer 2.1	New England Biolabs	#B7202S
BtgZI	New England Biolabs	#R0703L
SacII	New England Biolabs	#R0157L

Afe1	New England Biolabs	#R0652S
Nhe1-HF	New England Biolabs
T4 DNA Polimeraz	New England Biolabs	#M0203S
500 mL Steritop şişe üstü filtre ünitesi	Millipore	SCGPU10RE	İhtiyaçlarınıza uygun herhangi bir boyutta kullanabilirsiniz
EGTA	Sigma	E4378-100G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500g
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C7902-500g
MgCl₂	>Sigma-Aldrich	M8266-100g
K₂HPO₄	Fisher	P288-500
Muralidharan Laboratuvarı tarafından üretilen


Jose-Juan Lopez-Rubio Laboratuvarı'ndan	pUF1-Cas9	Ghorbal et al. Nature Biotech 2014
Glikoz	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Sodyum piruvat	Sigma-Aldrich	P5280-100G
Hipoksantin	Sigma-Aldrich	H9636-25G
Gentamisin Reaktifi	Gibco	15710-064
Timidin	Sigma-Aldrich	T1895-1G
Muralidharan Laboratuvarı Tarafından Üretilen	PL6-eGFP BSD

NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme	Macherey-Nagel	740609.250
Albumax I	Life Technologies	N/A	Parazitlerin en iyi şekilde ne yetiştireceğini öğrenmek için birkaç parti denemek isteyeceksiniz
İnsan Kırmızı Kan Hücreleri	Interstate Blood Bank, Inc	E-posta gönderin veya sipariş için doğrudan arayın	Genellikle O + kan
3D7 parazit hattı	İstek üzerine temin edilebilir	N/A
Lizojen Et Suyu (LB)	Fisher	BP1426-2	Kendiniz yapabilirsiniz, tam olarak bu
Ampicilin	Fisher	BP1760-25'i	Suda 100mg / ml'de 1000X stok yapıyoruz ve -20C
Ampicilin	Clonetech	R050A
Anti-EF1alpha'da	Dr. Daniel Goldberg'in Laboratuvarı	St. Louis'deki Washington Üniversitesi	Batı lekeleri için tercih ettiğiniz yükleme kontrolünü kullanabilirsiniz. Bu sadece laboratuvarımızda kullandığımız
Sıçan Anti-HA Klonu 3F10, monoklonal	Roche tarafından üretilen, Sigma tarafından satılan,	11867423001	Tercih ettiğiniz anti-HA antikoru
0.6 mL tüpleri	Fisher	AB0350
Fisher HealthCare* PROTOKOL* Hema 3* Manuel Boyama Sistemi (Fiksatif+Solüsyon I ve II)	Fisher	22-122-911	Giemsa boyasını
da kullanabilirsinizFisherfines Premium Buzlu Mikroskop Slaytları - Boyut: 3 x 1 inç.	Balıkçı	12-544-3

HindIII-HF New England Biolabs#R3104S #R3131L HEPES sigma-Aldrich H4034-500g pMK-U6 n/a Muralidharan Lab n/a tarafından üretilen pHA-glmS Muralidharan Lab n/a tarafından üretilen Hediyesi PL6-eGFP Muralidharan Laboratuvarı Tarafından Üretilen gRNA kullanırız kullanmanıza gerek yoktur saklıyoruz kullanabilirsiniz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
Florentin, A., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plasmodium Falciparum GlmS Nakavt Protein Etiketleme Gen Nakavt Elektroporasyon Tekni i Western Blot Analizi mm nofloresan Analiz Kan Yaymas Haz rlama

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler