Yöntem makalesi

Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser bir optogenetic tek-unit güvenilir özel yapım cam optrode kullanarak uyanık bir fareden kayıt gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ne kadar farklı nörolojik büyük bir sorundur neurons tür sinir devrelerinde çalışmak. Optogenetics son gelişmeler içinde vivo elektrofizyolojik deneylerde geniş beyin bölgelerinde nöronal tipinin tanımlanması etkinleştirdiniz. Optogenetics deneylerde kayıt siteye ışık sağlamak için önemlidir. Ancak, bu kez stimülasyon ışık derin beyin bölgeleri beynin yüzeyden teslim etmek zordur. Özellikle, stimülasyon ışık kez kayıtları uyanık hayvan modelinde olduğu gibi beyin yüzey optik saydamlığını, azaldığında derin beyin bölgeleri ulaşmak için zordur. Burada, spike yanıt-e doğru ışık uyanık bir fareden özel yapım cam optrode kullanarak kaydetmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Böylece güvenilir bir şekilde ışık derin beyin bölgeleri ile kaydedilen nöron uyarmak mümkündür Bu yöntemde, kayıt cam elektrot ışık teslim edilir. Bu özel yapım optrode sistem erişilebilir ve ucuz malzemelerden oluşur ve montajı kolaydır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi farklı işlevlere sahiptir nöronlar çeşitli oluşur. Nöronların farklı bu tür sinir devresi içinde nasıl nörolojik önemli sorunlardan biridir. Ancak, birçok beyin bölgelerde elektrik spike sinyal kendisi, hiçbir açık fark bazı istisnalar dışında olduğundan elektrik faaliyetleri nöronal türlü vivo kayıtları ayırt etmek mümkün olmuştur. Optogenetics son gelişmeler bir atılım1,2yaptık. Transjenik hayvanlar ışığa duyarlı opsin (Örneğin, channelrhodopsin-2) belirli nöronal türlerinde ifade kullanarak, vivo kayıtları3, nöronal türlerinde verimli bir şekilde ayırt etmek mümkün oldu 4,5,6. Bu hayvanlarda nöronlar ile ışığa duyarlı opsin elektrik kayıtları sırasında ışık uyaranlara vererek heyecanlı mısın, ancak diğer neurons değildir. Opsin-pozitif sinir hücreleri, bu nedenle, kolayca diğer nöron türlerinden ışık yanıtlarını tarafından ayırt edilirler.

Optogenetics deneylerde kayıt siteye ışık sağlamak için önemlidir. Non-invaziv bir yöntem olarak ışık beynin yüzeyden kez yönlendirilir. Beyin doku ile gider olarak ışık gücü azaltır, ancak, bu derin beyin bölgeleri beynin yüzeyinden uyarmak zor çünkü. Özellikle, stimülasyon ışık kez kayıtları uyanık hayvan modelinde olduğu gibi beyin yüzey optik saydamlığını, azaldığında derin beyin bölgeleri ulaşmak için zordur. Vücut hareketleri kayıtları gürültü nedeniyle elektrofizyolojik deneyler kez imzalat hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmiş. Ancak, iyi belgelenmiş gibi anestezi nöral yanıt-e doğru7,8,9,10değiştirmek bilinmektedir. Böylece, nöral yanıt anestezi yapay etkileri olmadan çalışması için uyanık hayvanlar kullanmak gereklidir. İmzalat hayvanlar ile deneyler, elektrofizyolojik kayıtlar uyanık hayvanlar ile deneyler ameliyatta kurtarma sonra gerçekleştirilir. Ameliyat ve kayıtları arasındaki aralığı sırasında doku çıktı kez beyin yüzeyinde biriken ve beyin yüzey optik saydamlığını düşük yapar.

Burada, bir ısmarlama cam optrode kullanarak uyanık bir fare tek-unit kayıtları kaydetmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Böylece güvenilir bir şekilde ışık derin beyin bölgeleri ile kaydedilen nöron uyarmak mümkündür Bu yöntemde, kayıt cam elektrot ışık teslim edilir. Bu özel yapım optrode sistem erişilebilir ve ucuz malzemelerden oluşur ve montajı kolaydır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları uygun olarak yol gösterici ilkeler fizyolojik Derneği Japonya ve hayvan bakımı Komitesi, Kanazawa Tıp Üniversitesi onayı ile yapılır.

1. cam Optrode tutucu inşaatı

Not: bir ticari Elektrot tutucu bir cam optrode tutucu oluşturmak için kullanılır (Şekil 1A).

  1. Yavaşça dışarı basınç kontrolü için çelik boru tutucu namlu çekin.
  2. Sondaj tarafından PIN seat yan varil sahibinin delik genişletmek. 3 mm çapında ve 12 mm delik derinliği içinde yapın.
  3. Koymak bir paslanmaz çelik boru (3 mm çapında, 0,5 mm kalınlıkta ve 8 mm uzunluğunda; Şekil 1A 2) delik.
  4. Çiftleşme kol ⌀2.5 mm halkalar (Şekil 1A1) için deliğe bölünmüş bir seramik yerleştirin.
  5. L şeklindeki rabbet elektrot sahibine varil Epoksi Yapıştırıcı ile düzeltmek.
  6. Delik (3 mm çapında) rabbet içinde yapmak ve bunu bir manipülatör vida ile ekleyin.

2. baş yükleme sonrası

  1. Bir devre kartı spacer yapılan özel olarak oluşturulmuş bir baş yazı hazırlamak. Tek sıra halinde devre kartı spacer bir freze kesici ile tetrahedron bir şekle yapmak ve 2 baş yazı olarak (Şekil 1B) testereyle kesti. Freze kesici ile baş yazının altında düzleştirin.
  2. Hangi çalışma belirli neuron türünün bir ışığa duyarlı opsin ifade edilir transgenik hayvan hazırlayın. Bu çalışmada, inhibitör nöronlar channelrhodopsin-2 (ChR2)11 hızlı transgenik fare (VGAT-ChR2 fareler) kullanılır.
  3. 0.3 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg midazolam ve 5.0 mg/kg butorphanol karışımı ile hayvan mayi yönetim tarafından anestezi. Hayvan tam anestezi doğrulamak için sınama gerçekleştirme pinching kuyruk için kendi reaksiyonlar.
  4. Stereotaksik çerçevesindeki bir Isıtma yastık üzerinde fareyi getirin. Temiz stereotaksik çerçeve ve Isıtma peşin % 70 alkol ile pad. Dişleri lokma çubuğu deliğe yerleştirin ve hafifçe sıkın burun kıskacı. Kulak çubuklarını kullanma baş her iki tarafı düzeltmek. Başından doğru kulak çubuklarıyla düzeltildiğinde, burun kıskacı sıkın. Bir oftalmik merhem gözler için geçerlidir.
  5. Baş cilt küçük makasla tıraş ve KLORHEKSİDİN GLUKONAT bir pamuklu çubukla ile kafa derisi temiz. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletler ve bir kafa ile bir Otoklav (121 ° C, 15 dk) sonrası sterilize.
  6. Orta çizgi boyunca kafa derisi makasla kesme ve bir kenara itmek. Kafasının arkasından kesi gözlere (yaklaşık 20 mm) olun. % 70 alkol batırılmış pamuk bez ile kapaklarini kaldırmak ve kafatası kuru.
  7. Baş yazı için manipülatör iliştirin. Baş yazı düz manipülatör kullanarak bregma çevresinde kafatası getirin.
  8. Monomer (4 damla), katalizör (1 damla) ve polimer (1 küçük kaşık) buzdolabında soğutulmuş önceden küçük bir çanak üzerinde diş çimento karıştırın. Alın ve kafatası baş mesaja düzeltmek için kafatası kemiğindeki diş çimento (1 g) aşağıda koymak.
  9. Diş çimento sabit olduktan sonra fare stereotaksik çerçevesinden kaldırın. Antibiyotikli bir krem maruz kalan ciltte koymak. Medetomidine antagonisti (0.3 mg/kg) ve antibiyotik (oksitetrasikline; 20 mg/kg) enjekte et. Yer ve o uyanır kadar fareyi ısı panelindeki bir kafeste izlemek ve konut kafese geri.
  10. Evin bazı zenginleştirme cihazı ile bir bireysel konut kafesteki hayvan. Her gün o kafesi temiz tutun ve enfeksiyonu önlemek yatak takımları hayvan kağıt değiştirin. Hayvan rahatsızlık belirtisi gösterir olup olmadığını dikkatli bir şekilde izlemektedir. Herhangi bir ağrı şüphesi varsa lidokain yaraya uygulayın. Yönetici Meloksikam veya carprofen bir kez her 24 h 48 saat sonra her iki kafa yükleme ve kranyotomi ameliyatları sonrası için. NSAİİ yeterli değilse yerel lidokain Ayrıca verilebilir.

3. calıştıkları

  1. Anestezi, kurtarma sonra (en az) iki gün hayvan kayıt odası kafası sabit durumda alışmana. Calıştıkları oturumları en az 5 gün için gerçekleştirin.
  2. Calıştıkları oturumları sırasında hayvan için özel olarak oluşturulmuş bir kelepçe sabit baş yazı ile kayıt odasında yerleştirin. Hareketi, sınırlamak için oturum sırasında kapak bir ısmarlama reçine yarım tüp (Şekil 1 c), cesetle yapılan bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak.
    Not: 1 gün, 5 min uzun calıştıkları oturum olmalıdır. Bu daha sonra günlük 10, 20, 40 ve 60 dk gün için 2, 3, 4 ve 5, sırasıyla arttırılır.
  3. Her oturumun sonunda hayvan yiyecek ödül vermek. Sürekli calıştıkları sırasında hayvan mücadele Eğer kesin.

4. kranyotomi

Not: kayıt için beyin bölgesi üzerinde bir kranyotomi calıştıkları sonra yapılır. Kranyotomi stereotaksik çerçeve ile baş yükleme sonrası gibi anestezi altında gerçekleştirilir. Baş yükleme sonrası sonrası işlemi yordamı aynıdır.

  1. Kranyotomi önce kafatası KLORHEKSİDİN GLUKONAT ve % 70 alkol ile bir pamuk bez ile temizleyin.
  2. Dikkatle kafatası kayıt sitesi üzerinden bir diş matkapla kazı. Kemik yeterince ince olduğunda, bistüri ucu ile kes ve çıkarın.
  3. Diş çimento kafatası güçlendirmek için maruz kalan bölgenin çevresinde koymak.
  4. Diş çimento sabit olduktan sonra silikon yapıştırıcı ile maruz beyin alanı kapsamaktadır. Ameliyat sonrası 2.8 adımda anlatıldığı gibi bir yöntemdir.

5. elektrofizyolojik kayıt

  1. Yeniden elde etmek için en az 1 gün sonra elektrofizyolojik kayıt işlemini gerçekleştirmeden önce kranyotomi hayvan izin. Hayvan kayıt odasında ne zaman kayıt başlar calıştıkları oturumları sırasında yapıldığı aynı şekilde yerleştirin.
  2. Cam pipetler borosilikat cam kılcal üzerinden yapmak (OD = 1,5 mm, kimliği = 0.9 mm, 90.0 mm uzun) bir elektrot çektirme çekti. Onların uç çapı 2-3 µm olduğunu ve 10 mM ile PBS doldurduysanız kendi direnci 4-6 MΩ. 40-50 mm elektrot uzunluğudur. Bazı kayıtları % 2 neurobiotin 10 mM PBS eklenir.
  3. Doldurulmuş Cam Pipet ısmarlama optrode sahibine iliştirin.
  4. Ag-Cl kaplı gümüş tel (0.2 mm çapında) Cam Pipet koymak. Gümüş tel bir PIN ile için ince bir kaplama elektrikli tel bağlamak. PIN kodu kayıt amplifikatör headstage için bağlayın.
  5. Fiber optik patch kablosunu bağlayın (çekirdek = 960 µm, kaplama 1000 µm, NA = 0.63 =) zirkon yüksük ile (OD = 2.5 mm) optrode tutucu kol çiftleşme split için. Yüksük ucu Cam Pipet arkası kişiler kadar yama kablosu kol itin. Yama kablosu ışık sunar (dalga boyu 465 = nm) LED üzerinden. LED ışık tek kanallı LED sürücü tarafından kontrol edilir.
  6. Silikon yapıştırıcı kranyotomi kaldırın. Koymak ısıtılmış salin (38 ° C) düzenli olarak beyin yüzeyine kayıt oturumu sırasında kurumasını önlemek için beyin yüzeyinde. Gerekirse, beyin zarı keskin cımbızla kaldırın.
  7. Cam elektrot bir manipülatör ile beyin dokusu içine yerleştirin. Bu takıldığında elektrot direnç izlemek. Direniş elektrot ucunu hasar olabilir çünkü beklenenden daha düşük olduğunda elektrot değiştirin. Faiz derinlikte arama ve 2-5 µm adımları derinlemesine ayarlayarak tek birim sivri yalıtır.
  8. Tek birim izole duruma geldikten sonra LED ışık teslim ve ışık uyaranlara yanıt gözlemlemek.
  9. Sinirsel faaliyetleri hücre tipleri kimlik sonra kayıt. Kayıtları 2-3 h için gerçekleştirin. Kayıt (en fazla 2 gün) birbirini izleyen günlerde yapılırsa, silikon yapıştırıcı ile kranyotomi kapsar. Ne zaman kayıt tamamlandıktan ve hayvan kurban, baş yazı almak ve aseton yıkamak ve bunu yeniden koydu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2' de, ışık gücü (Şekil 2A-B) pipetler ucundaki Cam pipetler uzunluğu ve ucu boyutunu etkileri incelenmiştir. Işık güç uzak ucu 1 mm yerleştirilen bir optik güç ölçer tarafından ölçüldü. Ucu boyutunu farklı ucu boyutunu tam uzunlukta çeşitli 2.5 µm için kurulmuştur iken tam uzunlukta 50 ± 2 mm için kurulmuştur. Cam Pipet şaft için 8 mm kuruldu. 3-5 mW (ortalama ± SD; değişiyordu ucundaki ışık güç

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetics nörolojik güçlü bir araç haline gelmiştir. Belirli nöron tipleri vivo içinde belirlenmesi için hem de belirli nöronal yolları faaliyetlerinin manipüle kullanılmıştır. Nöronal farklı sinirsel faaliyetleri açıklama sinir devreleri mekanizmasının anlayış teşvik etmektedir. Burada, kayıt site üzerinden bir cam elektrot içinde IC uyanık VGAT-ChR2 farelerin ışık sunmak için bir yöntem gösterdi.

Açıklanan yöntemi çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, hayvanlar opsins hedef ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar promosyon bilim KAKENHI Grant JP16K11200 ve 17 H 02223 Japonya Derneği ve hibe için araştırma Kanazawa Tıp Üniversitesi S2016-8 ve C2017-3 tarafından desteklenen. Biz Yuhichi Kuda fotoğraf çekmek de verdiği destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Elektrot tutucuMoleküler CihazMikroelektrot amplifikatörü için1-HL-U
Seramik bölünmüş çiftleşme manşonuThorlabsADAF1f2.5 mm yüksük
Devre kartı ara parçasıTeishin DenkiSPA-320f8.0 mm, 20.0 mm uzunluğunda
Fareler için stereotaksik çerçeveNarishigeSR-6M-HTFareler
için stereotaksik aletlerManipülatörNarishigeNAManuel manipülatör
Superbond SunMedicalM: 204610557Diş yapıştırıcı reçine çimentosu
Form2FormlabsNA3D yazıcı
Kwik-SilWPIKWIK-SILDüşük toksisiteli silikon yapıştırıcı
Borosilikat cam kılcal damarlarNarishigeGD-1.5OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm uzunluk
Fiber optik yama kablosuDor LenslerMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Monofiberoptik patchcord, OD, 2,5 mm, çekirdek = 960 mm, kaplama = 1000 mm, NA = 0,63
Bağlantılı LEDDorik LenslerLEDC-1B_FCMerkezi dalga boyu = 465 nm, çıkış gücü = 45 mW (Çekirdek 960 mm 0,63 NA )
LED sürücüDoric LenslerLEDRV_1CH_10001 kanal LED sürücü, maksimum çıkış = 1000 mA
Elektrot çektirmeNarishigePB-7Çift kademeli cam mikropipet çektirme
Borosilikat cam kılcalNarishigeGD-1.5Bolosilikat cam kılcal, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm uzunluğunda
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Antibiyotik merhem
Terramisin reg; -LAZoetisG 333Oksitetrasiklin
Tg (Slc32a1- COP4 * H134R / EYFP) 8Gfng / JJackson Labs# 14548VGAT-ChR2 fareler
Multiclamp 700BMoleküler Cihazlar2500-0157Mikroelektrot amplifikatörü
pipet tutucu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).
  3. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
  4. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757(2016).
  5. Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
  6. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099(2009).
  7. Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
  8. Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
  9. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
  10. Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
  11. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  12. Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
  13. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
  14. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  15. Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
  16. LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
  17. Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
  18. Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N ronal Tan mlamaElektrofizyolojik Kay tFiber Optik Yama KablosuKafa Postu FiksasyonuKraniyotomi Prosed rVGAT Kanalrodopsin IISpike Yan t Kayd

İlgili makaleler