Method Article

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

DOI:

10.3791/57784

⸱

August 25th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taze cilt dokularının ve kendi genişleme vitro izole birincil insan Lenfositi yaygın olarak laboratuvar araştırma ve klinik uygulamaları için kullanılmaktadır. İnsan Lenfositi geleneksel yalıtım yöntemi nedeniyle düşük hücre kurtarma hızı ve düşük hücre yetişkin dokulara gelen primer hücre oluşturmak için verimsiz olduğu kanıtlanmış bir iki adım sıralı enzimatik sindirim yordamı içerir canlılığı. Biz son zamanlarda Orta Rho kinaz inhibitörü Y-27632 kullanan insan birincil epidermal progenitör hücrelerin cilt dokularının yalıtmak için gelişmiş bir yöntem bildirdi. Geleneksel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem daha basit, daha kolay ve daha az zaman alıcı ve epitel kök hücre verim artar ve kök hücre özellikleri geliştirir. Ayrıca, yeni metodoloji dermis epidermis ayrılması does değil istemek ve, bu nedenle, farklı türdeki yetişkin doku hücreleri yalıtmak için uygundur. Bu yeni yalıtım yöntemi geleneksel yöntemlerle önemli eksiklikleri üstesinden gelir ve daha yüksek güç için laboratuar ve klinik uygulamalar için ile çok sayıda epidermal hücre üretmek için uygundur. Burada, yeni yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amaç birincil insan keratinositler (HKCs)--dan yetişkin dokular, özellikle klinik uygulamalar için yalıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı geliştirmekti. Cilt epidermal kök hücreleri, deri, bazal tabaka içinde lokalize çoğalırlar ve ayırt etmek ve cilt1,2,3, fonksiyonlarını korumak için Lenfositi sağlamak için yüksek bir potansiyele sahip 4. deri dokuları yaygın cilt doku mühendisliği ve yenilenme amacıyla kullanılan, özellikle hasarlı cilt onarım ve gen tedavisi için klinik uygulamaları5,6izole HKCs. Önemli HKC tabanlı uygulamalar için etkili bir şekilde izole ve HKCs çok sayıda yüksek potansiyel vitro7,8ile genişletin konudur. Çeşitli araştırma grupları kök benzeri HKCs kültürleri üretmek için yöntemler geliştirdik, bu yöntemler bazen düşük hücre verimleri ve cilt numune türü tarafından sınırlı olmak gibi diğer kısıtlamalar bulunmaktadır ve gerçekleştirmek karmaşık ve zaman alıcı olmakla birlikte 9kullanılır. Örneğin, HKCs cilt dokularının yalıtmak için geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim epidermis bir ayırma DermIS6ile karıştırmak. Bu yöntem genellikle de yenidoğan dokular için çalışıyor, ama yetişkin doku hücreleri izole etmek için kullanıldığında çok zor olur.

Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (kaya), bir inhibitörü bildirilmiştir önemli ölçüde epidermal kök hücre izolasyon ve koloni büyüme10,11,12verimliliği artırmak için. Bir önceki çalışmada, keşfettiğimiz Y-27632 epidermal hücrelerin klonal büyümesini kolaylaştıran ama differentially adezyon molekülleri13ifade kontrol ederek deri hücreleri verimini azaltır. Ayrıca büyüme ve verim birincil epidermal hücre destekler G-Orta adı verilen yeni bir şartına aşılama orta kurduk. G-Orta Y-27632 ile birleştirerek, bu roman yöntemi kendiliğinden böylece epidermis-DermIS ayrılık13,14adım kaldırma enzim sindirim sonra epidermal ve dermal hücreleri ayırabilirsiniz. Önceki raporlara dayanarak, biz şimdi detaylı HKCs yetişkin cilt dokusundan ayırmak için bu yeni yöntemin açıklayınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için kullanılan insan doku kurumun insan Araştırma Etik Komitesi kurallarına göre ele (NO.2015120401, tarihi: 12 Mayıs 2015).

1. hazırlıkları

  1. Plastik cerrahi ile buz gibi Dulbecco 10 mL 50 mL tüp Hastanesi'nde üzerinden atılan toplamak taze yetişkin karın cilt dokularının kartal Orta (DMEM) değiştiren. Örnek, hücre canlılığı önemli ölçüde etkilemeden en fazla 72 saat için 4 ° C'de tutulabilir.
  2. Reaktifler ve kültür orta aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
    1. 1 mL penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/L) 50 mL fosfat tamponlu çözeltisi (PBS) yıkama çözüm hazırlamak için ekleyin.
    2. İki enzim sindirim çözümler kümesi hazırlamak: (1) dispase (DMEM içinde 2.5 mg/mL) 50 mL hazırlamak ve 50 mL tip ı collagenase (2.5 mg/mL DMEM) ayrı ayrı geleneksel yöntemi; ve (2) 50 mL dispase karışımı hazırlamak ve tip ı collagenase (erime 125 mg dispase tozu ve 125 mg tip ı collagenase toz DMEM 50 mL) yeni yöntem için.
      Not: Tüm enzim çözümler olmalı bir 0,22-µm süzgeç ile filtre ve sürekli at4 ° C.
    3. Her iki yöntem için sindirim çözümleri hazırlamak: % 0.05 tripsin ve % 0.25 tripsin ticari olarak satın. Bir 10 mg/mL DNaz hazırlamak ben 50 mg 5 mL PBS, toz DNaz eriterek tarafından çözüm 0,22-µm süzgeç ile filtre ve -20 ° C'de depolayın
    4. Orta enzimatik sindirim nötralize etmek için 500 mL hazırlamak: DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.
    5. Aşı Orta (G-Orta olarak adlandırılan büyüme faktörü içeren orta,) 500 mL hazırlamak: içeren % 1 penisilin/streptomisin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), DMEM/F12 (3:1) orta ve %2 B27 ek.
    6. 100-mm hücre kültürü pretreat yemekleri kaplama matris türünü içeren 2 mL ile ben kollajen, oda sıcaklığında 30 dakika.

2. geleneksel Yöntem

  1. Cilt doku Önarıtma
    1. 1,5 cm2 cilt dokusunun almak ve yıkayın 1 x 10 mL PBS; o zaman, 10 mL % 70 etanol için 30 ile durulayın s ve o kuluçkaya 2 x 10 mL, 5 min çözüm (PBS) % 2 penisilin ve streptomisin içeren, yıkama ile.
      Not: Tüm yıkama 100-mm hücre kültür yemekleri bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilir.
    2. Deri altı yağ tabakası bir 100-mm hücre kültür çanağı kaldırmak ve sonra (Bu iletişim kuralı 1 g ağırlığıdır) deri dokusu tartmak için steril makasla doku kırpın.
      Not: Yeterli düzeltme dermis çok epidermis verimli ayrılması için çok önemlidir. Sarımsı yağ katman kolayca görsel olarak ayırt edilebilir.
    3. Ve aşağı başka bir 100-mm Steril çanak DermIS tarafı ile doku transfer, o zaman, cilt dokusu bir neşter bıçak kullanarak 3 - için 4-mm-geniş şeritler halinde kesin.
      Not: DermIS yan yağ tabaka ile kolayca görsel olarak kabul edilmektedir.
    4. 100-mm kültür tabağına cilt dokularının 10 mL 2.5 mg/mL dispase çözeltisi ekleyin ve sonra bir gecede 4 ° C'de (en fazla 20 h) çanak kuluçkaya.
      Not: Dispase çözüm miktarı her gram doku sindirim için 10 mL dispase çözeltisi kullanılarak hesaplanabilir.
  2. Epidermis ayrılması deri dokusu
    1. İkinci gün, iyi Cımbız kullanarak dermis epidermis akasındaki.
      Not: epidermis soyma zorsa, dispase sindirim hangi genellikle yetersiz doku düzeltme nedeniyle olduğunu yeterli değildi. Bu durumda, doku daha uzun bir kuluçka süresi gerekir.
    2. Hücre kültür ortamının 500 µL ile soyulmuş epidermis neşter bıçakları kullanarak bir doku Bulamaç kıyma; daha sonra 10 mL % 0.25 tripsin bir 50 mL tüp ile resuspend ve 37 ° C'de sallayarak ile bir su banyosu içinde 20 dk kuluçkaya.
  3. Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
    1. Tripsin etkinlik nötralize çözüm (bu Protokolü 10 mL) eşit bir hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin.
    2. Çözüm yukarı ve aşağı 20 x 10 mL serolojik pipet ile pipetting tarafından epidermal hücrelerin ayırmak ve hücre çözümü herhangi bir kalıntı doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
    3. Hücre çözümü 200 x g 5 min için de filtrasyon sonra santrifüj kapasitesi; hücre Pelet nötralizasyon orta yıkama resuspend ve sonra tekrar hücre Pelet elde etmek için 200 x g santrifüj kapasitesi.
    4. Hücre Pelet düşük kalsiyum, serum-Alerjik keratinosit Orta (SFM) 10 mL resuspend. Bu çözümün Toplam hücresini saymak ve sonra SFM 10 mL içine kaplama matris ile ön işleme 100-mm hücre kültür yemekler ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için 10 µL al (içeren tip ı kollajen).
      Not: Kaplama geleneksel yöntem için gerekli bir adımdır.
    5. Kültür orta her 2 d değiştirin.
      Not: bir mikroskop altında hücre adezyon önce ve kültür orta değiştirdikten sonra kontrol edin.
    6. Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham.
      Not: Tüm kültür yemekleri ile kaplama matris ön işleme.

3. yeni yöntemi

  1. Cilt doku Önarıtma
    1. Doku açıklandığı gibi yukarıdaki (adım 2.1) geleneksel yöntem için toplamak.
    2. Deri dokusu 1 yıkama x 10 mL PBS ile ve daha sonra tartmak bir steril plastik kap içinde elektronik bir ölçek (ağırlığı ise yaklaşık 1 g bu protokolü) tarafından.
      Not: kullanılan doku örnek çok küçük ise hücreler yeterli sayıda elde etmek zor olduğundan 0.1 g, doku bu iletişim kuralı için gerekli minimum ağırlık olur. Sonuçta operatör işleme kapasitesine bağlıdır bu iletişim kuralı için doku yok maksimum ağırlık vardır.
    3. 10 mL % 70 etanol için 30 ile deri dokusu durulama için forseps kullanın s.
    4. Doku 2 kuluçkaya x 10 mL, 5 min için (adım 2.1.1 hazır) çözüm her zaman yıkama ile.
      Not: yukarıda belirtilen tüm çamaşır adımlar 100-mm hücre kültür yemekleri laminar akış hood (doku kültürü hood) içinde gerçekleştirilir.
    5. Doku başka bir 100-mm hücre kültür steril yemek için transfer.
    6. Neşter bıçakları kullanarak, doku iyice bir doku Bulamaç kıyma.
    7. 200 µL her 5 dk PBS, ıslak mendil tutmak için ekleyin.
      : Dikkat adımları 3.1.5 - 3.1.7 yaklaşık 15 dakikadır. Yukarıdaki tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
  2. Sindirim cilt dokusunun
    1. Homojenize doku çözüm 50 mL tüp içine aktarın. 10 mL cilt dokusunun her 1 g için enzim karışımı ekleyin. Enzimler homojenize kurcalayarak iyice karıştırın.
    2. 1s için 37 ° C'de bir su banyosunda sallayarak ile karışımı kuluçkaya.
    3. Başka bir 30 dk 37 ° C'de bir su banyosu içinde sindirim karışımı için % 0.25 tripsin (Bu iletişim kuralı 2.5 mL) 1/5 hacmi ekleyin
    4. DNaz ekleyin ben çözüm 1: 100 (v/v) oranında (Bu protokolündeki 250 µL) enzim karışımı ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  3. Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
    1. 1:1 oran içinde 12,5 mL nötralizasyon orta ekleyerek sindirim işlemini durdurun. Çözüm yukarı ve aşağı yaklaşık 20 x 10 mL serolojik pipet hücreleri ayırmak için kullanma için pipette.
    2. Disosiye hücreleri doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Süpernatant 200 x g 5 dk. gözlemlemek Pelet tüpün dibinde de santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant atmak ve nötralizasyon orta ve santrifüj 10 mL ile hücre Pelet tekrar 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de yıka.
    4. Hücre Pelet aşılama Orta (adım 1.2.5 G-Orta) 10 ml Y-27632 10 µM ile resuspend.
    5. Toplam hücre sayar ve ardından, G-Orta 10 mL 100-mm hücre kültür çanak içine ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için çözüm 10 µL al.
      Not: Precoating adım yeni yöntemi için gerekli değildir ve hiçbir kaldırma dermal tabakanın da gereklidir.
    6. 3 d sonra aşı orta düşük kalsiyum SFM orta ile değiştirin. Kültür orta her 2 d değiştirin.
      Not: hücre adezyon önce ve orta değiştirdikten sonra kontrol edin.
    7. Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham.
      Not: gerekirse, % 0.05 tripsin 2 min için hücrelerle pretreat ve deri hücreleri epidermal hücrelerin trypsinizing önce kirletici kaldırmak için PBS hücrelerle yıkayın.

4. hücre Passaging

  1. Orta kaldırmak, PBS hücrelerle yıkayın ve ardından, 2 mL % 0.05 tripsin (başına her 100-mm çanak) ekleyin.
  2. 5 min için bir kuluçka (37 ° C % 5 CO2) hücrelerde kuluçkaya.
  3. Tüm hücreler kültür çanak ayırdıktan emin olmak için bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin.
  4. DMEM 8 mL % 10 ile ekleyin FBS enzimatik reaksiyon etkisiz hale getirmek ve daha sonra bir 15 mL tüp hücreleri toplamak için.
  5. 200 x g hücre Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  6. Yavaş yavaş süpernatant kaldırmak ve, sonra hücre Pelet SFM orta 10 mL ile resuspend ve hücreleri saymak.
  7. 1 x 106 hücre SFM 10 mL her 100-mm hücre çanak içine ile plaka.
  8. Her 2 d orta değiştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şematik diyagramları yeni yöntemi (resim 1A) ve geleneksel Yöntem (Şekil 1B) Şekil 1' de sunulmaktadır. 2 günlük yordamı gerektirir bir iki adım sindirim geleneksel yöntemdir. Buna karşılık, en yeni yöntemdir gerçekleştirmek için yaklaşık 3 saat sürer bir tek adımlı sindirim. Önemlisi, tek adımlı Yöntem Y-27632 varlığı aşılama orta bağlıdır aynı anda iki popülasyonun (epidermal ve dermal hücreleri) e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültürlü birincil HKCs yaygın olarak fazla üç yıl için klinikler yaraları tedavi etmek için kullanılan ve o zamandan beri her zaman verimli bir şekilde zamanında yeterli sayıda klinik uygulamaları için hücre elde etmek önemli olmuştur. Bu nedenle, uygulamada, dermis epidermis ayrılması gerektirir, geleneksel yalıtım yöntemini hücrelerin ve yetişkin hücreleri geçiş yeteneği düşük düşük verim nedeniyle bu talepleri karşılamak zor olur. Burada, verimli bir şekilde HKCs için laboratuar ve klinik uygulamalar için daha uygun ö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin (2017YFA0104604), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'in (NSFC, 81772093), Genel Program tarafından desteklenmiştir bilim ve Suzhou teknoloji geliştirme programı (ZXL2015128), Jiangsu Eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20161241) ve Shandong Taishan Scholar Ödülü (tshw201502065).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kontes otomatik hücre sayacıInvitrogen Inc. C10227Otomatik hücre sayımı 
Hücre inkübasyonu içinCO2 İnkübatörüThermo Scientific51026333
Sorvall ST 16R SantrifüjThermo Scientific75004380Hücre santrifüjü
Sabit Sıcaklık ÇalkalayıcıShanghai Boxun150036Su banyosu için
Elektronik TartıHarbin Zhonghui1171193Doku tartımı için
Hücre Kültürü TabağıEppendorf30702115Hücre kültürü için
50ml Santrifüj TüpüKIRGEN171003Hücre santrifüjü için
Hücre SüzgeciCorning dahil431792Hücre filtrasyonu
Fosfat tamponlu çözeltiSolarbio Life Science P1020-500Yıkama solüsyonu
DMEMThermo ScientificC11995500Nötralizasyon ortamının bileşeni
Tanımlanmış K-SFMYaşam Teknolojileri10785-012Epidermal hücreler, kültür ortamı
Penisilin StreptomisinThermo Scientific15140-122Antibiyotikler
Fetal Sığır SerumuBiyolojik Endüstrileri04-001-1AC5Nötralizasyon ortamının bileşeni
% 0.05 TripsinYaşam Teknolojileri25300-062HKC ayrışması için
% 0.25 Tripsin ve nbsp;Pekin Solarbio Bilim & TeknolojiT1350-100HKC ayrışması için
Kaplama Matrisi KitiYaşamTeknolojileri R-011-KKaplama matrisi için
DispaseGibco17105-041HKC izolasyonu için
Kollajenaz Tip IYaşam Teknolojileri17100-017HKC izolasyonu için
Deoksiribonükleaz ISigma9003-98-9F12 için
Besin Karışımı, HamsLife Technologies31765035G-medium
B27 Bileşeni SupplementLife Technologies17504044
FGF-2 MiliporeMerck Biosciences'da341595G-ortamı
Y-27632Sigma-AldrichY0503ROCK inhibitöründe
FungizoneGibco15290026G-medium
EGF Rekombinant İnsan ProteiniGibcoPHG0311için Hazırlık G-medium
Hücre Sayma Kiti-8'deThermo ScientificNC9864731hücre proliferasyonu ve sitotoksisite testleri
Fare Anti-İnsan Sitokeratin5Hewlett-Packard Geliştirme ŞirketiMA-20142HKC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için
Tavşan Anti-İnsan LoricrinCovancePRB-145pHKC'lerin farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için
Fare anti-insan VimentinHücre Sinyal Teknolojisi3390Dermal fibroblastların immünofloresan boyaması için
Integrin & 6(GOH3)Santa Cruz SC-19622HKC'lerin akış sitometrisi analizi
Sıçan IgG2a FITCSanta Cruz SC-2831negatif kontrol antikoru &alfa; 6-Entegre  Akım sitometri analizinde 
, , , , HKC izolasyonu için G-medium büyüme faktörü büyüme faktörü büyüme faktörü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Human KeratinocytesSkin Tissue IsolationEnzymatic DigestionROCK Inhibitor Y 27632Epidermal Progenitor CellsCell Culture ExpansionK5 Marker AnalysisLoricrin DifferentiationVimentin Contamination CheckNeutralization Medium Wash

Related Articles