Method Article

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

DOI:

10.3791/57768

⸱

February 13th, 2019

 ,  , 
1Department of Entomology, Purdue University, 2Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoller geliştirme yeni sınıflar, larvicides, adulticides ve endectocides olarak olgunlaşmamış ve yetişkin sivrisinekler için kimyaları toksisitesi değerlendirmek için açıklanmıştır. Tek-noktaya doz ve sonraki değerlendirme toksisite temas belirlemek için doz yanıt tahlil veya sindirim yoluyla birden fazla kimyaları yüksek üretilen iş test iletişim kurallarını etkinleştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek öldürücüler yeni sınıflar eylem roman modlarıyla Zika, Dang ve sıtma gibi hastalıkları iletimi sivrisinek böcek ilacı dayanıklı nüfus kontrol etmek için ihtiyaç vardır. Deneyleri için hızlı, yüksek üretilen iş analizleri sivrisinek larva ve yetişkin karşı unformulated roman kimyaları sunulmaktadır. Biz iletişim kuralları tek nokta-doz ve küçük molekül kimyaları için Aedes aegypti vektör Zika, Dang ve sarı humma, sıtma vektör, anofel gambiae ve Kuzey toksisitesinin değerlendirmek için doz yanıt deneyleri için tarif ev sivrisinek, Culex quinquefasciatus, temas ve sindirim yolu ile. Örnek olarak, biz amitriptilin, G protein birleştiğinde reseptörleri, larva, Yetişkin topikal ve yetişkin kan besleme tahlil ile küçük molekül antagonist toksisitesi değerlendirildi. Protokoller, böcek ilacı potansiyel araştırmak için bir başlangıç noktası sağlar. Sonuçları ürün uygulamaları ve teslim mekanizmaları keşfetmek için ek deneyleri kapsamında ele alınmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sivrisinekler iletimi, genel olarak insan sağlığını etkileyen bulaşıcı hastalıkların sorumlu ajanlar1. İnsan sağlığını etkileyen en önemli 3 sivrisinek cinsi Aedes, anofel ve Culexvardır. Aedes sivrisinek tür Zika, Dang, sarı humma ve chikungunya neden arboviruses vektör. Anofel türlerinin sıtma parazit vektör ve Batı Nil virüsü ve filarial nematodlar2 Culex tür iletimi. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), on ihmal tropikal hastalıklar (NTD) ortadan kaldırılması için 20203 tarafından gördü ve sivrisinek kontrolü en uygun strateji olarak tanımlanan. Böcek öldürücüler, sivrisinek kontrol etmek ve hastalık iletim4,5azaltmak güçlü araçlardır. Ancak, böcek ilacı dayanıklı sivrisinek nüfus ortaya çıkması pek çok hastalıkları6,7,8sürekli kontrolünü tehdit ediyor. Yenilikçi vektör kontrol Konsorsiyumu (IVCC) ilk özel çaba yerine böcek sivrisinek kontrolü9için geliştirmek başlattı. Eylem (MoA) roman modları ile yeni böcek öldürücüler hedefleri karşılamak ve hastalık kontrol elde etmek için ihtiyaç vardır. Keşif ve geliştirme roman adalardaki ile yeni böcek ilacı sınıfların bütün organizma deneyleri için hızlı, yüksek üretilen iş analizi kimyaları ve endüstri standartları10ile karşılaştırıldığında gerektirir.

Birden çok testleri iticilik ve böcek larvaları ve yetişkin sivrisinekler toksisitesi değerlendirmek kullanılabilir ve bazı yeni formüle veya unformulated kimyaları değerlendirme için uygundur. WHO Protokolü11 ürünleri dördüncü INSTAR larva karşı test etmek için kullanılan bir iletişim tahlil olduğunu. Yayımlanan çalışmaları da tarif larva deneyleri küçük molekül kimyaları Aedes aegypti, anofel gambiae ve Culex quinquefasciatus10,12, larva için toksisite sınamak için kullanılan bir çeşitli 13,14,15,16. Merkezleri hastalık kontrol ve önleme (CDC) şişe bioassay için böcek ilacı direnç yakalanan alan nüfus yetişkin sivrisinek öldürücü konsantrasyon (LC) ve öldürücü zaman (LT) ile karşılaştırıldığında bir standart tanı değerlendirilmesi yoluyla değerlendirmek için kullanılır bir ticari böcek ilacı17doz. WHO duyarlılık testi mademki sivrisinekler böcek ilacı emdirilmiş kağıt 1 h için cam şişe içinde maruz kalır ve ölüm 24 h18, değerlendirilir mi yetişkin sivrisinekler direnişinde böcek ilacı değerlendirmek için başka bir yaklaşım sunmaktadır. Diğer deneyleri formülasyonları mühürlü kafesleri ve kayıt sivrisinek nakavt ve ölüm içinde istenen timepoints19, sprey. Sivrisinek toraks için topikal uygulama farklı böcek ilacı20potens değerlendirmek için kullanılmıştır. Liverpool böcek test kuruluş (LITE)21 standart işletim yordamlar istihdamkimyaları yetişkin sivrisinekler için bioactivity değerlendirmek için. LITE yetişkin topikal tahlil test ürün küçük bir hacim 48 h attı mortalite ile yetişkin sivrisinekler toraks için geçerlidir. Tahlil miktar bireysel sivrisinek21alınan doz sağlar. LITE tarsal tahlil yetişkin sivrisinekler kimyasal tedavi bir yüzey üzerinde dinlenme için sınama ürünü toksisite değerlendirir ve kimyaları kapalı kalan spreyler (IRS) olarak gelişme potansiyeli ile tanımlamak veya insektisit tedavi yatak-tülleri (ITNs) kullanmak için kullanılır anofel sivrisinekler denetlemek için.

DSÖ ve CDC deneyleri var roman, unformulated kimyaları test için sınırlamalar ve CDC şişe bioassay amacı duyarlılık değerlendirilmesi kısa tahlil dönemleri (iki saat) üzerinde toksisite22,23yerine. Buna ek olarak, deneyleri kimyaları toksisitesi değerlendirmek için kan yemek teslim ve sistemik etkili ürünler geliştirmek için potansiyel (yani endectocides) eksik vardır. Burada, su ya da bir larva karşı çeşitli organik çözücüler ve yetişkin Aedes, anofel ve Culex' çözünür roman kimyaları mosquitocidal etkinliğini test etmek için deneyleri tarif. İlk olarak, biz daha önce bizim grup10,12,13,16tarafından açıklanan ve burada gerçekleştirilen larva bir tahlil göstermek (1) hızla tek noktada birden çok kimyaları değerlendirmek için bir ekran doz, ve (2) tek bir kimya öldürücü konsantrasyon (Örneğin, LC50, LC75 veya LC90,) belirlemek için bir doz yanıt tahlil. Ardından, öldürücü doz (LD) belirlenmesi için iki yetişkin deneyleri tarif. Bunlardan ilki topikal uygulanan, roman kimyaları olumlu bir denetim ile karşılaştırıldığında yetişkin sivrisinekler karşı test için LITE protokolü bir uyarlamasıdır. İkinci sistemik kan yemek teslim kimyaları değerlendirilmesi için beslenme bir tahlil olduğunu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Tüm suşları ve çalışma izni için gerekli kimyasalları aşağıdaki protokolleri açıklanan ve tedarikçiler Malzemeler tabloyer almaktadır.

1. kültür sivrisinek larva ve yetişkin

Not: Sivrisinekler böcek ilacı duyarlı suşları sıtma araştırma ve reaktif başvuru deposu mevcuttur. Suşları gibidir tavsiye: Aedes aegypti Liverpool (LVP) zorlanma, anofel gambiae Kisumu (KISUMU1) zorlanma ve Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) süzün.

  1. Kültür sivrisinek larvası bir 12 h gün/12 s gecesi yumurtadan döngüsü 28 ° C ve % 75-85 bağıl nem (RH) 25 cm x 40 cm plastik kasetlerine, (~ tepsi başına 400 larva) Nuss29tarafından açıklandığı gibi. Besleme larva zemin fare (A. aegypti ve An. gambiae) veya pul balık yemi (C. quinquefasciatus). Larva deneyleri için üçüncü larva (L3) biçim aşamada larva toplamak.
  2. Yetişkin devredilmiştir pupa plastik bardak ve yukarıda açıklanan koşullar altında bir insectary 20 L plastik kafeslerde yerde sivrisinek arka. Sivrisinekler üzerinde başka bir yerde29açıklandığı gibi % 20 şeker çözeltisi korumak. 3-5 gün sonrası ortaya çıkması, Yetişkin toplamak.

2. larva kişi tahlil (tek nokta doz veya doz yanıt tahlil)

Not: test Wells DMSO son konsantrasyonu % 1 aşmadığı koşuluyla tahlil su veya dimetil sülfoksit (DMSO), çözünür kimyaları ile yapılabilir. Alternatif çözücüler bir seçenek olabilir ama öncelikle son konsantrasyon neden olmaz onaylamak için temel 72 h mesaj pozda mortalite % 10 daha fazla. Tahlil bir tek doz veya doz yanıt tahlil olarak gerçekleştirilebilir. İkinci sahne, konsantrasyonları (en az beş), bir dizi test için önerilir beklenen LC50kapsayan.

  1. Bir açık 24-şey doku tabak kuyu Şekil 1' de gösterildiği gibi etiketleyin.
  2. 1.5 mL tüp testi kimyada stok çözeltisi hazırlamak.
    1. Bir analitik denge kullanarak her kimya tartmak ve çözünürlük özelliklere bağlı olarak steril GKD2O, DMSO veya diğer uygun organik çözücü seçim yeniden askıya alma (bkz. Şekil 2).
      Not: Hesaplamalar Kimya saflığı dikkate almak zorundayım. Örneğin, %99 saf bir Kimya için 1000 µL % 1 çözüm elde etmek için aseton 10,1 mg geçiyoruz. Tutkal ile parafin film ve -20 ° C'de depolayın
  3. Bu değerlendirmeye alınacak ve hisse senedi çözümden seri dilutions buna göre uygun çözücüyü kullanarak hazırlamak testi Kimya son konsantrasyonu belirlemek.
    Not: Konsantrasyon ve hacmi kimya ve solvent formülü C1kullanılarak hesaplanabilir * V1C2= * V2 nerede C1konsantrasyon örnek 1, C2= = örnek 2, V1konsantrasyon hacmi = Örnek 1 ve V2örnek 2 hacmi =. Bkz: Şekil 2 ve Tablo 1' de gösterilen örnek hesaplamalar.
    1. Bir 10 mM hisse senedi çözüm ve seri dilutions istenen test konsantrasyonları (tablo 1B) elde etmek için gerektiği şekilde hazırlayın.
  4. Wide-geçişli plastik transfer pipet kullanarak, beş L3 larva bir doku kültürü testi plaka iyi transfer; L3 larva uzunluğu tarafından tanınan (~ 2,5-3,5 mm) ve baş kapsül genişliğini ~ 0.025 mm24. Yavaşça su 1 mL pipet ile kaldırın ve GKD2O istediğiniz birim (aşağıya bakınız) ile değiştirin. N elde etmek için tekrar tedavi (Yani, 20 larva tedavi toplam) başına 4 Teknik çoğaltır =.
  5. Her dört Çoğalt Wells 24-şey testi plaka içinde uygun birim testi Kimya ekleyin ve hafifçe Tekdüzen kimyası karıştırma sağlamak için plaka girdap. Sürekli koşullar altında test veya büyüme odası plaka koyun (Örneğin, 25 ° C ve ~ 75-%85 RH tavsiye edilir ve bir 12 saat ışık/12 h karanlık döngüsü mümkünse).
    Not: sonraki deneyleri aynı çevre koşullarında gerçekleştirilen deneyler arasında tekrarlanabilirlik için emin olun.
  6. Ölü/non-yanıt veren larva 30 dk, 1, her iyi kaydedin 1.5, 2, 3, 24, 48 ve 72 s sonrası maruz kalma (veya alternatif zaman puan) skor sayfası (Tablo 2). Yan plaka hafifçe dokunun. Hiçbir hareketi gözlenen, yavaşça steril bir kürdan ile larva dokunma. Skor larva dokunarak / "ölü gibi" dokunmatik yanıt vermez.
    Not: Diğer morfolojik ve davranışsal fenotipleri gözlenen ve kaydedilebilir.
  7. Aşağıdaki gibi isterseniz, değiştirilmiş Abbott'ın formülü kullanarak denetim mortalite için düzeltin:
    Ölüm oranı (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
    nerede X yüzde ölüm tedavi örnek ve Y = denetimdeki yüzde ölüm =.
  8. Sonuç olarak bir çubuk grafik veya grafik-pad prizma 6 veya benzer gibi yazılım kullanarak Logaritmik eğrisi grafik ve öldürücü konsantrasyon (LC) değerleri denetime göre hesaplar.
  9. N elde etmek için sivrisinek ayrı bir toplu iş kullanarak tahlil tekrar 3 veya daha fazla biyolojik çoğaltır =.

3. yetişkin topikal tahlil (tek nokta doz veya doz yanıt tahlil)

Not: Yetişkin topikal tahlil aseton solvent kullanarak yapılır. Alternatif çözücüler bir seçenek olabilir ama öncelikle son konsantrasyon neden olmaz onaylamak için temel 48 saat sonrası pozda mortalite % 10 daha fazla. Bir tek doz veya doz yanıt tahlil gelin ve öldürücü doz (LD) belirlemek için kullanılan gibi tahlil gerçekleştirilebilir. İkinci sahne, konsantrasyonları (en az beş), bir dizi test için önerilir beklenen LD50kapsayan.

  1. Yetişkin dişi sivrisinekler tahlil tamamlamak için gereken sayısını belirleyin.
    Not: Bir nokta doz tahlil tek bir kimya ile 90 sivrisinekler (30 olumlu denetim, salt aseton negatif kontrol için 30 ila 30 test Kimya için) en az gerektirir.
  2. 3-5 gün çocuk yetişkin dişi sivrisinekler kültür ve bir ayrı 20 mL plastik kova bir aspiratör (Şekil 3) kullanarak hareket ettirin.
  3. 9 oz kağıt bardak testi Kimya konsantrasyonu ve adı ile etiketleyin. 10 cm x 10 cm kafes kareler ve lastik bantlar her fincan için bir kenara koyun (bkz. Şekil 4).
  4. Varolan bir böcek ilacı olumlu denetim (Örneğin, sentetik pyrethroid, bifenthrin) seçin ve % 1'stok çözeltilerine (10 µg/µL) aseton hazırlamak.
    Not: Hesaplamalar Kimya saflığı dikkate almak zorundayım. Örneğin, %99 saf bir Kimya için 1000 µL % 1 çözüm elde etmek için aseton 10,1 mg geçiyoruz. Tutkal ile parafin film ve -20 ° C'de depolayın
  5. Yukarıdaki aynı yordamı kullanarak, test Kimya stok çözeltisi hazırlamak.
    Not: Birçok test kimyaları son derece değişken ve çözümleri tercihen bioassay gerçekleştirilen her saat taze yapılmalıdır.
  6. Olumlu denetiminin seri dilutions hazırlamak ve daha önce aseton ile durulanır 20 mL cam şişeleri kullanarak Şekil 5 ' te gösterildiği gibi hisse senedi çözümlerinden kimyaları sınayın.
  7. 1 mL Cam şırınga aseton ile tasfiye, aseton ile doldurun ve mikro-aplikatör 0,25 µL hacmi teslim etmek için ayarlanmış güvenli.
  8. On gruplar halinde çalışma, 3 - 5 - gün eski yetişkin dişi sivrisinekler bir aspiratör kullanarak kafesleri üzerinden kaldır ve 4 ° C'de buzdolabı veya buz üzerinde beş dakikaya kadar için anestezi. Ardından, sivrisinek bir Petri kabına ve yer 10 dakikaya kadar buz aktarmak.
  9. Hızlı bir şekilde çalışma, tek bir erkek ile iyi cımbız kaldırmak ve 0,25 µL test çözüm şırınga mikro-aplikatör kullanarak dorsal toraks uygulayın. Uygun birim testi kimya Kimya her sivrisinek sağlamak için diseksiyon mikroskop kullanarak gözlem tarafından teslim alır onaylayın.
  10. Ve buz üzerinde dinlenme etiketli kağıt bardak sivrisinek transfer n elde etmek için dokuz kez tekrarlayın 10 tedavi sivrisinekler =. Bir lastik bant ve transferinde bir plastik küvet veya büyüme Odası'na 28 ° C ve 75-%85 RH sürekli koşullar altında (bir 12 saat gün/12 s gündüz döngüsü tercih edilir) ile güvenli sivrisinekler Kupası bir kafes kare ile kapatın.
  11. İki kez n elde etmek için yukarıdaki denemeyi tekrarlamak tedavi ya da kontrol grubuna göre 3 Teknik çoğaltır (Yani, 30 sivrisinekler toplam) =.
  12. 3.7-3.10 ilk test kimya ve olumlu denetim ile yineleyin.
    Not: yeterli sivrisinekler kullanılabiliyorsa için başka bir yararlı test Kimya veya solvent almazsınız 30 imzalat sivrisinek "boş" olduğu.
  13. 30 dk, 60 dk, 2, 24 ve 48 s sonrası maruz kalma "ölü/non-yanıt veren" Sivrisinek kaydedin (veya alternatif zaman puan) kullanarak skor levha (Tablo 3). Eğer onlar hareketi, eksikliği göstermek "ölü/non-yanıt veren" bir tarafında veya arkasında ve uçmak için yetersizlik ile döşeme olarak tanımlanan sivrisinekler puan.
  14. İstenirse, değiştirilmiş Abbott'ın formülü aşağıdaki gibi kullanarak denetim mortalite için düzeltin:
    Ölüm oranı (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
    nerede X yüzde ölüm tedavi örnek ve Y = denetimdeki yüzde ölüm =.
  15. Sonuçları bir çubuk grafik veya üssel bir eğri görüntüler. Bir doz yanıt tahlil için LD50, LD75 veya denetime göre test Kimya LD90 değeri hesaplamak.
  16. En az iki kez n elde etmek için sivrisinek ayrı toplu işlemleri kullanma tahlil tekrar 3 veya daha fazla biyolojik çoğaltır =.

4. yetişkin kan besleme tahlil (tek nokta doz veya doz yanıt tahlil)

  1. Toplamak yaklaşık 150 4-5 günlük eski yetişkin dişi sivrisinekler ve ayrı bir kafes aktarmak. 6 kafesleri bir doz yanıt tahlil performans elde etmek için yineleyin. Şeker 1 / 24 h öncesinde beslenme tahlil için kaynağı kaldırın.
  2. Kimya stok çözeltisi (hisse senedi bir çözüme su veya salt arabellek 80 mM olan) Kimya saflığı için muhasebe yukarıda açıklandığı gibi ve daha sonra su/tampon gerektiği gibi seri dilutions hazırlayın.
  3. Her birinin dilutions 40 µL istediğiniz test konsantrasyonu elde etmek için defibrinated tavşan kanı 960 µL için ekleyin. Membran film bir beslenme geçerli ve kauçuk halka ile mühür. Pipet ile 1 mL kan aktarmak ve besleme birimi için Isıtma birim ekleyebilirsiniz.
  4. Yavaşça membran yüzey ile taze çubukla % 10 laktik asit çözüm ve yer besleme ünitesi yetişkin sivrisinekler kafesin içine yaptı. Bir karanlık bez veya siyah çöp torbası ile kafes kapsar ve bir saatliğine beslemek sivrisinek olanak sağlar.
  5. Test çözümleri ve negatif (yalnızca kan) kontrol kalanı için 4.2-4.4 adımları yineleyin.
  6. Tamamlanma beslenme kovaları sivrisinekler anestezi 5 min için bir buzdolabında 4 ° C'de yerleştirin. Erkek sivrisinekler ve dişi sivrisinekler, Sigara beslemeli kaldırmak ve saymak ve beslenen ve kısmen sivrisinekler tarafından karın muayene beslenen toplam sayısını kaydetmek.
  7. En az 50 kan beslemeli sivrisinek doz başına nişan kısmen ve tamamen beslenen dişi sivrisinekler korur.
  8. Kova bir plastik küvet veya büyüme odası 28 ° C ve 75-%85 RH sürekli koşullar altında (üzerinde bir 12 gün/12 s gündüz döngüsü tercih edilir s) aktarın.
  9. Ölü/non-yanıt veren sivrisinekler 0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48 toplam sayısını kaydetmek ve skor kullanarak 72 h (veya istediğiniz gibi alternatif zaman puan) (Tablo 4) sayfası.
  10. Üçüncü gün sonrası kan besleme, kafesin içine bir yumurta kupa tanıtmak ve 72 h dönemde yumurta toplamak. Yumurta tedavi diseksiyon mikroskop altında başına üretilen toplam sayısını saymak.
  11. Yüzde mortalite ve verimlilik beslenen sivrisinekler her tedavi grubu ve denetimi için toplam sayısı bir fonksiyonu olarak hesaplayın. İstenirse değiştirilen Abbott'ın formülü kullanarak denetim mortalite için düzeltin.
  12. Toksisite ve verimlilik verileri görüntüleyin bir çubuk grafik arsa veya üssel bir eğri Eğer (bir doz yanıt tahlil gerçekleştirerek) yazılım kullanarak. Bir doz yanıt tahlil gerçekleştirme, LD50, LD75 veya LD90 değeri test Kimya denetime göre hesaplar.
  13. En az iki kez n elde etmek için sivrisinek ayrı toplu işlemleri kullanma tahlil tekrar 3 veya daha fazla biyolojik çoğaltır =.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 6 gösterir beş doz dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin su ile karşılaştırıldığında maruz takip L3 Ae. aegypti yüzde mortalite (negatif) kontrol 24, 48 ve 72 s. Bu örnekte, her zaman puan de toplanan veriler tipik bir logaritmik eğrisi görüntülemek ve amitriptilin larva ölüm üzerinde bir doz bağımlı etkisi ortaya koyuyor. LC50 değeri deneme süresi boyunca azalır ve 72 h veri (Yani, Logaritmik eğrisi orta noktasını) kullanılarak hesaplanabilir.

Şekil 7 gösterir 3 - 5 gün çocuk yetişkin kadın Ae. aegypti yüzde mortalite dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin ve sentetik pyrethroid ile karşılaştırıldığında bir 400 µM doz (10 µg/µL) maruz takip Bifenthrin pozitif kontrolü (teknik notu; 500 pg/µL), salt aseton negatif kontrol ve tedavi edilmezse sivrisinekler (boş). Bu örnekte, amitriptilin ve bifenthrin negatif denetime göre önemli yetişkin ölüm neden olur. Yetişkin ölüm muhtemelen metabolik test kimyaları detoksifikasyon nedeniyle, zaman içinde azalır unutmayın.

Şekil 8 Ae. aegypti beslenen dört doz dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin ve verimlilik ile tedavi bir kan yemek 3-5 gün eski yetişkin kadın yüzde mortalite (soldaki y ekseninde) gösterir (sağdaki y eksenindedir; ortalama yumurta sayısı / kadın) ilk gonotrophic döngüsü sonrası maruz Denetim sivrisinek ile karşılaştırıldığında (kan sadece beslenir; negatif kontrol). Veriler denetime göre yetişkin ölüm önemli etkisi amitriptilin, ama göstermek amitriptilin önemli ölçüde yüksek doz (400 µM), verimlilik artar olduğunu ortaya koymaktadır.

figure-results-1
Resim 1 . Larva doz yanıt testin set-up. Aedes aegypti L3 larva 24-şey plaka kullanılarak gerçekleştirilen larva doz yanıt tahlil up gösterilen görüntü.

figure-results-2
Resim 2 . Şematik yordam kümesi için (A) tek doz veya (B) doz yanıt larva tahlil 24-şey tabak içinde gösterilmesini. Beş L3 larva wells için transfer aşırı su yavaşça pipet ile kaldırılır ve taze, steril GKD2ile O. değiştirilir Daha sonra hisse senedi ve test Kimya seri dilutions hazırlanan ve 1 mL/iyi bir son hacim için ekledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 . Yetişkin sivrisinek kültür. Görüntü gösteren 20 L plastik kova kültür yetişkin sivrisinek ve bir aspiratör kullanımı için sivrisinek. kaldırmak için kullanılan

figure-results-4
Şekil 4 . 4-5 gün eski erkek kullanılarak gerçekleştirilen yetişkin topikal tahlil Aedes aegypti. Kimya ile aşağıdaki tedavi veya solvent, Yetişkin sivrisinekler kağıt bardak içinde yerleştirilir ve bir test odası için tahlil süresince transfer.

figure-results-5
Şekil 5 . Hisse senedi ve seri dilutions. (A)hisse senedi hazırlanması için prosedür ve (B) seri testi çözümleri yetişkin topikal tahlil için gösteren Şematik diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6 . Temsil edici bir larva kişi doz yanıt tahlil verilerden. Dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin, 24, 48 ve 72 h maruz takip Aedes aegypti L3 larva yüzde mortalite gösterilen bir larva kişi doz yanıt tahlil temsilcisi verileri. Her bir veri noktasını temsil eden µM ± SEM veri temsil n Bu arada 3 biyolojik çoğaltır =.

figure-results-7
Şekil 7 . Bir yetişkin topikal doz yanıt tahlil temsilcisi verilerden. Dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin (10 µg/µL) 3-5 gün için toksisite gösterilen bir yetişkin topikal doz yanıt tahlil temsilcisi verileri eski dişi Aedes aegypti sentetik pyrethroid, bifenthrin (500 pg/µL) pozitif göreli denetimi) ve negatif kontrol (sadece aseton araç) 2, 24 ve 48 s. Verileri göstermek n = 3 biyolojik çoğaltır. Hata çubukları SEM belirtmek

figure-results-8
Şekil 8 . Bir yetişkin yenmesi tahlil temsilcisi verilerden. Dopamin reseptör antagonisti, amitriptilin 100 µM, 200 µM ve 400 µM toksisitesi gösterilen bir yetişkin yenmesi tahlil temsilcisi verileri doz 3-5 gün için eski yetişkin dişi Aedes aegypti ve (ortalama toplam yumurta olarak ifade edilir verimlilik üzerinde etkisi Erkek ilk gonotrophic döngüsü üzerinde saymak). Verileri göstermek n = 3 biyolojik çoğaltır ± SEM

A. tek noktadan doz deneyleri ile üç kimyaları
KimyaKonsantrasyonu (400 uM)
Amitriptilin 80 mM stok:

figure-results-9

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek öldürücüler, sıtma25, Dang ve Zika26gibi sivrisinek kaynaklı hastalıklar ile mücadele için güçlü araçlardır. Geniş böcek ilacı kullanımı, dirençli kimyasal kontrol etmek için tek en büyük tehdit olarak kabul edilir böcek ilacı direnç gelişimi için önde gelen hastalık kontrol devam ettiği sivrisinek nüfus üretti. Son on yılda anofel spp. dayanıklı sentetik pyrethroids (SPs) yatak tülleri Afrika7kullanılan nüfus dramatik bir artış gördü. Nüfus Aedes albopictus, Dang vektör ve Zika, Florida ve New Jersey Organofosfatlar6için dayanıklı bildirilmiştir. Benzer şekilde, DDT ve pyrethroids nüfus Kolombiya27,28 anofel ve Aedes spp., belgelenmiş oldu. Yeni larvicides ve çeşitli orthosteric için bağlamak adulticides geliştirmek için acil ihtiyaç veya bilinen moleküler hedef veya bu allosteric sitelerinde bozacak yeni hedefler (Yani, roman MoA kimyaları)29,30 ve en az çevresel etkiye sahip. Orada da tanıma çevresinde endectocides sivrisinek kontrolü31,32,33için potansiyel artmaktadır.

Bu tür ürünler hızlı gelişimi kolaylaştırmak için bir dizi küçük molekül kimyaları sivrisinek larva ve yetişkin iki teslimat rotalarını - iletişim ve sindirim yolu ile toksisitesi değerlendirmek için tasarlanmış protokol açıklar. WHO duyarlılık testi ve CDC şişe tahlil gibi ortak iticilik varolan böcek formülasyonları1,2ve toksisitesi değerlendirmek için kullanın iletişim kurallarıdır. Ancak, bu deneyleri unformulated roman kimyasal varlıklar (NCEs) analizleri için kısıtlamalar bulunmaktadır ve orta ya da yüksek üretilen iş kimyaları çok sayıda test için mükellef değildir.

Burada hızlı bir şekilde yüksek üretilen iş analizleri için ölçeklendirebilirsiniz tek noktadan dozda NCEs değerlendirmek için standart bir larva tahlil açıklayın. Ayrıca bir adaptasyon küçük molekül kimyaları yetişkin sivrisinekler için kişi toksisitesi değerlendirmek için LITE21 tarafından geliştirilen bir testin açıklar. Son olarak, yolu ile kan yemek yetişkin dişi sivrisinekler için teslim NCEs toksisitesi değerlendirmek için bir sindirim tahlil tarif ve endectocide potansiyel keşfetmek. Bu larva ve yetişkin deneyleri LC ve LD değerleri, sırasıyla belirlemek için doz aralığı gerçekleştirilebilir ve larva ve yetişkin kişi deneyleri ile karşılaştırıldığında bir veya daha fazla varolan kimyasal formüller gerçekleştirilebilir. Yetişkin topikal tahlil Ayrıca bireysel sivrisinek her LD değer hesaplama sağlar. İletişim kuralları Aedes, anofel ve Culex16,29 türler kullanılarak yapılır ve bir türün belirli biyolojik özelliklerini içerecek şekilde isterseniz değişiklik. Bizim deneyim, mosquitocidal kimyaları genellikle geniş aktivite arasında bu 3 cinsi16,29sergi. ama türler seçicilik değerlendirilmesi için değer.

Deneyleri hızla birden fazla kimyaları böcek faaliyeti için ekran için bir başlangıç noktası vardır. Bir veya daha fazla deneyleri toksisite sergilemek bu kimyaları daha fazla analizleri yolu ile ikincil ve üçüncül deneyleri için seçilmiş olabilir. LITE tarsal tahlil ve deneyleri34,35besleme şeker örnekleri içerir. Ek deneyleri yelpazesi anlayışlar olası ürün teslimat modları sağlayan sonuçlar genellikle beklenen piyasa ve uygulama, etrafında konuları belirlenir. Burada gösterilen temsilcisi sonuçlarında amitriptilin, için potansiyel bir roman MoA böcek ilacı10,12, olarak değerlendirilen bir memeli ve omurgasız dopamin reseptör antagonist toksisite keşfetmek 13 , 16. amitriptilin sergilenen toksisite larva ve μg aralığı telkin içinde yetişkin Ae. aegytpi , larvicidal ve adulticidal etkinlik ve amitriptilin tabanlı kimyasal serisi bir arama için mantığı sağlayan tanımlamak için analogları ile yüksek kudret. Ölüm ya da verimlilik üzerinde önemli bir etkisi amitriptilin kan öğünde maruz Ae. aegypti gözlendi. Defibrinated kan ve etkili doz sivrisinek alınan kimyada kararlılığını bilinen değil iken, testin önemli sınırlamalar amitriptilin ve diğer GPCR aktif bileşikler küçük potansiyeli endectocides, olabilir ki verileri göstermektedir En azından içinde unformulated durumu.

Deneyleri arasında biyolojik değişim sınırlamak için önlemler gereklidir. Tüm deneyleri tekrarlanabilirlik sağlamak için sıcaklık ve nem, tercihen bir böcek büyüme odası standart koşullar altında yapılmalıdır. Bunlar son derece öznel, önemli veri değişimi için önde gelen farklı laboratuar personeli tarafından kaydedilmiş olabilir gibi fenotipik endpoints Puanlama yordamları standartlaştırmak için zorunludur. Larva tahlil tahlil son konsantrasyonu iyi başına daha az % 1 koşuluyla DMSO gibi organik çözücüler kullanılarak gerçekleştirilebilir olsa da suda çözünür kimyaları değerlendirilmesi için uygundur. Biz yetişkin topikal tahlil için bazı sınırlamaları tanır. İlk olarak, hızla seri dilutions hazırlarken çalışmak gereklidir ve taşıyıcı (aseton) son derece kırılgandır ve buharlaşma varyasyon Kimya miktarında doğurabilir dozda teslim teslim. İkinci olarak, bu ölüm katkıda bulunabilir gibi anestezi dönemini sınırlandırmak için özen gösterilmelidir. Ayrıca aseton gibi solventler etkileri nedeniyle test kimya ile karıştırılmamalıdır topikal tahlil ilk birkaç saatlik hızlı bir "knock-down" etki yol açabilir unutulmamalıdır. Biz sivrisinek kan yemek hacmi yetişkin yenmesi tahlil yetişkin başına alınan doz bir değerlendirmesini karmaşık hale getiren kişi arasındaki değiştiğini unutmayın. Son olarak, tahlil veri nerede negatif kontrol mortalite % 10 aşan durumlarda düşünülmemelidir.

Sinerjik hareket ürünleri giderek potansiyellerini yardımcı programını varolan ürünlerin genişletmek ve böcek ilacı dayanıklı haşere nüfusu15,16,36kontrolünü sağlamak kabul edilmektedir. Larva deneyleri synergism formamidine böcek ilacı, amitraz ve omurgasız octopamine reseptörleri14,15bozabilir kimyaları çeşitli arasında incelemek için kullanılmaktadır. Larva tahlil ve yetişkin topikal tahlil açıklanan sinerjik veya katkı etkileri test kimyaları kombinasyonları arasında değerlendirmek için uygundur. Biz synergists piperonyl butoxide (PBO) gibi her burada açıklanan üç deneyleri içine eklenebilir unutmayın.

Yukarıda açıklanan deneyleri unformulated, küçük molekül ilaçlara karşı su ve karasal sivrisinek yaşam evreleri değerlendirilmesi için deneysel standartlaştırılmış bir dizi sağlar. Bu deneyleri özellikle toksisitesi değerlendirmek ve mevcut üzerinde birkaç avantajları deneyleri ortak kullanım sunmak için tasarlanmıştır. Önemlisi, deneyleri için Otomasyon mükellef bulunmaktadır ve endüstriyel ölçekte değerlendirme testi bileşiklerin binlerce etkinleştirmek için gerçekleştirilebilir. Alanı yeni adalardaki hareket ürünlerinin geliştirilmesine dikkate alır gibi son olarak, roman moleküler hedeflerin ve biyokimyasal yollar, bozulma ile de dahil olmak üzere birden çok fenotipik uç nokta bu ölüm gibi ek olarak puanı için gerekli olacak ve felç. Yukarıdaki deneyleri böylece yarının son derece yenilikçi böcek teknolojileri doğru bir adım sağlayan gibi soruşturma izni.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. Scharf, Purdue Üniversitesi tahlil ile ilgili tavsiyeler için dizayn ve yazarlar H. Ranson, Liverpool tropikal Tıp Fakültesi tahlil geliştirme ve LITE Protokolü sağlanması ile ilgili yardım için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Böcek ilacına duyarlı sivrisinek suşları Sıtma Araştırma ve Reaktif Referans Deposu https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Önerilen suşlar: Aedes aegypti Liverpool (LVP) suşu, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) suşu ve Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) suşu
AsetonMallinckrodt ChemicalCAS 67-64-1Dilüsyonlar ve kontrol için kullanın
AmitrazSigma-Aldrich CAS 33089-61-1DMSO
AmitriptilinSigma-Aldrich'te seyreltme gerektirir CAS: 549-18-8Aseton
BifenthrinSigma-Aldrich içinde seyreltilebilir  CAS: 51529-01-2Pozitif kontrol olarak kullanılan sentetik piretor
Cis- (Z) -flupenthixolSigma-Aldrich & nbsp;CAS: 51529-01-2Dop benzeri reseptörlerin bozucu olarak farmakolojik olarak test edilmiştir
Defibrine tavşan kanıHemostatDRB0100Yapay beslenmeye uyarlanmış sivrisinekler için kan kaynağı
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich MKBF2985Amitraz
Hemotek membran besleme sisteminiHemotek LtdSeri no. 1303Sivrisinekleri beslemek için kullanılır
Mikro aplikatörBurkard Manufacturing Co. -Topikal uygulama deneyleri için gerekli alet
Kapaklı 24 oyuklu hücre kültürü plakasıCorning Incorporated3526-Advantage
lastik bantlarAlliance Rubber Co.-Kağıt bardakları kapatmak için kullanılır
: Cam şırınga (1 ml)Becton Dickinson and Co.512004Mikro uygulamalar için gereklidir. Cam plastikten daha iyidir
Tek kullanımlık sintilasyon şişeleri (20 ml)Fisher Scientific74505-20Cam şişeler buharlaşmayı önler
Tül kumaş, beyazWalmart-
Kağıt bardaklarDixie Tüketici Ürünleri LLC.PF15675/13DYetişkin topikal tahlillerde yetişkin sivrisinekleri tutmak için kullanılır
Petri kapları (150 mm)Corning Yaşam Bilimleri-Sivrisineklerinbuzla doğrudan temas etmeden soğukta "uyumasını" sağlamak için kullanılır
Transfer pipetleriFisher Scientific13-711-7MLarvaları sıralamak için kullanılır
Stereo mikroskopOlympusSZ6045Larva tahlillerini puanlamak ve gerçekleştirmek için kullanılır mikro uygulamalar
Cımbız (ince)Fontax -Yetişkin sivrisineklerle başa çıkmak için kullanılır
çözmek için kullanılan organik çözücü &

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
  3. World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
  4. Tolle, M. A., et al. Mosquito-borne diseases. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
  5. Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
  6. Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992(2014).
  7. Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
  8. Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
  9. Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
  10. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478(2012).
  11. World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
  12. Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
  13. Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
  14. Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
  15. Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
  16. Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192(2016).
  17. Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
  18. World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
  19. Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
  20. Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
  21. Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
  22. Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147(2013).
  23. Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357(2015).
  24. Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
  25. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174(2015).
  26. Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
  27. Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
  28. Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
  29. Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
  30. Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403(1990).
  31. Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
  32. Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M. Endectocides for malaria control. Trends in Parasitology. 27 (10), 423-428 (2011).
  33. Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153(2013).
  34. Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
  35. World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
  36. Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182(2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mosquito Toxicity AssayInsecticide Testing ProtocolLarval Contact AssayAdult Topical AssayBlood Feeding AssayAedes AegyptiAnopheles GambiaeCulex QuinquefasciatusDose Response AnalysisHigh Throughput Screening

Related Articles