Yöntem makalesi

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

DOI:

10.3791/57766

⸱

27 Eylül 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hücre -Mycobacterium abscessus etkileşimleri çalışmaya iki protokol mevcut: transposon mutant kitaplığa bakteriyel hücre içi eksikliği ve bakteriyel hücre içi transcriptome RNA üzerinden belirlenmesi için tarama sıralama. Her iki yaklaşımın genomik avantajları ve hücre içi bakteri fitness artırılması transcriptomic uyarlama içgörü sağlamak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ne diğer saprofit mikobakteriler Mycobacterium abscessus farkı insan makrofajlar tarafından fagositoz direnmeye becerisi ve yeteneği bu tür hücrelerin içinde çarpmak için olduğunu. Bu virülans Özellikler M. abscessus patojen, özellikle de temel yapısal akciğer hastalığı, kistik fibrozis, bronşiektazi veya tüberküloz gibi savunmasız ailelerle render. Nasıl hastalar M. abscessus ile enfekte olma belirsizdir. Aksine birçok mikobakteriler, M. abscessus ortamında bulunmayan ancak amip, M. abscessusiçin potansiyel bir rezervuar temsil çevre fagositler içinde bulunur. Nitekim, M. abscessus amoebal fagositoz dayanıklıdır ve M. abscessus virülans enfeksiyon, deneysel bir modeli artırmak için Intra-amip hayat gibi görünüyor. Ancak, az M. abscessus virülans kendisi hakkında bilinir. M. abscessus hücre içi yaşam için bir avantaj veriyor genlerin deşifre için M. abscessus transposon mutant kitaplığa bir tarama geliştirilmiştir. Buna paralel olarak, hücre içi mikobakteriler RNA çıkarma amip ile ortak kültür sonra bir yöntem geliştirildi. Bu yöntem doğrulanmış ve bütün M. abscessus sıralama izin transcriptomes hücrelere; , ilk kez, M. abscessus adaptasyon hücre içi yaşam için bir genel görünüm sağlar. Her iki yaklaşımın insanlarda airways kolonize etmek M. abscessus etkinleştirmek M. abscessus virülans faktörleri içine bir fikir verin.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cins Mycobacterium zararsız saprofit canlılar için büyük insan patojenleri değişen türler içerir. Mycobacterium tüberküloz, Mycobacterium marinum ve Mycobacterium ulcerans gibi iyi bilinen patojen türün ait yavaş büyüyen alt için mikobakteriler (SGM). Buna karşılık, alt grup hızlı büyüyen mikobakteriler (RGM) 7 günden daha az sürede agar ortamdaki görülebilir koloniler kurmaya yeteneklerini karakterizedir. RGM grup 180'den fazla tür, özellikle patojenik olmayan saprofit mikobakteriler oluşmaktadır. Onların ana bilgisayarlarla RGM etkileşimleri üzerinde çalışmalar çoğunlukla Mycobacterium smegmatis üzerinde odaklanmıştır ve bu mikobakteriler makrofajlar bakterisidal eylem tarafından hızla ortadan kalkar gösterilmektedir.

Mycobacterium abscessus insanlara patojenik nadir RGM biridir ve çok çeşitli deri ve yumuşak doku enfeksiyonları pulmoner ve dissemine enfeksiyonlara karşı değişen enfeksiyonlar sorumludur. M. abscessus , Mycobacterium aviumile birlikte, kistik fibrozis hastalarının1ana Mikobakteriyel patojen olarak kabul edilir.

Bu yol hücre içi bir patojen, makrofaj ve fibroblast akciğer ve deri, genellikle RGM içinde gözlenen değil bakteri yok edici yanıt kalan yeteneğine gibi davranır M. abscessus üzerinde yapılan çeşitli araştırmalar gösteriyor 2 , 3 , 4. M. abscessus Genom Analizi metabolik yollar genellikle çevresel mikroorganizmaların toprak ile temas halinde bulunan tespit, bitkiler ve su ortamları, nerede ücretsiz amip çoğu kez mevcut5. Onlar de M. abscessus muhtemelen yatay gen transferi bir niş toplamak genetik Exchange'e olumlu tarafından alınan saprofit ve patojenik olmayan RGM bulunamadı birkaç virülans genler ile donatılmış olan göstermiştir çeşitli amip dirençli bakteri.

Deneysel, ilk çarpıcı sonuçlardan biri de M. tuberculosis6gelince makrofajlar M. abscessus hücre içi büyüme gözlem idi. M. abscessus da phagosome, apoptozis ve autophagy, üç temel mekanizmaları enfeksiyon2hücresel direnç asitleştirme direnir. Hatta M. abscessus phagosome ve sitozol, bakteriyel çarpma2lehine bir daha fazla besin zengin ortam arasında hemen bir iletişim kurmak mümkün olduğunu gösterilmiştir. Çok az M. abscessus sahip veya hücre içi bir ortamda hayatta kalma izin vermek için satın aldı genomik avantajları hakkında bilinir. Amip coculture birçok yeni amip dirençli bakteri yalıtım Mycobacterium massiliense7,8olarak izin verimli bir yöntemdir. M. abscessus kloroformu farelerde, M. abscessus4artan bir virülans görüşmek, bir modeli içinde amip çarpmak için bir yetenek gözlendi. M. abscessus genetik özellikleri patojenik olmayan diğer RGM farklı fagositik hücreleri hayatta kalmak için bu ortamda karşılaştı gelişen bir hipotezdir. Bu satın alma yeteneği yaymak için ve onun virülans insan ev sahibi lehine.

Bu rapor araç ve amip ortamda hayatta kalmak için M. abscessus haiz genomik avantajları vurgulamak için yöntemleri açıklar. Bu amaçla, M. abscessus transposon mutantlar ile taranması ilk, mutantın arızalı hücre içi büyüme için kimliği sağlar Acanthamoeba castellanii türü zorlanma üzerinde tanımlanır. Makrofajlar içinde ikinci bir tarama, bu kusur insan konukçuda devam edip etmediğini onaylamak için de bildirilmektedir. İkinci olarak, hangi mekanizmalar fagositik hayata adapte M. abscessus harnessed vardır anlamak için hücreleri ve onun virülans hayvan ev sahibi, M. abscessus için özel olarak uyarlanmış bir yöntem olduğunu artış, sonra ortak kültür geliştirilen Toplam RNA çıkarma içi amoebal bakteri izin amip huzurunda. Sonuç olarak, hücre içi bir yaşam için gerekli olan M. abscessus genler kapsamlı bir görünümünü geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kütüphane tarama

  1. İnşaat Tn mutant Kütüphanesi
    1. Transposon Kütüphane elde edilir.
      Not: Bu deneme için EJ Rubin, Harvard Halk Sağlığı Okulu, Boston, ABD transposon mutant Kütüphane elde edildi. Kütüphanede bir pürüzsüz klinik yük (43S), M. abscessus karmaşık (M. abscessus subsp. massiliense) bir phagemid tek bir Tn rasgele ekleme izin M. abscessus tanıttı ile inşa edilmiştir TA dinükleotit ( M. abscessus genom 91,240 TA serilerini) içine. Daha fazla bilgi için bkz: başvurusu Rubin vd. 9 ve Laencina vd. 10.
  2. Kütüphane ve koruma plakaları M. abscessusTn mutantların titrasyon
    Not: Bu bir hafta sürer.
    1. Kütüphanede buz çözme. 1 mL su (10-1 10-15) seri dilutions gerçekleştirerek bakteri konsantrasyonu belirlemek. Her seyreltme 250 mg/mL sefaloridin ile 7 H 11 agar ortam içeren bir petri üzerinde bir damla plaka. Plakayı 37 ° C'de 3-4 gün için kuluçkaya.
      Not: Burada, 1011 bakteri/mL titrasyon iyileşti.
    2. Kütüphanede konsantrasyonu belirledikten sonra 3.000 bakteri/mL 10 mL % 25 gliserol-su son bir konsantrasyon kitaplığına oranında seyreltin. Aliquot 10 cryotubes her tüpün kütüphanede 1 mL ile kütüphanede. Aliquots-80 ° C'de depolayın
    3. Kullanmaya hazır olduğunuzda, seyreltilmiş buz İnternet üzerinde bir aliquot çözülme ve kuluçka 37 ° C'de 3-4 gün sonra 200-300 bireysel kolonileri kurtarmak için (ölçüler 12 cm) 10 kare Mueller Hinton (MH) ağar kaplamalar için 100 µL Kütüphane eklemek
    4. Steril kürdan ile transfer 96-şey tabak içine tek tek koloniler (6.000 kolonilerde 60 x 96-şey plakaları) 7 H 200 µL ile 9 orta takıma %0.2 gliserol, % 1 glikoz, 250 mg/mL sefaloridin ile dolu. 37 ° C'de sallayarak olmadan 5 gün kuluçkaya.
    5. (Adım 1.2.4) kültürünün 100 µL 7 h 9 100 µL içeren bir 96-şey tabak transfer % 40 gliserol ile orta. Sipariş edilen Kütüphane-80 ° C'de depolayın
    6. 1.2.3 adımları yineleyin. 1.2.5 için. Kütüphanede 10,000 bireysel klonlar kadar geri kalanı ile (100 x 96-şey plaka ve 30 MH plakaları çevresinde) kazanılmaktadır.
  3. Amip hazırlanması
    1. Amip Acanthamoeba castellanii (AC) 75 cm2 doku kültürü şişeler PYG Orta (Tablo 1) amplifikasyon hücre satır11için 30 ml (RT) Oda sıcaklığında kültür.
      Not: Çok sayıda sindirim çarpıtmalar ile büyük yapışkanlı hücrelerden olgun trophozoites mikroskop üzerinde açıkça görülebilir. Zaman iki katına hücre 25 h. hücreleri olmak her 3 günde 75 cm2 doku kültürü şişeler ilk kültüründe üçte biri yayarak güçlendirilmiş tahmin edilmektedir.
    2. 25 mL pipet ile PYG orta kaldırın. Herhangi bir karbon veya azot kaynakları12içermiyor AC tampon (Tablo 2), 10 mL hücrelerle yıkayın. Yıkama iki kez daha tekrarlayın.
      Not: hiçbir karbon veya azot kaynağı içeren AC arabelleği mikobakteriler ekstraselüler gelişimini önler. Bu en az orta amip encystment için yol açar. Bu sınırlamak için ısı inaktive E. coli olduklarını da sözlerine ekledi bir substrat (adım 1.4) amip için ve çok kısa kültür kez (eleme mutant için 48 h) ve 4 h veya 16 h kültür RNAseq deneyler için terfi edildi. Alternatif olarak, bu orta zenginleştirilmiş ama PYG Orta (genellikle % 10) kullanın.
    3. Balonun altındaki tek bir güçlü sallamak için doku kültürü şişesi ile amip bağlantısını kesin.
    4. Hücre konsantrasyonu 5 x 105 amip/ml ayarlamak için bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama AC arabellekte seyreltilmiş.
  4. Hazırlık ısı inaktive Escherichia coli bakteri amip enfeksiyon sonra beslemek için
    1. E. coli klinik ayrı tut moduyla zorlanma gecede 37 ° C'de 100 ml Luria suyu (LB) gliserol stoktan büyümek
    2. Santrifüjü 1,835 x g 10 dk 50 mL tüpler için de tarafından bakteri hasat. Süpernatant atmak. Pelet 10 mL % 10 gliserol-su ile resuspend. Çamaşır iki kez daha tekrarlayın.
    3. Pelet 5 mL % 10 gliserol-su ile resuspend. Aliquot 0,5 mL 1,5 mL tüpler içine. Seri dilutions performans ve dilutions LB agar tabaklarda ekleyerek bakteri/mL miktarını belirlemek. Aliquots-80 ° C'de depolayın
    4. Amip enfeksiyon, önceki gün bir aliquot buz çözme ve 70 ° c 60 dk için tüp kuluçka tarafından ısı-öldürmeye devam edin.
      Not: inactivation LB agar plakaları gecede 37 ° C'de Inaktif bakterilerin 100 µL kaplama tarafından kontrol Hiçbir kolonileri kültür bir gece sonra görünür olmalıdır.
    5. Isı öldürdü bakteri konsantrasyonu 50 µL AC arabelleği 107 bakteri sulandırmak ve en fazla bir hafta için 4 ° C'de seyreltilmiş bakteri saklayın.
  5. Amip -M. abscessus Tn mutant ortak kültürü: ilk ekran
    Not: Bu 3-4 ay 6.000 mutantlar ile taranması için alır.
    1. 5 x 104 amip/iyi bir 96-şey tabak içinde 100 µL AC arabelleği için yayıldı. 32 ° C'de 1 h için sallayarak olmadan kuluçkaya. Wells için bağlı kalmak kayan amip trophozoïtes zaman tanıyın.
      1. Kuluçka sırasında bakteri 1 h için buz çözme.
    2. Elektronik bir çok kanallı pipet ile çözülmüş bakteri kültürleri 5 µL ekleyin. 96-şey plaka Tn mutantlar hisse senedi 6000 bireyselleştirilmiş klonlar etrafta 1,5 h. ekran için bulaştırmak.
      Not: MOI protokol bu adımda bilinmiyor; Ancak, Tn mutantlar içeren tüm 96-şey plakaları tam olarak aynı şekilde ekili. Bu ilk ekran inoculum dansitesi varyasyonlar dikkate almadan hücre içi eksik mutantlar, kolayca tanımanıza amaçlamaktadır.
    3. Enfeksiyon 1,5 saat sonra AC orta bir duman başlık altında kaldırmak için steril bir metal tepsi yerleştirilir steril gauzes 96-şey tabağa ters çevir. AC orta 200 µL ile tekrar doldur. Bu yıkama iki kez daha tekrarlayın.
    4. Taze orta kalan hücre dışı mikobakteriler ortadan kaldırmak için 100 µg/mL neomisin ile takıma 200 µL ekleyin.
    5. 3 ek yıkama işlemine devam etmeden önce 2 h (1.5.3 adımda anlatıldığı gibi) kuluçkaya. Yıkandıktan sonra AC arabelleği 200 µL 50 µg/mL neomisin ile kültürleri korumak.
    6. 5 x 107 ısı inaktive Escherichia coli bakteri (Kimden adım 1.4) enfeksiyon ve amip encystment önlemek için her 24 saat sonunda ekleyin.
    7. 48 h ortak kültür sonra her şey için 10 µL % 10 SDS (Sodyum Lauryl Sülfat) ekleyerek hücreleri parçalayıcı ve 32 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Seri seyreltme ile devam etmek ve hücre içi mikobakteriler sayısını değerlendirmek için %5 koyun kan (COS plakaları) içeren Columbia agar tabaklarda ekleyin. Parafilm ile plaka mühür ve 37 ° C'de kuluçkaya
    8. Ne zaman koloniler ağar kaplamalar üzerinde 3-4 gün sonra fotoğraf plaka görünür ve mevduat numarası en düşük bakteri kolonileri gözlemleyerek için hücre içi büyüme bozukluğu olan mutantlar tanımlar.
      Not: şekli, yükseklik veya yoğunluğu (Şekil 1A) koloninin hakkında umrumda değil. 136/6000 mutantlar tespit edilmiştir.
  6. Amip -M. abscessusTn mutant ortak kültürü: sırasında belgili tanımlık ilk perde belirlenen mutantların ikinci ekran
    Not: Bu 2 hafta sürer. İkinci bir ekran tam aşılanmış bakteri sayısı ve hücre içi hayatta kalma bakteri 2 gün sonrası enfeksiyon sayısı ölçmek için ilk ekran sonra elde edilen 136 zayıflatılmış mutantlar ile gerçekleştirilmesi gerekir.
    1. Etkilenen her mutant 50 ml 1 koloni büyüdü tüpler 9 orta % 0,2 gliserol, % 1 glikoz ve 250 mg/mL sefaloridin ile desteklenmiş 7 H 20 mL ile dolu. Bakteri veya üssel faz ulaşmak izin (0,6 < OD < 0,8).
    2. Santrifüjü (1,835 x g 10 dk) AC orta tarafından kültür yıkayın. Süpernatant atmak. Bunu yıkamam iki kez 7 H 20 mL ile daha fazla 9 orta % 0,2 gliserol, % 1 glikoz ve 250 mg/mL sefaloridin ile takviye işlemi yineleyin.
    3. Bakteri AC tampon 5 ml resuspend.
    4. Birim (CFU) konsantrasyon mutantların oluşturan colony belirlemek. 24-şey levha, 1 mL su için ilk iki satırı ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 100 µL ilk şey ekleyin. Bir micropipette ile üç kez karıştırın. O zaman, 100 µL ve ikinci para yatırma de Aspire edin.
    5. Yeni bir ipucu ile 1.6.4 ikinci kuyudan üçüncüsü, vb iyi onikinci kadar adımları yineleyin.
    6. 10-12 seyreltme 30 µL Aspire edin ve COS plakasına eklemek. Diğer dilutions için yineleyin.
    7. Çünkü plaka parafilm ile sarın ve 37 ° C'de 3-4 gün kuluçkaya Konsantrasyonu koloniler sayarak belirler.
    8. Ortak kültür deneyleri nüsha bir 24-şey plaka ile 5 x 104 amip AC ortak kültür orta 1 mL bir kuyu başı yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Enfeksiyon (MOI) 10 çeşitliliği ile aşılamak.
    9. Ortak kültür 48 saat sonra ile hücre lizis 1.5.7. adımda anlatıldığı gibi devam edin. Su (10-1 10-6) seri dilutions gerçekleştirmek ve 30 µL COS plakaları için ekleyin. Tabakları CFU sayma ile devam etmeden önce 37 ° C'de 4 gün kuluçkaya.
      Not: Bu ikinci ekran sonra 60 136 mutantların korunmuş.
    10. Onların yaşam hücrelere etkiledi mutantlar saklayın. Bir koloni LB orta gliserol (% 20 son) ya da ticari çözüm ve uzun vadeli koruma lehine ve gelecekteki aşılama kolaylaştırmak ve-80 ° C'de depolamak için lastikteki içeren bir cryotube içeren bir cryotube ekleyin
    11. Vitro mutant büyüme optik yoğunluk (OD) ölçerek değerlendirmek 600 nm 2 günde.
      1. 1 büyümek kolonisi 50 mL tüpler etkilenen her mutant dolu 7H 20 mL ile 9 orta % 0,2 gliserol, % 1 glikoz ve 250 mg/mL sefaloridin ile desteklenmiştir. Bakteri veya üssel faz ulaşmak izin (0,6 < OD < 0,8) OD 0.01 kinetik başlamak için ayarlama önce.
      2. Hücre içi eksik mutantlar dizi WT zorlanma ile karşılaştırıldığında bir vitro büyüme defekt mutantlarla hariç.
  7. Makrofajlar -M. abscessus Tn mutant bir intra-amip ömür boyu kusurlu eş kültürü
    Not: Bu 1 ay alır.
    1. 5 x 104 J774.2 fare makrofajlar zengin Orta, Fetal buzağı Serum (FCS) % 10 ile desteklenmiş DMEM 1 ml 24-şey plaka kuyu başına yayıldı. Plakayı 24 h makrofaj yapışma sağlamak için 37 ° C ve % 5 CO2 için kuluçkaya. 3 çoğaltır sağlar.
    2. Enfeksiyon gerçekleştirin. TN mutantlarla MOI DMEM 100 µL hacmi % 10 FCS ile seyreltilmiş 10, aşılamak.
    3. Enfeksiyon 3 saat sonra 1 mL (bir vakum pompası kullanılabilir) DMEM ile üç yıkama gerçekleştirin. O zaman (içinde DMEM % 10 FCS ile) 250 µg/mL neomisin ile kalan hücre dışı mikobakteriler ortadan kaldırmak 1 h için tedavi.
      1. DMEM 1 mL ile 3 ek yıkar sonra (içinde DMEM % 10 FCS ile) 250 µg/mL neomisin kültürlerde ekstraselüler Mikobakteriyel çarpma önlemek için 1 mL nihai bir birime korumak.
    4. 72 h ortak kültür sonra orta çıkarın ve 1 mL soğuk su ekleyerek makrofajlar parçalayıcı. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
    5. CFU deneyleri hücre içi bakteri sayısını değerlendirmek için COS tabaklarda gerçekleştirin.
      1. 24-şey tabak içinde iki ilk satır için 1 mL su ekleyin. Co hücrenin lysate 100 µL ilk şey ekleyin. Bir micropipette ile üç kez karıştırın. 100 µL Aspire edin ve onları iyi ikinci depozito.
      2. Yeni bir ipucu ile onikinci iyi kadar üçüncüsü, vb ikinci kuyudan seyreltme tekrarlamak. Sonra 10-12 seyreltme 30 µL Aspire edin ve COS plakasına ekleyin.
      3. Diğer dilutions için yineleyin. Çünkü plaka parafilm ile sarın ve 3-4 gün gözlemlemek ve kolonilerin sayımı için bekleyin.
  8. Kimlik ve sıralamanın M. abscessus mutantlar Tn ekleme sitesi
    Not: Bu 60 mutantlar için 1,5 ay alır.
    1. Tanımlanan genomik çıkarma M. abscessus mutantlar
      1. Mutantlar ile 7 H 9 20 mL 50 mL tüp içinde büyümeye orta takıma % 0,2 gliserol, % 1 glikoz ve sefaloridin 250 mg/mL üssel faz (OD6000.8 =).
      2. 10 mL (2,396 x g, 5 min) kültürlerin hasat. Süpernatant atmak. Çözeltinin 500 µL bakterilerde askıya ben (% 25 sükroz, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL lizozim, 40 mM Tioüre). Vida kapaklı 2 mL tüpler içine belgili tanımlık eriyik transfer ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
      3. Çözüm II (% 25 sükroz, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA) 500 µL ekleyin. Pipetting sonra yukarı ve aşağı 5 - 10 kat, 500 µL tüp hacmi kadar Zirkonyum boncuk ekleyin.
      4. Hücre lizis bir homogenizer ile devam (3 x 6000 devir/dakika, 45 s) 1 dk kuluçka her turun arasında buzda ile.
      5. 5 µL (100 µg/mL final) 20 mg/ml İndinavir K ekleyin ve gecede 55 ° C'de örnekleri kuluçkaya
      6. 1 mL soğuk duman başlık altında fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Vortexing RT ve 16.500 x g 30 dakika aralıklarla işlemine devam etmeden önce tarafından örnekleri karıştırın.
      7. Santrifüjü sonra sulu faz kurtarmak ve soğuk fenol/kloroform/izoamil alkol çözümü bir başlık altında eşit bir hacmi ekleyin. 16.500 x g sulu faz tekrar kurtarmak 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi.
      8. RT isopropanol 0.7 hacmi kurtarılan sulu faz bir duman başlık altında ekleyin. Yavaş yavaş DNA yağış izin ve 5 dk RT. az kuluçkaya tüplere ters çevir 16.500 x g ve RT. 10 dk santrifüj kapasitesi
      9. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 500 µL % 70 etanol bir başlık altında ile yıkayın. RT de 16.500 x g , 10 min için tüpler santrifüj kapasitesi etanol çıkarmadan önce. Kalan alkol buharlaşma izin vermek 10 dakikadır kuluçkaya.
      10. Son olarak, DNA Pelet DNaz/RNase free su 100 µL içinde askıya alma. DNA verim ve saflık DNA ile spektrofotometre belirlemek.
      11. 10 U ClaI ile genomik DNA ve Özet 1 µg Tn ekleme sitesi alt klonlama için bir gece için kaldırın. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.
        Not: CIAben enzim M. abscessus genom (2,173 kısıtlama siteler) içinde en çok temsil enzimleri biridir. Bir CIAben kısıtlama site de Tn sırasını ve Tn mutant sefaloridin direnç kaset içinde akıntıya karşı buldum. Böylece, CIA-aracılı subcloning Tn ekleme sitesini tanımlamak için sağlar.
    2. Genomik DNA Tn içeren bir plazmid içinde alt klonlama
      Not: Daha önce Tnile devam-içinde 2,686 bp pUC19 ampisilin dayanıklı plazmid, subcloning eklemek bir CIAben plazmid klonlama birden çok sitenin sitedeki kısıtlama. PUC19 plazmid dizi-ebilmek bulunmak bu bağlantı https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Takip üretici'nın protokol sindirmek pUC19 plazmid ile EcoRiçin ben ve HindIII, 51 bir parçası bültenleri bp ve 2635 bp. bir parçası arındırmak Çift Kişilik sindirilir vektör 51 ortadan kaldırmak için ticari bir PCR arıtma kiti ile kan basıncı yayımlanan parçası.
      2. Mix 1 µL (konsantrasyon 25 pmol/µL) 28 iki tamamlayıcı oligonucleotides (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' ve 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3'), bp her CIAiçeren ben kısıtlama site ve HindIII ucunda ve EcoR Ben kısıtlama siteleri. 10 dk 100 ° C'de ısı ve sonra onları bağlamak için serin.
      3. EcoRtarafından eşleştirilmiş astar sindirmek ben ve HindIII üreticisinin protokolüne göre.
      4. 150 ligate EcoRng ben / RT, 1 h 20 µL. bir son hacmi 1 U T4 DNA ligaz ile eşleştirilmiş astar (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2.5 pmol/µL) farklı konsantrasyon ileHindIII tarafından kısıtlanmış pUC19 plazmid kontrol tarafından farklı bir klonlama enzimatik sindirim.
      5. CIAile değiştirilmiş plazmid sindirmek ben 37 ° C'de 2 h için
      6. 50 ligate CIAtarafından kısıtlanmış pUC19 ngplazmid ve 50 ng genomik DNA'ın CIA tarafından sindirilmişben RT 1 h 10 µL 1 U T4 DNA ligaz ile için.
      7. E. coli electrocompetent bakteri dönüşümü ligasyonu (2500 V, 200 ohm, 25 µF) için 5-10 µL ile devam edin. Klonlar LB agar plakaları 50 µg/mL sefaloridin ve plazmidler bölümleri Tn sıralarının taşıyan bakteriler seçmek için 50 µg/mL ampisilin ile takıma seçin.
      8. Dayanıklı klonlar gecede LB sıvı orta uygun antibiyotik seçimi (50 µg/mL sefaloridin ve 50 µg/mL ampisilin) ile büyümek.
      9. Plazmid DNA ayıklayın. INSERT varlığını enzimatik kısıtlaması tarafından kontrol ve sıra 3' ucu Tn bir oligonükleotid (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') Tn sefaloridin, son 17 baz çifti için karşılık gelen ile kesintiye gen tanımlamak için direnç kaset.
      10. Sıra M. abscessus git 06 zorlanma karşı bir nükleotit patlama (BLAST-N) gerçekleştirerek hizalayın.

2. RNA Rnaseq analiz için hücre içi mikobakteriler çıkarımı

Not: Bu 4 ay deneyler için ve RNAseq analiz için 4 ay sürer.

  1. Amip-M. abscessus gruplar halinde ortak kültürü
    Not: aşağıdaki deneyde, ortak kültür 50 mL tüpler bakteri hücre kişiler lehine ajitasyon ile gerçekleştirilir.
    1. M. abscessus 7 h 9 büyümesi % 0,2 gliserol, 120 rpm'de-üssel faz için % 1 glikoz ile takıma orta.
    2. AC tampon 10 mL ile iki kez bakteri yıkayın.
    3. OD600nm ölçerek bakteri konsantrasyonu tahmin (1 OD600= 4 x 108 mikobakteriler). 8,5 106 amip AC orta 10 ml x 8,5 x 108 mikobakteriler ekleyin.
    4. Nazik ajitasyon (yaklaşık 80 devir/dakika) ile 30 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
    5. Vasıl 253 x g 12 dk. Kaldır süpernatant centrifuging tarafından hücreleri hasat ve AC tampon 10 mL hücrelerde askıya alma. Bu yıkama iki kez daha tekrarlayın.
    6. 10 mL AC tampon ekstraselüler bakterilerin ortadan kaldırmak ve nazik ajitasyon (80 devir/dakika) ile 30 ° C'de 4 h için kuluçkaya 50 µg/mL neomisin içeren hücrelerde resuspend. Hücreleri iki kez tekrar yıkayın.
  2. Toplam RNA'ın çıkarma hücre içi M. abscessus
    Not: adımları 2.2.1–2.2.3 zehirli kimyasalları kullanımı nedeniyle duman başlık altında gerçekleştirin.
    1. Son yıkama sonra 4 mL soğuk çözeltisi III (Tablo 3) enfekte amip amip bozmaya β-mercaptoethanol altercations 280 µL ile resuspend. Guanidinium thiocyanate (GTC) adım bu. Buz 10 dk santrifüj hücre için kızağa lysate 2,396 x g de 30 dk ve 4 ° C için yayımlanan hücre içi bakteri cips korumak için.
    2. Süpernatant çıkarın ve 1 mL soğuk çözüm III bakteriyel Pelet askıya. 2396 x g 4 ° C'de 30 dk için de bakteri hasat Pelet ayıklama tampon ve transfer Zirkonyum boncuk (500 µL geçiş tüp kadar) içeren bir 2 mL vida tüp içine 1 ml resuspend. Tüpler için en az 24 saat-80 ° C'de depolayın
      Not: RNases ve hücre dağılması inactivation lizis reaktif depoda izin verir.
    3. Kullanım için hazır olduğunuzda örnekleri buz çözme ve onları bir homogenizer ile 25 için 6000 devirde iki tur gerçekleştirerek lyse 6000 devirde 20 için bir tur ardından s, 1 dk kuluçka her turun arasında buzda bir iyimsersin.
    4. Örnek soğumasını, 10 min için buz üzerinde kuluçkaya. Sonra kloroform izoamil alkol içinde seyreltilmiş 200 µL ekleyin. Vortexing sonra örnekleri için 1 dk santrifüj kapasitesi 16.500 x g ve 4 ° c de 15 dakika
    5. Soğuk isopropanol 0.8 mL sulu faz ekleyin ve 2-3 h 20 ° C'de için örnekleri kuluçkaya Örnekleri için 16.500 x g ve 4 ° c, 35 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
    6. Soğuk % 70 etanol 500 µL ekleyerek RNA Pelet yıkayın (değil mix).
    7. 16.500 x g etanol kaldırmak 10 dk de örnekler santrifüj kapasitesi. Çözüm Aspire edin ve bir santrifüj yoğunlaştırıcı kuru.
    8. Bir kez kuru, granül DNaz/RNase free su 100 µL içinde resuspend.
      Not: Örnekleri üreticinin önerilerini göre DNA kirletici kaldırmak için iki kez DNases ile tedavi edilmelidir.
    9. Bir özel jel üzerinde RNA bütünlüğünü değerlendirmek ve RNA bütünlük numarası (RIN) ve ribozomal oranı bir çip tabanlı kapiler Elektroforez yöntemi ile ölçerek onaylayın.
      Not: RIN tüm elektroforetik izleme dikkate alır. RIN toplam RNA, sınıflandırma için bilgisayar yazılımı algoritma sağlar 10, en bozulmuş profil ve 10 en sağlam olmak olmak 1 1 bir numaralama sistemine dayalı. CDNA Kütüphanesi hazırlık ile devam etmek için RINs üzerinden 8 ve ribozomal oranı [28S/18S] olabildiğince yüksek 2 olmak, organizma ve onun özelliklerine bağlı olarak ideal değeri olmalıdır.
    10. Sıralama için cDNA Kütüphanesi hazırlık kadar RNA örnekleri-80 ° C'de depolayın.
  3. CDNA Kütüphanesi hazırlanması
    1. Kütüphane hazırlık ile devam etmek için üreticinin protokolünü kullanarak bir piyasada bulunan cDNA sentez kiti (Tablo reçetesi) kullanın.
    2. Kitaplık konsantrasyon ve kaliteli bir DNA çip için kontrol edin.
      Not: Daha kesin ve doğru miktar hassas floresan tabanlı Nefelometri deneyleri ile gerçekleştirilebilir.
  4. Kütüphane sıralaması
    1. 2 örnekleri normalize nM ve akış hücre organizasyon göre çoğullama için devam edin.
    2. Örnek 1 bir konsantrasyon, denatüre RT., 5 min için 0,1 N NaOH kullanarak nM
    3. Örnekleri 10 de sulandırmak. Her örnek akış hücre üzerinde 10 de yükleyin.
    4. Sıralama büyük ölçekli genomik sağlayan bir yüksek-den geçerek sıralama sistemi ile devam. Run bir SRM Çalıştır buradaydı (SR: tek oku, PE: eşleştirilmiş uç okuma, M: multiplexed örnekleri) okumak 7 endeksi baz ile 51 döngüleri.
    5. Nasıl yapılacağını dış FastQC programı13ile kalitesini değerlendirmek.
    6. Bağdaştırıcı dizileri kırparak sonra başvuru genom karşı okuma hizalamaları devam etmek. Örnek kirlenme değerlendirmek ve gerekirse, Sigara bakteriyel okuma düzeltme ile devam etmek için ökaryotik hücre genomu karşı hizalayın.
  5. İstatistiksel analiz
    1. Çeşitli yazılım programları mevcut online setleri differentially ifade genlerin tanımlamak için kullanın: R yazılım, DESeq2 ve platform geliştirilen PF2tools paketi (sürüm 1.2.12) dahil olmak üzere Bioconductor paketleri "Transcriptome et Epigénome" (Pasteur Enstitüsü, Paris).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. abscessus karşı ve makrofajlar ve çevresel tek hücreli amipler gibi bakteri yok edici yanıt-e doğru kaçmak için yeteneği vardır. M. abscessus fareler4' te daha öldürücü kılan amip ile temas büyüdü virülans faktörleri ifade eder. M. abscessus , hayatta kalma ve amip içinde çarpma sağlayan mevcut genlerin tanımlamak için bu yöntemlerden ilk hedefi oldu.

Bunun için ortak kültür ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. abscessus çok daha benzer patojenik SGM M. tuberculosis gibi davranışını RGM2' ye ait diğer mikobakteriler daha bir davranıştır. Anahtar SGM patojenitesi, hayatta ya da antijen sunan hücreler gibi makrofaj ve dendritik hücreler içinde bile çarpmak için yeteneklerini öğedir.

M. abscessus genomik bazı avantajları bir ökaryotik fagositik hücre içinde hayatta kalmak için onun genom14 toplam sırası tarafından gösterildiği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz büyük ölçüde mutant değerli hediye için PR EJ Rubin (Harvard Tıp Okulu, Boston, ABD) kabul Kütüphane ve Ben Marshall'ın (Tıp Fakültesi, Southampton Üniversitesi, İngiltere) el yazması düzeltmeler için. Biz büyük ölçüde Fransızca hasta Derneği kistik fibrozis "Vaincre la Mucoviscidose" ve "L'Association Gregory Lemarchal" için mali destek (RF20150501377) için kabul edersiniz. Biz de araştırma (ANR programı DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) ve Région Ile-de-France için Ulusal Ajans teşekkür (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) V.L-m doktora sonrası bursu finansman için. L. l. doktora bir dost "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemenin/Ekipmanın Adı
24 oyuklu plakalarThermofisher11874235
96 oyuklu plakalarThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BiyoanalizörAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop spektrofotometre 2000Thermofisher
QuBit florometreThermofisherQ33226
zirkonyum boncuklar/silika boncuklarBiospec ürünleri11079101ZBoncuklar
Reaktifin/hücrelerin adı
Acanthamoeba  Castellanii  ATCC30010suşu
Amikacin Mylan150927-Atoz
B-merkaptoetanol ve nbsp;Sigma-AldrichM6250çözeltisi
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granül susuz
Kloroform Fluka25666solution
ClaI enzimiNew England BiolabsR0197Senzimi
Columbia agar ve nbsp;Biomerieux4304190 mm
D-GlukozSigma-AldrichG8270 toz
DMEM Thermofisher11500596orta
DNaz ve RNaz içermeyen su Invitrogen10977-035solution
E.  Coli< / EM> Elektroyetkin Thermofisher18265017bakteri
EDTASigma-AldrichE4884tozu
Escherichia coli  < / em >Klinik izolatkişisel stokbakterileri
Fe (NH < alt > 4 < / alt >) < alt > 2 < / alt > (SO< alt > 4 < / alt >) -6H < alt > 2 < / alt >0 & nbsp;EMS15505-40sülfat çözeltisi% 4 sulu
Fetal Buzağı SerumuGibco10270serum
GliserolSigma-AldrichG5516çözeltisi
Guanidyum tiyosiyanat ve nbsp;EuromedexEU0046-Dtoz
İzopropanol Sigma-AldrichI9516çözeltisi
J774.2 makrofajlarSigma-AldrichJ774.2Suş
kanamisin Sigma-Aldrich60615toz
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobazik, susuz
LB sıvı ortam Invitrogen12795-027toz
LizozimRoche10837059001toz
MgSO4< / sub>LabosiM275pur
Microbank TM (boncuklu kriyotüpler)Pro-Lab TeşhisPL.170/M
Middlebrook 7H11 ortaSigma-AldrichM0428tozu
Middlebrook 7H9 ortaThermofisher11753473tozu
Mü ller-Hinton agarBiorad3563901tozu
N-Lauril-sarkozinMerckS37700 416toz
Na2< / sub>HPO4< / sub>-7H2< / sub>OSigma-AldrichS939098-102
Fenol / kloroform ve nbsp;Sigma-Aldrich77617çözeltisi
Proteinaz KThermofisherEO0491toz
proteoz peptonBD211684hayvan dokusunun enzimatik sindirimi
pUC19 plazmidNew England Biolabs54357plazmit
SDS % 20Biorad1610418çözeltisi
Sodyum sitratCalbiochem567446tozu
ThioureaSigma-Aldrich88810tozu
TrisSigma-Aldrich154563tozu
Trizol Thermofisher12044977çözümü
Tween 80Sigma-AldrichP1754 çözüm
Maya özü BD212750
Kit
AMBION DNase kiti Thermofisher10792877kiti
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504kiti
GeneJET Plasmid Miniprep kiti ThermofisherK0503kiti
PureLink PCR Saflaştırma kitiInvitrogenK310001kiti
Quant-It" tahlil kitiThermofisherQ33140/Q32884kiti
T4 DNA ligaz InvitrogenY90001kiti
TruSeq Örgülü RNA LT hazırlık kitiIllumina15032611kiti
%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055(2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834(2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121(2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939(2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529(2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Am belerMutant K t phanesi TaramasRNA EkstraksiyonuTranskriptomik AnalizVir lans Fakt rleriH cre i Ya amKonak Patojen Etkile imi

İlgili makaleler