Yöntem makalesi

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

DOI:

10.3791/57785

⸱

26 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ve Comunidad Autonoma de Madrid çok az hayvan acı sağlamak için hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. embriyo hamile fareler (E12.5 E8.5)'dan gelen topluluğu

  1. Servikal yerinden çıkması veya CO2 inhalasyon hamile fareler kurban. İlk gün gözlenen vajinal tak olarak embriyonik kabul gün 0,5 (E0.5).
  2. Fare % 70 etanol ile karın deri temiz ve emici Ped sırtüstü pozisyonda hayvan yatıyordu.
    Not: Aşağıdaki adımlarda kısırlık gerekli değildir.
  3. Çimdik ve karın deri fare-diş forseps kullanarak kaldırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşte tüm fare embriyo (resim 1 ve Şekil 2) substrat olarak X-gal kullanarak β-galaktozidaz histochemical reaksiyon için standart protokol uygulanmasının sonuçları göstermektedir. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz membran tipi 4-Matriks metalloproteinaz (Mt4-mmp) ifade farklı embriyonik gelişim dönemleri (E9.5, E11.5 ve E12.5) de incelemek LacZ muhabir endojen kontrolü altında hızlı Mt4 mmp mutant fare kullanarak MT4 mmp organi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.

Bu yöntemin doğru uygulama içinde bir boyama sağ.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAKTİFLER< / güçlü >
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004 / LE3Q2014
Sulu montaj ortamıVECTOR LABSH-5501
Sentetik montaj ortamıMERCK100579
%96 EtanolPROLABO
%99,9 Etanol mutlakSCHARLAUET00021000
%50 Gluteraldehit çözeltisiSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
%85 GliserolMERCK104094
%99,9 GliserolSIGMA-ALDRICHG5516
Magnezyum klorür hekzahidratSIGMA-ALDRICH63064
Noniyonik yüzey aktif madde (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nükleer Hızlı Kırmızı karşı lekeSIGMA-ALDRICHN3020
Parafin pastilleriMERCK111609
ParaformaldehitSIGMA-ALDRICH158127-500g
Fosfat tamponlu salin (tabletler)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Potasyum ferrosiyanatMERCK1049840500
Potasyum ferrosiyanürMERCK1049731000
Sodyum azidSIGMA-ALDRICHS8032
Sodyum deoksikolatSIGMA-ALDRICH30970
Sodyum dihidrojen fosfat monohidratSIGMA-ALDRICH106346
Sodyum fosfat dibazik dihidratSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hidroklorür (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
KsilenVWR KİMYASALLARIVWRC28973.363
EKİPMANLAR< / güçlü>
Tek kullanımlık plastik kriyokalıplar 15x15x5 mmSAKURA4566
Döner MikrotomLeicaRM2235
KasetlerOxford TradeOT-10-9046
Mikroskop Kapak Camları 24x60 mmVWRECN631-1575
Mikroskop slaytlarıThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERAGAA000001#12E
Yapışma mikroskobu slaytlarıThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERJ1820AMNZ
Flotasyon Su banyosuLeicaHI1210
Tek Kullanımlık Düşük Profilli Mikrotom BıçaklarıTüyUDM-R35
Parafin fırınıJR SELECTA
Balmumu Parafin dağıtıcısıJR SELECTA
StereomikroskopLeicaDM500
Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 2.0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Orbital çalkalayıcıIKA LabortechnikHS250 BASIC
Karıştırma Sıcak PlakasıBibbyHB502
Vorteks ÇalkalayıcıIKA LabortechnikMS1
Laboratuvar terazisiGRAMFH-2000
Hassas teraziSartoriusISO9001
pHmetreCrisonBasic 20
Optik fiberOptechPL2000
20824365, 2000205 4000490

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beta galaktosidaz TespitiX gal BoyamasFare Embriyosu AnaliziParafin Kesit AlmaHistokimyasal AnalizGen Ekspresyon zlemeB t n Ba lam BoyamaH cre Soyu al malarEmbriyo effafla t rmaGeli im Biyolojisi

İlgili makaleler