Yöntem makalesi

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

DOI:

10.3791/57747

⸱

18 Eylül 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş1yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırakılır. Büyüme parazit RBCs içinde sıtma2ile ilişkili klinik belirtiler doğrudan sorumlu.

Yakın zamana kadar transgenik P. falciparum üretim zahmetli bir süreç, birkaç tur birçok ay sürdü ve yüksek başarısızlık oranı olan ilaç seçimi içeren oldu. Bu zaman alan yordamı relieson rasgele DNA nesil bölgenin ilgi ve parazit endojen yeteneğine rağmen genomunu onarmaya tatili homolog onarım3,4,5,6 . Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli olarak Interspaced palindromik tekrar/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom düzenleme başarıyla P. falciparum7,8' kullanılmıştır. Bu yeni teknoloji sıtma araştırma giriş yapılmış bu ölümcül Plasmodium parazitler biyoloji anlayış ilerleyen için kritik. CRISPR/Cas9 Kılavuzu RNA'ların (gRNAs) faiz gen için homolog genlerin özel hedefleme için sağlar. GRNA/Cas9 karmaşık gen gRNA yoluyla tanır ve Cas9 sonra tamir mekanizmaları organizma9,10inisiyasyon zorlama iki iplikçikli mola tanıtır. P. falciparum homolog olmayan son katılma yoluyla DNA sonları onarmak için makine eksik olduğundan, Homolog rekombinasyon mekanizmaları kullanır ve Cas9/gRNA-indüklenen onarmak için transfected homolog DNA şablonları entegre iki iplikçikli ara11,12.

Burada, bir protokol P. falciparum koşullu devirme mutantların üretimi için CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak mevcut. Protokol glmS ribozyme PfHsp70x koşullu olarak devirme protein düzeyleri için kullanımı gösterilmiştir (PF3D7_0831700), bir koruyucuya ihraç P. falciparum tarafından ev sahibi RBCs13,14. GlmS ribozyme (ki glucosamine-6-fosfat hücrelerdeki dönüştürülür) glucosamine ile tedavi tarafından protein14bir azalma önde gelen onun ilişkili mRNA ayırmak için etkinleştirilir. Bu iletişim kuralı kolayca istikrarsızlık etki alanları veya RNA aptamers4,5,15gibi diğer koşullu devirme araçlarını kullanmak için adapte edilebilir. Bizim iletişim kuralı dizileri tarafından çevrili sıra kodlama hemagglutinin (HA) etiketi ve glmS ribozyme oluşan bir onarım plazmid nesil bu PfHsp70x açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3' UTR homolog ayrıntılardır. Ayrıca gRNA sürücü ifade için ikinci bir plazmid nesil açıklar. Bir ifade Cas9, sürücüler üçüncü ile birlikte bu iki plazmit RBCs transfected ve P. falciparum parazitler genom değiştirmek için kullanılır. Son olarak, biz bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarif-entegrasyon-in etiket ve glmS ribozyme doğrulamak için teknik dayalı. Bu son derece uyarlanabilir ve/veya sıtma parazit biyoloji yeni görüşler üretmek için bizim yetenek geliştirme herhangi bir P. falciparum genlerin tam nakavt için iletişim kuralıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. falciparum sürekli kültür insan RBCs kullanımı gerektirir ve biz ticari satın alınan ünite kan tüm tanımlayıcıları çıkardı ve anonimleştirilir faydalanır. Kurumsal değerlendirme Komitesi ve biyogüvenlik Office Georgia Üniversitesi, bizim protokolleri gözden geçirilmiş ve onaylanmış bizim laboratuarda kullanılan tüm iletişim kuralları.

1. bir gRNA sıra seçimi

  1. CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) gidin ve ' Fasta hedef 'seçin. 'Hedef'altında 200 baz çifti 3' sonundan itibaren açık okuma çerçevesi bir genin (ORF) ve 200 baz çifti başlar, Gen 3' UTR-yapıştırın. 'In'altında 'P. falciparum' seçin (3D 7 v3.0) ve ' CRISPR/Cas9 ' 'Using'altında seçin. Sonra ' hedef siteleri bulmak 'tıklayın.
  2. Bir gRNA serisi bu değişiklik siteye en yakın ve en az sayıda hedef kapalı siteleri olan en verimli gRNA vererek sunulan seçenekler arasından seçin.
    Not: DNA Cas9 alımı için gereken bir Protospacer bitişik motifi (PAM in), hemen ters yönde oldukları için potansiyel gRNA dizileri tanımlanır. PMK-U6 gRNA ifade, sürücüler vektör klonlanmış sıra 20 üsleri olduğunu hemen ters yönde, PAM. S. pyogenes Cas9 için belirli PAM nükleotid dizisi NGG ve pMK-U6 klonlanmış sıra dahil edilmemesini.
    Not: CHOPCHOP görsel olarak gRNA dizileri, yeşil, daha az ideal seçenekler, amber ve kırmızı en kötü seçeneklerinde en iyi seçenekleri görüntüleme yer alıyor. CHOPCHOP her gRNA sıra literatürde bulunan en güncel parametreler kullanılarak hesaplanır bir verimlilik puan verir ve onlar gRNA tarafından tanınan hedef kapalı siteleri tahmin. İki ya da üç gRNA dizileri için belirli bir gen uygun gRNA en iyi bulmak için denenmesi gerekebilir.
  3. GRNA sıra ve tersi tamamlayıcı Polyacrylamide jel elektroforez saf oligos satın alabilirsiniz. Hedef PfHSP70x kullanılan gRNA sırası Şekil 1Badımında bulunabilir.
    Not: Bu oligo 15 sıra ve ligasyonu bağımsız (dilim) pMK-U6 vektör16klonlama için gerekli olan çift gRNA ifade plazmid için homolog içermelidir.

2. gRNA sıra pMK-U6 içine klonlama

  1. BtgZI ile pMK U6 sindirmek.
    1. PMK-U6 Özet 10 μg 5 μL 60 ° C'de 3 h için BtgZI enzim (5000 adet/mL) ile Enzim üreticinin Protokolü reaksiyon koşulları için izleyin.
    2. 3 h kuluçka dönemi sonra BtgZI bir ek 3 μL plazmid tam sindirim sağlamak için tepki ekleyin. Bir ek 3 h, hala doğru reaksiyon koşulları sağlamak için üreticinin yönergelerini takip için sindirmek.
    3. Sindirilir pMK U6 reaksiyon gelen arındırmak için üreticinin yönergelerine göre sütunlara göre PCR temizleme seti kullanın.
    4. % 0.7 özel jel kullanarak sindirilir DNA ayırmak ve 4200-baz çifti grup ayıklayın.
  2. GRNA sıra içeren oligos tavlamak.
    1. 100 μM nükleaz ücretsiz su kullanarak bir konsantrasyon için sayfa saf oligos sulandırmak.
    2. Her oligo 10 μL 10 x arabellek ( Tablo malzemelerigörmek) 2 2.2 μL ile birleştirin. Toplam reaksiyon birim 22,2 μL olduğundan emin olun.
    3. Bir thermocycler programda tavlama gRNA çalıştırın: adım 1: 95 ° C, 10 min; Adım 2: 95 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 3: adım 2, 16 kere; git Adım 4: 85 ° C, 1 dk; Adım 5: 85 ° C, 1 s, sıcaklık bir azalma 0,6 ° C/döngüsü; Adım 6: adım 5, 16 kere; gidin Adım 7: 75 ° C, 1 dk; Adım 8: 75 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 9: 16 kez adım 8, git. Adım 10-21: sıcaklık 25 ° C; ulaşıncaya kadar 4 – 9 adımda kullanılan yordamı yineleyin adım 22:25 ° C, 1 dak.
  3. Tavlanmış gRNA oligos BtgZI sindirilmiş ve jel saf pMK U6 plazmid yerleştirin.
    1. Sindirilir pMK-U6 birleştirmek 100 ng 10 arabellek 2.1 ve 3 μL tavlanmış gRNA oligos, x 1 μL ile. Nükleaz ücretsiz su ile 9.5 μL birime artırın.
    2. T4 polimeraz 0.5 μL ekleyin ve reaksiyon 2.5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. Buz ve 10 dakikadır kuluçkaya tepki taşıyın.
    4. Hemen tepki yetkili E. coli bakteri üreticinin yönergelerine uygun içine 5 μL dönüşümü. Lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar 100 μg/mL ampisilin içeren bakteri plaka.
    5. 37 ° C'de bir gecede büyümek sonra kolonileri seçin ve DNA ile bir piyasada bulunan plasmid miniprep kit ayıklamak dönüştürülmüş bakteri izin.

3. Homoloji bölgelerinde onarım şablon tasarımı

  1. Tasarım kalkan mutasyonlar genom entegre DNA'ın yeniden kesme önlemek için Homoloji onarım şablon içinde.
    Not: Cas9 bir ara onarım şablon ile teşvik değil PAM değiştirmek için sessiz bir mutasyon tanıtan bir kalkan mutasyon genellikle oluşur. Bu protokol için kullanılan Cas9 nükleotid dizisi "NGG", "N" herhangi bir nükleotit nerede için PAM gerekli. Mümkünse, bir A, C veya t G nükleotit birini değiştirmek
    1. PAM'yi sessizce mutasyona uğramış olamaz Eğer PAM7,8' e bitişik 6 baz çifti içine en az 2 Sessiz mutasyonlar tanıtmak.
      Not: Bu mutasyonlar onarım şablon tanınması gRNA tarafından önlemek ve Cas9/gRNA tarafından onarılan locus karmaşık yeniden kesme önlemek. Kalkan mutasyonlar Homoloji bölgeye DNA mutasyon içeren astar ile yükseltecek tarafından tanıttı olabilir.
  2. ORF Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
    1. PCR kullanarak, 800 baz çifti 3' sonundan itibaren hedef Gene'in ORF yükseltmek. Bu amplicon kodonu dışlamak için kullanılan astar tasarım.
    2. Bu amplicon SacII ve AfeI ile DNA ligasyonu tepki veya dilim16yoluyla sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için astar tasarım.
  3. 3' UTR Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
    1. PCR kullanarak, hemen ardından kodonu hedef gen 800 baz çifti yükseltmek. Bu amplicon HindIII ve NheI ile bir DNA ligasyonu tepki veya dilim16üzerinden sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için tasarım astar.
      Not: P. falciparum genom içeriğini lisesinde UTRs gibi bölgelerde amplifikasyon zorlaştırabilir. PCR kullanarak alternatif bir yaklaşım Homoloji bölgeleri sentezleme.

4. klonlama Homoloji bölgelere onarım plazmid

  1. ORF Homoloji bölge pHA -glmSyerleştirin.
    1. PHA -glmS SacII ve AfeI, enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. ORF Homoloji bölge PCR ürünü kullanma dilim16sindirilir plazmid takın.
    2. Yetkili E. coli adım 2.3.4 ve 2.3.5 seslendirilen dönüşümü.
  2. 3' UTR Homoloji bölge ORF Homoloji bölge içeren bir pHA-glmS plazmid takın (bkz. Adım 4.1).
    1. HindIII ve NheI ile plazmid enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. 3' UTR Homoloji bölge amplicon dilim16kullanılarak sindirilir plazmid yerleştirin.
    2. Yetkili E. coli dönüştürmek ve plazmid DNA (adım 2.3.4 ve 2.3.5) ayıklayın.

5. Hizlandirici DNA Transfection için

  1. 40 μg her pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA -glmS DNA (için toplam DNA'ın 120 μg) steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
  2. 1/10th eklemek DNA 3 M sodyum asetat su (pH 5.2) tüp hacmi ve iyi bir girdap kullanarak karıştırarak (Örneğin, adım 5.1 hacmindeki 100 μL olsaydı eklemek sodyum asetat 10 μL).
  3. % 100 etanol hacmi 2,5 kat tüp ve de en az 30 için bir girdap kullanarak karıştırın s (Örneğin, 5.1 ses 100 μL olsaydı Ekle % 100 etanol 250 μL).
  4. Tüp buz veya 30 dakika-20 ° C'de ekleyin.
  5. Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi
  6. Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin.
  7. % 70 etanol hacmi 3 kez tüp ve kısaca bir girdap kullanarak karıştırın (Örn., 5.1 ses 100 μL olsaydı % 70 etanol 300 μL eklemek).
  8. Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi
    Not: Bu adımı biyolojik güvenlik kabin steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
  9. Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin. Tüp açık bırakın ve Pelet 15dk için kurumasını bekleyin.
  10. Transfection için gerekinceye kadar zarlarını DNA-20 ° C'de depolayın.

6. tam kan Transfection için hazırlık üzerinden insan RBCs yalıtma

  1. Steril 50 mL konik tüpler (yaklaşık 25 mL tüp başına) içine aliquot taze kan.
  2. 1,088 x g 12 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi ile santrifüj fren 4'e ayarlayın.
  3. Süpernatant ve buffy kat Aspire edin. RBC Pelet eksik RPMI eşit bir hacmi ile resuspend.
    Not: Eksik RPMI RPMI 1640 10,32 mikron timidin, 110.2 mikron hypoxanthine, 1 mM sodyum pyruvate, 30 mM sodyum bikarbonat, 5 mM HEPES, 11.1 mM glikoz ve %0.02 (v/v) gentamisin ile ilave tarafından hazırlanmıştır.
  4. 6.2-6.3 adımları iki kez tekrarlayın. Son yıkama sonra RBCs eşit birimlere eksik RPMI resuspend ve tüpler 4 ° C'de depolayın

7. transfecting RBCs CRISPR/Cas9 Plasmid'ler ile (aseptik yapılması)

Not: P. falciparum kültürler diğer raporları17' açıklandığı gibi korunur. %3 O2, % 3 CO2ve % 94'ü N2 altında 37 ° C'de tüm kültürler aksi belirtilmedikçe korumak. Kan bu protokol için kullanıldığı her yerde 6. adımda hazırlanan saf kırmızı kan hücreleri için yönlendiriyordur. Olarak genellikle bir düşüş parazit nükleer silahların yayılmasına karşı büyük kan kanı kullanılan 6 hafta, eski olmamalıdır. Aşağıdaki adımlar, önceden yükleme RBCs DNA ve parazit kültür transfected hücrelere ekleme açıklar. Bu yapıları18,19transfecting ile uyumlu diğer kurulan transfection kurallarıdır.

  1. Su (120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6) 1 x cytomix arabellekte hazırlayın. 0,22 mikron filtre kullanarak filtre olarak sterilize et.
  2. DNA için 1 x cytomix 380 μL adım 5 ve çözülmeye girdap çöktürülmüş ekleyin. 10 dakika, vortexing her 3 dakikada 10 için 1 x cytomix çözülmeye DNA izin s.
  3. Steril 15 mL konik tüp RBCs 300 μL birleştirmek (% 50 hematokrit, adım 6) ile 4 mL 1 x cytomix eksik RPMI içinde.
  4. Adım 7,3 870 x g 3 dk de RBCs santrifüj kapasitesi ve süpernatant RBC Pelet kaldır.
  5. RBC Pelet adım 6.2 DNA/cytomix karışımı ile ve 0.2 cm Elektroporasyon küvet transfer resuspend.
  6. Electroporate aşağıdaki koşullar kullanarak RBCs: 0,32 kV, 925 μF, "Yüksek kap" ayarlı direnç kapasitans ayarla "Sonsuz".
  7. Elektroporasyon içeriği tam RPMI (cRPMI) için bir 15 mL konik içeren 5 mL küvet aktarın. 870 x g 20 ° C'de 3 dk de tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
    Not: cRPMI % 0.25 (w/v) lipid zengini Sığır serum albümin ilavesi ile eksik RPMI olarak aynı yöntemi ile hazırlanır.
  8. Pelet 4 ml cRPMI ve bir 6-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda transfer resuspend. Bir yüksek-schizont kültürün 400 μL ekleyin (7-%10 schizont parasitemia idealdir) transfected RBCs için.
    Not: Parasitemia parazit bulaşmış RBCs yüzdesi olarak tanımlanır.
  9. Ertesi gün, kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 870 x g 3 dk de kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Kültür 4 mL cRPMI resuspend.
  10. Adım 7,6, tamamladıktan sonra 48 h kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 1 mikron içeren cRPMI kültür resuspend DSM1 Cas9 plazmid için seçin.
  11. Parazitler artık kan yayması tarafından görünür hale gelene kadar her gün cRPMI ile kültürler yıkama devam edin. Bu noktadan sonra taze cRPMI artı 1 mikron ile kültür orta yerine DSM1 her 48 h.
    1. Bir kan yayma, kültür 150 μL 0.6 mL santrifüj tüpüne pipet yapmak. Hücreleri tarafından Santrifüjü 1.700 x g 30 de cips s.
    2. Süpernatant Aspire edin. Bir pipet pelleted hücreleri bir cam slayt aktarmak için kullanın. İlk slayt için 45 ° açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık yayma. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir boyama seti kullanarak slayt leke.
    3. Bir 100 X yağı daldırma amacı istimal parazitler görüntüleyin.
  12. 5 gün başlayan sonrası transfection (7,6. adım) kaldırmak 2 mL kültür kültür ortamında resuspended RBCs ile. Taze orta arka 2 mL ekleyin (cRPMI artı 1 mikron DSM1) ve % 2 hematokrit kana. Bir kez bir hafta öncesine kadar parazitler yeniden, taze kan ince kan yayması (adım 7,11) tarafından belirlenen bu şekilde ekleyin.
    Not: Tümleştirme başarılı olursa, parazitler genellikle kültüründe bir ay sonrası transfection tarafından yeniden görünür.
  13. Bir kez parazitler reemerge, DSM1 uyuşturucu basıncı kaldır. Alternatif olarak, parazitleri dışarı klonlanmış sonra uyuşturucu basınç kaldırın.

8. kontrol parazitler için onarım şablon entegrasyon

  1. Parazitler daha ince kan yayması tarafından görünür olduğunda, DNA uygun bir seti kullanarak kültüründen izole et.
  2. PCR değiştirilmiş bölge hedefli locus başarıyla değiştirildi ve değiştirilmemiş vahşi tipi odağı (vahşi tipi parazitler gösterge) tespit ise belirlemek için genomunun yükseltmek için kullanın.
    1. Onarım şablon entegre etmiş parazitler algılamak için klonlanmış Homoloji bölge dışında ORF başında oturur ileri bir astar kullanın. İçinde 3'-UTR'nin oturur ters bir astar kullanın.
      Not: Bu amplifikasyon HA Etiketler ve glmS ribozyme dizileri içerir, amplicons entegre parazitler gelen vahşi tipi parazitler içinde güçlendirilmiş aynı bölgede daha uzun olacaktır.

9. seyreltme sınırlayarak parazitler klonlama

  1. Parazit kültürünün seri dilutions adımı 7,13 0.5 parazitler/200 μL son bir konsantrasyon elde etmek için gerçekleştirin. 200 μL seyreltilmiş kültürünün bir 96-iyi doku kültürü tabak wells için ekleyin.
    Not: çünkü parasitemia enfekte RBCs yüzdesi olarak tanımlanır ve hematokrit tanımlanmış numarası (% 2) Ayrıca, parazitler birim hacim başına sayısı kolayca anlaşılmaktadır.
    1. 1 mL cRPMI %5 parasitemia ve % 2 hematokrit, kültür hazırlamak (Bu parasitemia ve hematokrit düzeylerinde kültürü 1 x 107 parazitler/mL içerir).
    2. CRPMI ile bu kültür 1: 100 oranında seyreltin. Yine cRPMI ile 1: 100 oranında seyreltin.
    3. 1: 400 oranında seyreltin. Bu seyreltme 25 mL cRPMI ve 1 mL kan kültür 62.5 μL ekleyerek gerçekleştirin. Bu seyreltme 0.5 parazitler/200 μL istenen konsantrasyon sonuçlanır.
  2. Parazitler wells için yapılan tespit olana klonlama plaka korumak.
    1. Her 48 h, 96-şey plaka ortamda ile taze orta yerine.
    2. Haftada bir kez, klonlama plaka (adım 9.1) başlayan sonra 5 gün başlayarak, her kuyudan 100 μL kaldırın ve geri 100 μL taze orta + kan (%2 hematokrit) ekleyin.
  3. Parazit içeren herhangi bir kuyu tanımlayın.
    1. 96-şey plaka için yaklaşık 20 dk kan plaka içinde bir açıyla yerleşmek izin, bir 45 ° açıyla yerleştirin.
    2. 96-şey plaka üzerinde bir ışık kutusu yerleştirin. Parazit içeren wells asitleştirme parazitler tarafından orta nedeniyle parazit ücretsiz Wells pembe medyaya göre renkli, sarı bir medya içermediğine dikkat edin.
    3. Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren wells içeriğini parasitemia genişlemesi izin vermek için bir 24-iyi doku kültürü plaka taşı.
    4. PCR analiz 8. adımda açıklandığı gibi kullanarak, bu klonal parazit satırları doğru tümleştirme için denetleyin.

10. nakavt parazitler Glucosamine ve Western Blot analizi yoluyla onay ile davranarak protein

  1. -20 ° C'de depolanan bir 0, 5 M GlcN (glucosamine) hisse senedi çözüm hazırlamak
  2. Ve GlcN huzurunda büyümeye izin GlcN glmS parazit kültürler için ekleyin.
    Not: Son konsantrasyon ve zamanlama GlcN tedavi deney ve parazit hatta bağlıdır. Yani hassasiyeti bileşiği belirlemek için bir Aralık GlcN konsantrasyonları ebeveyn parazit zorlanma maruz GlcN parazit büyüme, etkileyebilir. Çoğu zaman, bir konsantrasyon 2.0-7.5 mm GlcN kullanılan13,14,20' dir.
  3. Protein örnekleri13GlcN tedavi parazitleri izole et.
  4. Protein örnekleri western blot analizi için protein13' te indirimleri algılamak için kullanır.
    1. Üreticinin yönergelerine uygun bir anti-HA antikor HA glmS öğesini protein algılamak için kullanır. PfEF1α gibi bir yükleme denetim HA gruba karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan bu yöntem yanı sıra bir kalkan mutasyon örneği plazmid şematik resim 1' de gösterilmiştir. Transfection sonra mutant parazitler nasıl bir örnek olarak, HA -glmS yapı entegrasyonu denetimi PCR sonuçlarını Şekil 2' de gösterilir. Klonlama bir tabak temsilcisi bir görüntüsünü parazitler huzurunda orta renk değişimi göstermek için Şekil 3 ' te gösterilmiştir. Bir ayirt tahlil ve weste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA -glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyonların etiketleme de dahil olmak üzere ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O'Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gene Pulser Xcell ElektroporatörBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElektroporatörBio-Rad165-2086Ayrı ayrı sarılmış olanları satın alıyoruz
Sodyum AsetatSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Hediyesi Akhil Vaidya laboratuvarıGanesan'dan et al. Mol. Biyokimya. Parazitol. 2011 177:29-34
TPP Doku Kültürü 6 Kuyulu PlakalarMIDSCITP92006
TPP 100 mm Doku Kültürü Kapları (12 mL Plaka)MIDSCITP93100
TPP Doku Kültürü 96 Kuyulu PlakalarMIDSCITP92096
TPP Doku Kültürü 24 Kuyulu PlakalarMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs
T4 DNA PolimerazNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop şişe üstü filtre ünitesiMilliporeSCGPU10REİhtiyaçlarınıza uygun herhangi bir boyutta kullanabilirsiniz
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2>Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
Muralidharan Laboratuvarı tarafından üretilen
Jose-Juan Lopez-Rubio Laboratuvarı'ndanpUF1-Cas9Ghorbal et al. Nature Biotech 2014
GlikozSigma-AldrichG7021-1KG
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS5761-500G
Sodyum piruvatSigma-AldrichP5280-100G
HipoksantinSigma-AldrichH9636-25G
Gentamisin ReaktifiGibco15710-064
TimidinSigma-AldrichT1895-1G
Muralidharan Laboratuvarı Tarafından ÜretilenPL6-eGFP BSD
NucleoSpin Jel ve PCR TemizlemeMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AParazitlerin en iyi şekilde ne yetiştireceğini öğrenmek için birkaç parti denemek isteyeceksiniz
İnsan Kırmızı Kan HücreleriInterstate Blood Bank, IncE-posta gönderin veya sipariş için doğrudan arayınGenellikle O + kan
3D7 parazit hattıİstek üzerine temin edilebilirN/A
Lizojen Et Suyu (LB)FisherBP1426-2Kendiniz yapabilirsiniz, tam olarak bu
AmpicilinFisherBP1760-25'iSuda 100mg / ml'de 1000X stok yapıyoruz ve -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alpha'daDr. Daniel Goldberg'in LaboratuvarıSt. Louis'deki Washington ÜniversitesiBatı lekeleri için tercih ettiğiniz yükleme kontrolünü kullanabilirsiniz. Bu sadece laboratuvarımızda kullandığımız
Sıçan Anti-HA Klonu 3F10, monoklonalRoche tarafından üretilen, Sigma tarafından satılan,11867423001Tercih ettiğiniz anti-HA antikoru
0.6 mL tüpleriFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOKOL* Hema 3* Manuel Boyama Sistemi (Fiksatif+Solüsyon I ve II)Fisher22-122-911Giemsa boyasını
da kullanabilirsinizFisherfines Premium Buzlu Mikroskop Slaytları - Boyut: 3 x 1 inç.Balıkçı12-544-3
HindIII-HF New England Biolabs#R3104S #R3131L HEPES sigma-Aldrich H4034-500g pMK-U6 n/a Muralidharan Lab n/a tarafından üretilen pHA-glmS Muralidharan Lab n/a tarafından üretilen Hediyesi PL6-eGFP Muralidharan Laboratuvarı Tarafından Üretilen gRNA kullanırız kullanmanıza gerek yoktur saklıyoruz kullanabilirsiniz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310(2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727(2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plasmodium FalciparumGlmS NakavtProtein EtiketlemeGen NakavtElektroporasyon Tekni iWestern Blot Analizimm nofloresan AnalizKan Yaymas Haz rlama

İlgili makaleler