Method Article

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

DOI:

10.3791/57785

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren yükselmeye 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole ve galaktoz tarafından hidrolize bir parçalanma olduğunu. İlk bir dimer okside, kullanıldığında potasyum ferri ile kombine- ve ferro-siyanür, karakteristik çözünmez üretir, mavi renk çökelti (Şekil 1)6.

Otuz yıl önce bir muhabir gen kullanılacak LacZ gene başladı7,8. Genellikle, LacZ eklenen aşağı endojen bir organizatörü açık okuma çerçevesi yerine belirli bir INSERT içeren hücreler görselleştirmek için bakteri ve hücre kültür yanı sıra transjenik hayvanlar, endojen bir izleyici kullanılabilmesi için bu yüzden gen ifade desen geliştirme9sırasında. Bu bağlamda, β-galaktozidaz etkinliği görselleştirme kapsamlı Drosophila içinde tek hücrelerden gelişimsel ve hücresel süreçler tüm dokulara anlamak için kullanılmıştır. Drosophila genetik kararlı hatları içinde LacZ değil muhabiri gen içeren değiştirilmiş bir P-öğe yapısı eklenen rasgele genom yerlerde nesil lehine. Böylece, artırıcı unsurların etkisi altında yerleştirildiğinde bu ifadesini birçok genlerin ifade kalıplarının sistematik analizi sırasında son yirmi yılda10izin verdi bir doku belirli şekilde sürücü. Buna ek olarak, LacZ gen ekspresyonu izlemek için transgenik fareler de gen rekombinasyon olaylar Cre-loxP tarafından algılanmasını rekombinasyon ve yerelleştirme chimeric analizlerde mutasyona uğramış embriyonik kök hücre türevleri aracılı kullanılmasına 11, hangi geçici olarak de LacZ ifade belirli dokularda kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca, tüm embriyoların, algılama β-galaktozidaz faaliyetinin uygun gen ekspresyonu zamansal değişiklikleri analiz etmek için farklı gelişim dönemleri arasında gözlenen farklı yoğunluklarda, farklı boyama desenleri neden olabilir 8,12.

Bu makalede, biz bütün Dağı dokusunda fare embriyo erken gelişim aşamalarında boyama gen ekspresyonu ile X-gal görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz histochemical bu yöntem doku veya embriyo parafin gömülü sonra bütün Dağı örnekler veya hücresel düzeyde etiketli hücrelerinin doğru algılama iyilik bir son derece hassas ve ucuz teknik mevcut. Yöntemi diğer yöntemleri13ile karşılaştırıldığında en az arka plan ile fare dokusunda boyama doğrudan görüntüleme için sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ve Comunidad Autonoma de Madrid çok az hayvan acı sağlamak için hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. embriyo hamile fareler (E12.5 E8.5)'dan gelen topluluğu

  1. Servikal yerinden çıkması veya CO2 inhalasyon hamile fareler kurban. İlk gün gözlenen vajinal tak olarak embriyonik kabul gün 0,5 (E0.5).
  2. Fare % 70 etanol ile karın deri temiz ve emici Ped sırtüstü pozisyonda hayvan yatıyordu.
    Not: Aşağıdaki adımlarda kısırlık gerekli değildir.
  3. Çimdik ve karın deri fare-diş forseps kullanarak kaldırın.
  4. Bir kesik deri ve karın duvarı, 2-4 cm dikey olarak cerrahi makas kullanarak karın orta hat üzerinden yapmak.
  5. Karın maruz ve cerrahi makas ile rahim iç eğim boyunca forseps kesme kan damarları ile anneden rahim boynuzları kaldırmak.
  6. Ve 10 mL buz gibi 0.01 M fosfat tampon serum fizyolojik pH 7,4 (PBS) içeren buzda bir petri transfer embriyoların dizi çıkarın.
  7. Dikkatlice dışarı embriyolar rahim Petri kabına 10 mL taze buz gibi PBS ile bir stereomicroscope altında gelen incelemek. Kas duvar amniyotik kese ortaya çıkarmak için saatçilik forseps ile kavramak ve amniyotik membran kapalı embriyo ve forseps ipuçlarını kullanarak sarısı sac kaldırmak için gözyaşı.
  8. (E12.5 E8.5)'dan erken aşamalarında hamile fareler littermate embriyo toplamak (Şekil 2).
  9. Eğri forseps kullanarak 10 mL soğuk 1 x PBS ile taze yemek için embriyo transfer veya (E8.5-E9.5) çok küçük embriyolar için plastik transfer pipetler embriyo zarar vermeden örnekleri toplamak için kullanın.
  10. Fiksasyonun başlamadan önce embriyonik bir örnek bir microcentrifuge tüp Genotipleme için embriyo küçük bir parça kesme veya amniyotik membran (E9.5 E8.5)'dan küçük embriyo saatçilik forseps ile alarak getirin.
    Not: LacZ Genotipleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) astar tarafından belirlenir: ileri, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; tersine, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fare embriyo fiksasyonu

  1. Her embriyo ile bir yuvarlak taban 1 mL 1 x PBS içeren 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.
    Not: bütün adımları Bu tüpler protokolünde ajitasyon ile çalışırken bir shaker kullanarak gerçekleştirin.
  2. Embriyo için oda sıcaklığında 1 dk içinde 1 x PBS kalan kan ortadan kaldırmak için yıkayın. Kullanım plastik transfer pipetler tüpler sıvılarda değiştirmek için.
  3. Embriyo %0.125 oxazolidin buz üzerinde 1 mL fix.
    Not: Fiksasyon zaman embriyo boyutuna bağlıdır: E8.5-E9.5 embriyo, 30 dk E10.5 embriyo ve E12.5 embriyo için 1 h 20 min.
  4. Sabitleştirici kaldırmak ve örnek için X-gal boyama işleme önce embriyolardan 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.

3. bütün Dağı β-galaktozidaz Histochemistry fare embriyolar

  1. Hazırlama X-Gal durulama tampon ve X-Gal boyama yordamına başlamadan önce çözüm ( Tablo 1 ve Tablo reçetesibakınız). Vahşi-tipi (WT) littermate embriyo için enzimatik reaksiyon negatif denetimleri kullanın.
  2. X-Gal durulama arabelleği (Şekil 2) Oda sıcaklığında 10 dakika için embriyo kuluçkaya.
  3. X-Gal boyama çözümde embriyo ışıktan korunan 37 ° C'de bir gecede 2 h kuluçkaya. Mavi boyama yeterli yoğunluğu olmadan arka planda embriyo görülmektedir kadar renk reaksiyonu sürekli yayın yolu ile diseksiyon mikroskop monitör. 8 ve 9 arka plan bütün boyama sırasında azaltmak için arasında çözüm pH tutun. Boyama çözüm ışığı başlarsa, enzimatik reaksiyon genişletmek için taze substrat çözeltisi ile değiştirin.
  4. Bir microcentrifuge tüp ile 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında her 10 min için iki kez embriyoların yıkayarak istenen sinyal alındığında tepki bırak.
  5. 4 ° C'de bir gecede 1 h için 1 mL % 4 paraformaldehyde (PFA), yeniden düzeltmek için lekeli embriyo transferi
    Not: Embriyo %4 oranında saklanabilir PFA/PBS için daha uzun süreleri 4 ° C'de veya kesit için hemen işlenebilir. Bu son fiksasyon boyama desen uzun vadeli korunması için çok önemli bir adımdır.
  6. Embriyolardan 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.
  7. Seçenek 1: embriyo daldırma çözümleri ile gliserol (1 x PBS içinde % 20, % 40, % 60 ve % 80 gliserol) her çözümde oda sıcaklığında 1 h için konsantrasyonları artan bir dizi tarafından temizleyin.
    Not: embriyo için daha uzun zaman % 80 gliserol içinde yıkayın, hatta günler kadar temizlenir ve sonra onları bu adımda (Şekil 2) 4 ° C'de % 80 gliserol saklayın. Sodyum azid ora kristal thymol, çok küçük bir miktar 4 ° C'de gliserol veya 1 x saklanan embriyolar ekleme PBS küf gelişimi önlemek için önerilir. Takas sonra bütün Dağı embriyo (adım 4) fotoğraf çekmek için kullanılabilir.
  8. Seçenek 2: gömme ve bir microtome (Şekil 2) kullanarak kesit parafin için embriyo işlemek. Tüm lekeli embriyo ifade desende (adım 4 ve 5) kesit önce belge.

4. fotoğraf bütün Dağı embriyolar

  1. Bütün Dağı kesit önce embriyo lekeli fotoğraf, onları bir tabanı ile hazırlanmış Petri kabına aktarmak için 1 x PBS % 1-2 özel katılaşmış.
  2. Dehidratasyon ve yansıma sıvı fotoğraf çekimi sırasında önlemek için tamamen 10 mL 1 x PBS özel kaplamalı yemekler ile embriyo kapsar.
  3. 1 x PBS forseps kullanarak dalmış embriyo yönlendirmek. (E10.5-E12.5) büyük embriyolar için forseps yerleştirin ve numune içindeki farklı açılarda konumlandırın ve serbest dalgalanma fotoğraf sırasında önlemek için ile özel küçük bir delik açmak.
  4. Çanak iletilen (altında sahne) ışık kullanarak stereomicroscope sahnede yerleştirin. 'Karanlık-alanın' ve 'alan parlak' ayarlamaları istenen aydınlatma Fotoğrafçılık sırasında ayarlamak ve örnek kalınlığı en iyi duruma getirmek için arasında değiştirin.
    Not: sonraki aşamada embriyolar için fiber optik aydınlatma embriyo yüzeyi yansıması önlemek için kullanın. Temizlenen embriyo fotoğrafı çekerken, aynı yordamı izleyin ama bunları % 100 gliserol içeren bir Petri kabına aktarmak ve onları koltuğunuza.

5. parafin gömme ve X-gal kesit embriyo lekeli

  1. Parafin mumu katıştırma
    1. X-gal embriyo 4 ° c (adım 3.5) lekeli kaldırmak ve sabitleştirici fazlalığı ortadan kaldırmak için üç kez 1 mL 1 x PBS ile yıkayın.
    2. Her embriyo forseps kullanarak bir Histoloji kaset aktarın.
    3. Embriyo bir ölçek içeren kaset yerleştirin ve sonra oda sıcaklığında kademeli etanol yoluyla geçirerek kurutmak: % 70 etanol, bir kez 30 dakika; % 96 etanol, 30 dk için iki kez; % 100 etanol, 30 dk için iki kez.
      Not: Embriyo dehidratasyon işlemine başlamadan kadar belirsiz bir kez 4 ° C'de % 70 etanol içinde depolanabilir.
    4. İsopropanol oda sıcaklığında 30 dakika tüm kasete kuluçkaya.
    5. Forseps kullanarak, önceden ısıtılmış isopropanol içeren yalak boyama bir cam kasetleri aktarmak ve 60 ° c için 30 dk fırında bırakın.
    6. Yeni bir bardakta olsun % 50 isopropanol karışımı içeren yalak boyama kaset yerleştirin / % 50 Parafin balmumu erimiş ve 4 h 60 ° C fırında bırakın.
    7. Kaset erimiş Parafin balmumu, 60 ° c 30 dk iki değişiklik ile embriyo ile kuluçkaya.
    8. Son parafin yıkama sonunda, kaset açın ve örnek bir stereomicroscope altında görüntülemek için kalıp katıştırma ayrı bir doku her embriyo transfer.
    9. 60 ° C'de erimiş parafin mum ile iyi doldurun Isıtmalı forseps erimiş mum tutmak ve dikkatle kalıp embriyo yönlendirmek için kullanın.
      Not: Örnek uygun yönlendirmeyi istenen düzlemde embriyo kesit için kritik bir adımdır.
    10. Önce kalıp içinde parafin katılaşır, blok üst kapağı olmadan bir kaset yerleştirin ve erimiş parafin mum ile doldurun. Gecede oda sıcaklığında katılaşmış kadar kalan balmumu soğumaya bırakın.
    11. Parafin tamamen katılaşmış bir kez sağlam blok kalıptan çıkarın ve parafin blok oda sıcaklığında veya 4 ° c14kesit kadar saklayın.
  2. Parafin kesit
    1. Microtome üzerinde bıçak yönlendirmek ve kalınlığı 5-7 µm kadar ayarla. 5.2.2. cool parafin blok buz üzerinde ve bir küp veya bir piramit üretmek için trim.
    2. Blok microtome sahibine erimiş mum küçük bir miktar kullanarak ekleyin.
    3. En uygun kesme blok gelecek şekilde yönlendirin. Bölüm parafin blok standart microtome kullanarak oda sıcaklığında 5-7 µm kalınlığında dilimler halinde.
    4. İyi bir fırça kullanarak, bir su banyosu manipüle ve dilim seçmek için oda sıcaklığında bölümleri yerleştirin.
    5. Mikroskop kaydıraklı su banyosu bölümlerden almak ve germe için 42 ° c su banyosu içine aktarabilirsiniz.
    6. Su banyosundan bölümleri kaldır ve yavaşça yapışma mikroskop slaytlar koyun.
    7. Slaytlar 37 ° C'de bölümleri tamamen bağlı kalmak izin vermek için bir gecede de fırında kuru, aksi takdirde, onlar boyama sırasında kayıp alabilirsiniz.
      Not: 4 ° C'de slaytları yordamlar boyama başlangıç kadar depolama.
  3. Deparaffinization ve X-Gal-lekeli parafin bölümlerini Counterstaining
    1. Bir fırın daha sıvı Parafin balmumu yapmak en az 45 dakika için 60 ° C'de mikroskop-slayt tepside slaytları koymak.
    2. Slaytlar bir raf üzerine transfer edecek ve yemekleri boyama cam aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için: konsantrasyonları tam parafin kaldırma ve dokuları hidrasyon için azalan alkoller içeren boyama kavanoz rafa batırılma: isopropanol 5 min için 60 ° C; isopropanol 3 dk için; % 100 etanol 2 min için; 1 dk. için % 96 etanol; % 70 etanol için oda sıcaklığında 1 dak.
    3. İki kez yok alkol artıkları olduğundan emin olmak için distile su bölümlerde durulayın.
    4. Bölümleri (Örneğin nükleer hızındaki kırmızı çözüm) (Şekil 2) Oda sıcaklığında (genellikle 3-8 dk arasında) 5 min için bir leke ile counterstain.
      Not: Bu boyama bölümleri genel doku yapısı ortaya çıkarmak için yardımcı olur.
    5. Boyama sonra slaytlar 1 dk. için distile suda yıkayın ve mikroskobu boyama bölümüne bakın.
      Not: istediğiniz boyama çok zayıf ise, counterstain daha uzun süre bölümleri.
    6. Etanol konsantrasyonları artan ile aşağıdaki serisi bölümlerde kurutmak: iki yıkar % 95 etanol için 2 dk içinde iki % 100 etanol için 2 dk içinde yıkar ve mavi eriterek önlemek için renk precipitates, ksilen içinde sadece bir hızlı yıkama.
    7. Raf tek tek slaytları kaldırmak ve bir kağıt parçası koyun. Sonra mount ve coverslip her bir sentetik, kalıcı montaj orta kullanarak kaydırın.
      Not: Ksilen rahatsız edici ve insan sağlığı ve Sucul organizmalar için zararlı olan buharlar yanıcı bir üründür. Bu bir başlık içinde manipüle edilebilir gerekir ve uygun koruyucu ekipman kullanımı gerektirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşte tüm fare embriyo (resim 1 ve Şekil 2) substrat olarak X-gal kullanarak β-galaktozidaz histochemical reaksiyon için standart protokol uygulanmasının sonuçları göstermektedir. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz membran tipi 4-Matriks metalloproteinaz (Mt4-mmp) ifade farklı embriyonik gelişim dönemleri (E9.5, E11.5 ve E12.5) de incelemek LacZ muhabir endojen kontrolü altında hızlı Mt4 mmp mutant fare kullanarak MT4 mmp organi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.

Bu yöntemin doğru uygulama içinde bir boyama sağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAKTİFLER< / güçlü >
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004 / LE3Q2014
Sulu montaj ortamıVECTOR LABSH-5501
Sentetik montaj ortamıMERCK100579
%96 EtanolPROLABO
%99,9 Etanol mutlakSCHARLAUET00021000
%50 Gluteraldehit çözeltisiSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
%85 GliserolMERCK104094
%99,9 GliserolSIGMA-ALDRICHG5516
Magnezyum klorür hekzahidratSIGMA-ALDRICH63064
Noniyonik yüzey aktif madde (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nükleer Hızlı Kırmızı karşı lekeSIGMA-ALDRICHN3020
Parafin pastilleriMERCK111609
ParaformaldehitSIGMA-ALDRICH158127-500g
Fosfat tamponlu salin (tabletler)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Potasyum ferrosiyanatMERCK1049840500
Potasyum ferrosiyanürMERCK1049731000
Sodyum azidSIGMA-ALDRICHS8032
Sodyum deoksikolatSIGMA-ALDRICH30970
Sodyum dihidrojen fosfat monohidratSIGMA-ALDRICH106346
Sodyum fosfat dibazik dihidratSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hidroklorür (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
KsilenVWR KİMYASALLARIVWRC28973.363
EKİPMANLAR< / güçlü>
Tek kullanımlık plastik kriyokalıplar 15x15x5 mmSAKURA4566
Döner MikrotomLeicaRM2235
KasetlerOxford TradeOT-10-9046
Mikroskop Kapak Camları 24x60 mmVWRECN631-1575
Mikroskop slaytlarıThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERAGAA000001#12E
Yapışma mikroskobu slaytlarıThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERJ1820AMNZ
Flotasyon Su banyosuLeicaHI1210
Tek Kullanımlık Düşük Profilli Mikrotom BıçaklarıTüyUDM-R35
Parafin fırınıJR SELECTA
Balmumu Parafin dağıtıcısıJR SELECTA
StereomikroskopLeicaDM500
Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 2.0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Orbital çalkalayıcıIKA LabortechnikHS250 BASIC
Karıştırma Sıcak PlakasıBibbyHB502
Vorteks ÇalkalayıcıIKA LabortechnikMS1
Laboratuvar terazisiGRAMFH-2000
Hassas teraziSartoriusISO9001
pHmetreCrisonBasic 20
Optik fiberOptechPL2000
20824365, 2000205 4000490

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Beta galactosidase DetectionX gal StainingMouse Embryo AnalysisParaffin SectioningHistochemical AssayGene Expression TracingWhole Mount StainingCell Lineage StudiesEmbryo ClarificationDevelopmental Biology

Related Articles