Yöntem makalesi

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

DOI:

10.3791/57755

⸱

20 Ekim 2018

 , 
1Fox Chase Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş protein-protein etkileşimleri çok sayıda sinyal olayı için temel bir ilke vardır ve bu tür olayların tespiti böyle yolları nasıl düzenlendiğini ve şekilleriyle anlamada önemli bir unsurdur. Protein-protein etkileşimleri hücrelerde algılamak için pek çok yöntem vardır, ancak nispeten az endojen proteinler arasındaki etkileşimler algılamak için kullanılabilir. Böyle bir yöntem, yakınlık ligasyonu tahlil (PLA), kullanımı tavsiye bir çok avantajı vardır. Protein-protein etkileşimi analiz ortak diğer yöntemlerine göre PLA nispeten yüksek duyarlılık ve özgüllük vardır, çok az hücre düzenleme ile burada açıklanan protokol yapılabilir, sadece iki hedef özgü gerektirir antikorlar farklı türlerden elde edilen (e.g., fare ve tavşan) ve bir özel reaktif: bir dizi belirli kovalent bağlı oligonucleotides olan ikincil antikorlar, birbirine yakın getirdiğimde, oluşturmak bir situ PCR veya çalışırken daire amplifikasyon amplifiable platformu. Bu sunum, biz MST1 ve MST2 yakınlık sabit hücrelerdeki değişiklikler görselleştirmek için PLA tekniği uygulamak gösterilmiştir. Bu el yazması açıklanan tekniği, özellikle hücre çalışmaları sinyal analizi için geçerlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MST1/Hippo sinyal kesintileri gelişimsel bozuklukları ve karsinojenezis1bağlı olmuştur. Memelilerde, MST1 ve MST2 kinaz etkinleştirin (fazdan) MOB1 ve LATS1/2, ikincisi olan daha sonra phosphorylates ve transkripsiyon ortak harekete geçirmek Evet ilişkili protein (YAP)2inaktive. Etkin (unphosphorylated) haliyle YAP oncogenic etkinlik, hücre proliferasyonu genlerin transkripsiyon artırılması vardır; Bunun tersi olarak, YAP Hippo yolu tarafından inaktive, hücre çoğalması bastırılır ve Apoptozis3terfi. Dokularda, esas olarak active homodimers, MST1 ve MST2 var ama oncogenic uyaranlara MST1/MST2 heterodimers düzeyleri artırabilir ve böyle heterodimers etkin olmayan4vardır. Ancak, MST1/MST2 heterodimerization nasıl düzenlenir kötü anlaşılır kalır. Homo - hem heterodimers aracılı ile C-terminal dolandı-coil MST1 bölgelerinde ve SARAH etki alanları5olarak bilinen MST2 arasındaki etkileşimler vardır. Bir in situ kullanarak PLA Bu makalede, biz insan Schwann hücreleri (HSC) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1/MST2 heterodimers varlığını göstermek gösterdi. Tespit ve transgene ifade ihtiyacı veya epitope Etiketler kullanımı sayısal endojen protein-protein etkileşimleri algılanmasını sağlar çünkü PLA diğer protein/protein etkileşim algılama yöntemleri üzerinde bir avantaj vardır 6.

Sinyal iletim yollarının büyük ölçüde bileşen proteinler koşullu Derneği tarafından kontrol edilir. Örneğin, çoğu reseptör Tirozin kinaz uyarılması kendi homo veya heteroseksüel dimerization ve ek hücre içi sinyal proteinleri, kendilerini izleyen ilişkilendirmesiyle formu daha fazla kompleksleri yol açar. Proteinler daha az 30-40 nm parçalara olması koşuluyla PLA yöntemin amacı hücrelerdeki proteinler arasında yakınlık görselleştirmek etmektir. Protein yakınlık genellikle ilk hücre içinde farklı tür kaldırdı uygun birincil antikorlar ile kuluçka tarafından tespit (Örn., tavşan ve fare) karşı etkileşen her protein, sonra species-specific ikincil antikorlar, ekleme önceden birleştiğinde kısa DNA sondalar. DNA probları yakın iseniz, belirli bir bağlantı DNA oligonükleotid aynı anda hem in situ PCR veya daire mekanizması haddeleme tarafından amplifikasyon için bir platform oluşturan Bu sondalar bağlayabilirsiniz. Floresan Etiketler amplifikasyon tepki eklendi görselleştirme kolayca sayılabilir ve hücre7,8, belirli bölgelere lokalize floresan noktalar olarak görünür etkileşen proteinlerin izin 9 , 10.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması çözümleri

  1. Sabitleştirici çözüm hazırlamak: %4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS. 10 mL için 2.5 mL % 16 almak PFA ve 7,5 mL 1 x PBS ekleyin.
    Tehlikeler: İngiltere'de yılın düşük dozlarda kanserojen. Duman ve Ciltle temas tehlikeli. -20 ° C'de mağaza
  2. Permeabilization çözüm hazırlamak: %0,1 1 x PBS Triton X-100. 100 mL için çözeltisi, Triton X-100 100 µL 100 mL 1 x PBS ekleyin. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.
  3. Yıkama arabellek hazırlayın: 1 x TBST. 1 L için 10 x TBS 100 mL, dH2O 890 mL ve 10 mL Tween 20 (% 10) alın.
  4. Engelleme çözüm paketi tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 2 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.
  5. Antikor seyreltici kit tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 1 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.

2. kaplama hücre

Not: Bu çalışmada, kullandığımız ölümsüzleştirdi insan Schwann hücreleri (iHSC) ve insan embriyonik böbrek 293 hücreleri (HEK 293); Ancak, bu yöntem yapışık hücreleri birçok türü için kullanılabilir.

  1. Kültür HEK 293 yılında % 10 ile desteklenmiş DMEM FBS, %0.2 glikoz, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin doku kültürü tedavi plakaları 37 ° c % 5 CO2. İHSC kalem/Strep ve 2 µM forskolin FBS/DMEM takıma % 10 sürdürmek. Rutin test hücreleri Mikoplazma için. Hiçbir hücre satır kimlik doğrulaması gerçekleştirildi.
  2. 16-iyi odası slayt 10 µg/mL doğal fare laminin veya % 0,01 poli-L-lizin çözüm 50 µL ile ceket ve % 5 CO237 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. %0,04 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri bölün.
  3. Plaka iHSC ve HEK-293 yılında 100 µL % 80 izdiham (15.000-25.000 hücreler/de), orta.
  4. Kuluçkaya hücreler için 12-24 saat içinde oksijen, 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka makinesi.

3. fiksasyon ve Permeabilization

  1. Orta kuyulardan kaldırmak ve 1 x PBS 100 µL ile yıkayın. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
  2. Hücreleri 4 PFA ücret iyi ve ajitasyon olmadan, RT, 10 min için kuluçkaya % 50 µL ekleyerek düzeltmek. Hücreleri dekolmanı duyarlıdır, yani doğrudan hücreleri üzerine çözümleri pipetting önlemek.
  3. % 0.05 hücrelerle yıkama 5 min için üç kez TBST. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
  4. Ajitasyon, RT. olmadan 10 dk permeabilization çözüm (% 0,1 Triton x-100 1 x PBS içinde) hücrelerle tedavi
  5. TBST hücrelerle ajitasyon ile her 5 min için üç kez yıkayın.

4. engelleme

  1. TBST (micropipette) ile çok nazikçe kapalı dokunun. Hücreleri bağlı kalır eğer görmek için mikroskop slayt görselleştirin.
  2. Bir damla (50-60 µL) 1 x engelleme çözüm her örnek için ekleyin.
  3. 37 ° c nem odası (su ile boş ipucu kutusunu) ön ısı ve bu slaytları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya

5. birincil antikorlar

  1. Birincil antikor (1: 100) antikor Dilüent seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek). İyi başına 40 µL antikor çözüm hazırlamak.
  2. Engelleme çözüm sıvı kapalı dokunarak slaytlardan kaldırmak. Hücreleri kuru izin vermez.
  3. Girdap ve her şey için antikor çözümleri 40 µL ekleyin.
  4. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.

6. yakınlık ligasyonu tahlil probları

Not: PLA probları bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Seçtiğiniz probları bir birincil antikorlar faiz proteinlerin algılamak için kullanılan türler üzerinde bağlıdır.

  1. İki PLA problar (Anti-fare eksi ve anti-tavşan artı) seyreltik 1: 5'te antikor seyreltici. Her örnek için 40 µL PLA inceleyebilirsek hazırlayın. Karışım RT., 20 dk için kuluçkaya
  2. Slaytları birincil antikor çözümden kapatmak dokunun. 5 min her arabellek yıkama ile iki kez slaytlarını RT. yıkama
  3. Yavaşça slaytlardan yıkama tamponunun dokunun ve seyreltici PLA sonda çözüm wells (40 µL/de) ekleyin.
  4. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h için slaytları kuluçkaya

7. tüp ligasyonu

Not: in situ algılama reaktifler kırmızı, ligaz ve ligasyonu çözüm bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme).

  1. Situ algılama reaktifler kırmızı kullanın.
  2. Hemen önce kullanmak, girdap ve 5 x 1:5 içinde yüksek saflıkta su tüp ligasyonu stok gerekli miktarda oranında seyreltin.
    Not: seyreltilmiş reaktifler depolamayın.
  3. Slaytları PLA sonda çözümden uzak dokunun. 1 x 5 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
  4. Hemen önce ek örnekleri, girdap ve ligaz ligasyonu 1:40 ekleyin seyreltme ve tekrar girdap.
  5. Slaytları yıkama arabelleğinden kapalı dokunun ve her şey (40 µL/de) tüp ligasyonu/ligaz çözüm ekleyin.
  6. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 30 dk için slaytları kuluçkaya

8. güçlendirme

Not: Amplifikasyon hisse senedi bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Reaktifler ışığa duyarlı vardır; Böylece ışık slaytlara kullanılmasını önlemek.

  1. Girdap ve 5 x amplifikasyon hisse senedi 1:5 yüksek saflıkta su gerekli miktarda sulandırmak ve karıştırın.
  2. Slaytları ligasyonu/ligaz çözümden uzak dokunun. 1 x 2 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
  3. Girdap ve polimeraz 1:80 seyreltme ve girdap güçlendirme çözüm yeniden ekleyin.
  4. Yıkama tampon slaytlardan dokunun ve her şey (40 µL/de) güçlendirme/polimeraz çözüm ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 100 min için slaytları kuluçkaya

9. görüntüleme için hazırlık

Not: Bu ışık duyarlı reaktifler vardır. Işıktan korunan slaytlar tutun.

  1. Slaytları amplifikasyon-polimeraz çözümden uzak dokunun ve iki kez 10 dk içinde her 1 x yıkama arabellek RT., yıkama
  2. Odalar ve silikon wells etrafında slayttan tamamen kaldırın. Silikon kalan parçaları bir ustura ile kazı. Her ayıran slayt üzerinde bir tablo çizmek de.
  3. ~ 40 µL DAPI ile montaj ortamının ekleyin. Kapak notu altında hava kabarcıkları yakalama önlemek dikkatli olun. Kapak notu kenarlarını oje ile kapalı gibi.
  4. Confocal bir mikroskop kullanarak görüntü analizi yapmadan önce en az 20 dakika bekleyin.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.
  5. Görüntüleme sonra karanlıkta slaytlar-20 ° C'de depolayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLA tahlil HEK-293 ve iHSC MST1 ve MST2 arasındaki etkileşimi sınamak için kullanılır. Hücreleri sabit, permeabilized ve in situ amplifikasyon PLA Protokolü (Şekil 1) göre ardından çeşitli antikorlar ile lekeli. MST1/MST2 heterodimerization düzeyini belgelemek için hücreleri MST1 ve MST2 antikorlar ile (Şekil 1A, 1 C ve 1 G) lekeli. Pozitif kontrol olarak biz de ERK kullanılır ve hücrelerle birbirine yak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cam odası slaytlar gibi çok çeşitli (14-16) hücre hatları ile deneme gerçekleştirmek uygundur ve örnek mikroskobu analizi sırasında her zaman değiştirmek için gerek yoktur bu deneme için kullanmak yararlı bulduk. Bir antikor ile çapraz bulaşma riski gibi bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, biz her şey yıkama öneririz deneme artan süre rağmen bir Coplin kavanoz kullanmak yerine tek tek. Buna ek olarak, silikon Ekle kaldırılması hassas bir meseledir ve özen ve sabır ile yapılmalıdır. Bile titiz tekniği ile b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En iyi duruma getirme ve bu protokol, belirli Maria Radu ve Galina Semenova, doğrulanması için katkıda bulunmak için tüm Chernoff laboratuvar teşekkür ediyoruz. Andrey Efimov hücre Imaging tesisin Fox Chase Kanser Merkezi ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser NIH (R01 CA148805) bir hibe için Dizayn Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Oda slaytlarıThermo Fisher Scientific178599 16 kuyulu, cam slaytlı
PLA probu Anti-Fare EksiSigma-AldrichDUO920041x Engelleme solüsyonu, 1x antikor Seyreltici
PLA Probu Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO920021x Bloke Edici Solüsyon, 1x Antikor
Seyreltici Yıkama Tamponları, FlurescenceSigma-AldrichiçerirDUO82049Yıkama Tamponu A ve Yıkama Tamponu B
DAPISigma-AldrichDUO82040
Tespit ReaktifleriSigma-AldrichDUO920085x Ligasyon, 1x Ligaz, 5x Amlifikasyon Kırmızısı, 1x Polimeraz
p44/42 MAPK (Erk1/2) AntikorHücre Sinyali9102s
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)Hücre Sinyal5726spERK antikoru
MST2 antikoruHücre Sinyalizasyonu3952s
Krs-2 (RJ-5)Santa Cruzsc-100449MST1 antikoru
%16 ParaformaldehitElektron mikroskobu bilimleri15710Çözeltiyi sabitlemek için PBS'de% 4 PFA'ya seyreltin
Triton x100Fisher BioReagentsBP 151-500Geçirgenlik çözümü için 1xPBS'de %0,1 Triton x-100 hazırlamak için
Konfokal mikroskopiLeica TCS SP8, 63xImageJ yazılımı ile görüntü analizi
içerir ile Montaj Ortamı Kırmızı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
  2. Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  3. Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
  4. Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
  5. Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
  6. Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
  7. Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  8. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  9. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Protein Etkile imiMST1 MST2 HeterodimeriIn Situ TespitPrimer AntikorlarPLA ProblarLigasyon AmplifikasyonuFloresan Sinyal TespitiFikse Edilmi H cre AnaliziMikroskobik G r nt leme

İlgili makaleler