Method Article

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNAs) bir post-transcriptionally hücresel gen ekspresyonu düzenleyen küçük kodlamayan RNA'ların sınıfıdır. MiRNAs bağlama 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) mRNA protein çeviri inhibe veya bazı durumlarda mRNA düşmesine yol için hedef. MiRNA için 3' UTR tarafından 2 – 8 nükleotid tohum dizisi sonunda 5' miRNA aracılı mRNA hedefinin bağlama. Hücresel düzenleyici molekülleri miRNAs rolünü iyi kurulmuş olsa da, fonksiyonel alaka ile hedef mRNA tanımlaması bir meydan okuma olarak kalır. Bioinformatic Araçlar içinde 3' UTR mRNA'ların, dizileri miRNA bağlama için potansiyel hedef olarak tahmin etmek için istihdam edilmiştir. Bu araçlar aynı zamanda işlevsel rolü tahmin etmek için bir girişim böyle dizileri akraba türler arasında evrimsel korunması belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, bu hesaplama yöntemleri kez yanlış pozitif sonuçlar üretmek ve kurallı etkileşim miRNA ve mRNA arasında öngörülen biçilen için sınırlıdır. Bu nedenle, miRNA mRNA hedefine için doğrudan bağlama ölçmek deneysel fonksiyonel etkileşim kurmak için gerekli işlemlerdir. Bu raporda, hücresel miRNA miR-125b ve 3' UTR PARP-1 mRNA arasında doğrudan etkileşim doğrulamak için hassas bir yöntemi açıklanmaktadır. Sentetik biotinylated-miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected ve cep lysate da miRNA-mRNA komplekse streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile indirilmiş bir protokol ayrıntılı. Son olarak, hedef mRNA çekti aşağı nükleik asit karmaşık bir qPCR tabanlı strateji kullanarak sayısal.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNAs) küçük olumsuz protein ifade1düzenleyen RNA'ların kodlamayan. MiRNA nın kümeleri aracılığıyla intergenic bölgeler ve intron protein kodlayıcı genlerin2,3içinde en sık genom sahip pek çok bölge yer alır. MiRNAs Biyogenez dahil PRI-miRNAs miRNA kodlama, transkripsiyon genler4. PRI miRNAs sıralı işleme, ilk çekirdeği ve daha sonra tek telli olgun miRNAs4,5oluşturmak için sonra sitoplazmaya geçmesi. Daha sonra olgun miRNAs RNA-induced silencing tesisin (RISC) dahil edilmiştir: hedef tanıma4,5, proteinlerin Argonaute ailesinin bir üyesini içerir bir multimeric protein-RNA kompleksi 6,7. Olgun miRNAs karmaşık RISC ağırlıklı olarak 3' UTR hedef mRNA'ların8,9,10 bağlamak ama de zaman zaman kodlama ve mRNA10,11 5' UTR bölgesinde bağlayabilirsiniz . MiRNA mRNA için bağlama sonuçları translasyonel susturmak12,13,14 ve bazı durumlarda mRNA istikrarsızlık15diziler. Bir tek miRNA birçok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz düzenleyici bu moleküller hemen hemen her hücresel sürecine dahil ve çeşitli hastalık koşulları da16,17,18karıştığı olmuştur.

Detaylı anlayış nasıl miRNAs hücresel yolları düzenleyen hedef mRNA'ların tanımlaması gerekir. Birden çok Biyoinformatik platform sözde miRNA:mRNA etkileşimleri19,20tahmin etmek kullanılabilir. Bu tahminler mükemmel Watson-Crick baz miRNA 2 – 8 nükleotit tohum sırasını ve hedef mRNA4,21içinde tamamlayıcı bir dizini arasında eşleşmesi üzerinde güveniyor. Buna ek olarak, bu araçlar miRNA:mRNA çift yönlü ikincil yapısını oluşturmak, bu moleküler etkileşim termodinamik parametreler hesaplamak ve bağlayıcı siteleri korunması hedef fonksiyonel alaka geliştirmek için türler arasında göstermek tahmin. Ne yazık ki, bu araçlar aynı zamanda yanlış pozitif hedeflerin çok yüksek oranda (% ~ 27 – 70)15,22tahmin sınırlaması var. En önemlisi, bu silico platformlar miRNAs kanonik olmayan etkileşimleri onların hedefleri23ile tanımak için başarısız. Bu nedenle, böyle akıllı analizleri kez işlevsel olarak ilgili hedefleri doğrulama için deneysel yöntemler ile birleştirilir.

Birden fazla yaklaşımları deneysel miRNA:mRNA etkileşim doğrulamak için geliştirilmiştir. MiRNA taklit eder kullanarak genetik deneyler sünger ve miRNAs hücre düzeyleri alter inhibitörleri hedef gen ifade24,25,26üzerindeki düzenleyici etkisi için ipuçları sağlayabilir. Ayrıca, muhabir deneyleri 3' UTR bölgesinin hedef mRNA ve miRNA taklit eder içeren bir klonu Co transfection ile alan veya hücrelere inhibitörleri miRNAs26düzenleyici fonksiyonu kanıtı sağlamak. Bu yöntemlerin çoğu, düzenleme, gen ekspresyonu miRNAs tarafından çalışma için çok önemli olmakla birlikte, transfection verimlilik ve pleotropic hücresel miRNA düzeylerindeki değişiklikler etkilerini bu genetik yaklaşımlar23önemli sınırlamaları vardır, 26. Bu nedenle, miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim sonda tamamlayıcı biyokimyasal yöntemleri miRNAs hücresel fonksiyonun daha iyi anlamak için istihdam edilmektedir.

MiRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim çalışmaya bir yaygın kullanılan RISC karmaşık ve karmaşık27,28,29,30 içinde mRNA hedef tespiti ve ardından immunoprecipitation yöntemidir . Son zamanlarda, bir Gelişmiş RISC tuzak Yöntemi ayrıca miRNA hedefleri tanımlamak için kullanılmıştır; RISC-miRNA-mRNA ara ürün içinde hedefler istikrar mRNA hedefleri arıtma ile çiftler. Ancak, bu methodsface non-spesifik etkileşim genellikle hücresel kompartmanlarda31,32tarafından ayrılmış RNA ve RNA bağlanıcı proteinler arasında içsel sorunları. Buna ek olarak, bu deneyleri için immunoprecipitation RISC karmaşık33AGO2 protein varlığını bağlıdır. Göz önüne alındığında bu AGO2 verimli miRNA:mRNA etkileşimlerin arabuluculuk sadece argonaute değil, diğer argonautes dışlanması için önyargılı sonuçları34neden olabilir. Bu nedenle, alternatif stratejileri miRNA mRNA için doğrudan bağlama çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu raporda, biz bir miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim problama için bir tek adımlı yaklaşım ayrıntılı mRNA. İlk olarak, 3' biotinylated kilitli nükleik asit (LNA) miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected. Sonra miRNA:mRNA cep lysate karmaşık streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak yakalanır. Onun tamamlayıcı miRNA bağlı mRNA hedef qPCR kullanarak sayılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3'-biotinylated miRNA transfection

Not: bir steril laminar akış başlık içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. 2 mL bir kuyu başına tohum 4 x 105–5 x 105 HEK-293T hücre Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) [DMEM % 10 Fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x kalem-strep antibiyotik ile] tamamlayın. 37 ° C, % 5 CO2 gecede ayarla bir kuluçka hücrelerde kültür.
  2. Ertesi gün, sağlık ve bağlılık hafif bir mikroskop altında kaplama hücre kontrol.
    Not: hücreleri yapıştırılır ve bir sonraki adıma devam etmeden önce uygun morfoloji elde emin olun. HEK-293T hücreleri genellikle 18-24 h transfection için hazır kaplama sonrası.
  3. Steril 1.7 mL microfuge tüp biotinylated miRNA en az temel medya 200 µL içinde 75 picomoles oranında seyreltin. Bu karışımı az temel medya 200 µL içinde seyreltilmiş başka bir 1.7 mL microfuge tüp içeren Lipozom tabanlı transfection reaktifi (8 µL/de) aktarın. Pipetting tarafından iyice, ama nazikçe, mix ve transfection komplekslerinin oluşumu izin vermek için oda sıcaklığında 20-25 dk için kuluçkaya.
  4. Nazik pipetting tarafından eski medya 6 iyi kültür plaka kaldırmak ve her şey taze hazırlanmış tam DMEM (olmadan 1 kalem-strep antibiyotik x) 1.6 mL ile doldurmak.
  5. Transfection kompleksleri (1.3) iyi kalibre edilmiş bir pipet kullanarak 6-şey plaka hücrelerde drop-wise ekleyin. Plaka yavaşça plaka arasında onların tekdüze dağılım sağlamak kompleksleri eklerken girdap.
    Not: Bu adım yüksek verimli transfection ulaşmak için çok önemlidir ve özen ve sabır ile gerçekleştirilmelidir.
  6. 37 ° C ve % 5 CO2 en az 36 h için hücre kültür.

2. hazırlanması Streptavidin kaplı manyetik boncuklar — ben

  1. Streptavidin manyetik boncuklar iyice vortexing tarafından resuspend. Boncuk süspansiyon (örnek) başına 30 µL 2 mL nükleaz ücretsiz microfuge tüp aktarın.
  2. 2 dk manyetik boncuk ayırıcı stand ("mıknatıs" Bundan sonra) boncuk süspansiyon içeren tüpü yerleştirin. Boncuk tüp mıknatıs ile temas halinde tarafına çizilir kontrol ettikten sonra dikkatli bir şekilde bir micropipette kullanarak süpernatant çıkarın.
  3. Boncuk yıkama arabelleği (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) 100 µL boncuk için ekleyin. Tüp mıknatıs kaldırın. Girdap 15 s boncuk yıkamak için oda sıcaklığında.
  4. 2 min için mıknatıs üstündeki içeren tüp yerleştirin ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
  5. Adım 2.3 ve 2.4 üç yıkama toplam için yineleyin. Son yıkama adımdan sonra tüp mıknatıs kaldırın.
  6. Boncuk için çözüm (0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl) boşaltma RNase 100 µL ekleyin, karıştırın de tarafından vortexing 15 s ve oda sıcaklığında 5 dk. yerleştirmek için 2 dk için mıknatıs üstündeki içeren tüp kuluçkaya ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
  7. 2.6 Toplam üç kez tekrarlayın.
  8. Boncuklar, girdap 15 s, boncuk resuspension çözüm (0.5 M NaCl) ekleyin ve 5 dk. resuspended boncuk 2 min için mıknatıs yerleştirin ve dikkatle süpernatant kaldırmak için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  9. 200 µL çözüm (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL Maya tRNA) engelleme boncuk boncuk için ekleyin. Karıştırmak yanında nazik vortexing 15 s, oda sıcaklığında. 16 h (aşırı gece) çoklu tüp rotator için 4 ° C'de kuluçkaya.

3. hücre Lysates hazırlanması

  1. Nazik bir steril hücre kazıyıcı laminer başlık içinde kullanarak kazıma transfected HEK-293T hücreleri hasat, sonra her örnek bir steril 2 mL microfuge tüp içine aktarın.
  2. 5 dk. Resuspend için Pelet steril PBS (fosfat tampon tuzlu) pH 7.2 x 1 alıntı hücreleri tarafından Santrifüjü 1.500 x g de cips. Santrifüj tekrar 1.500 x g Pelet artık medya ücretsiz almak 5 min için de. Hemen buz Pelet içeren tüp Dalma.
  3. Taze tam hücre lizis arabellek hazırlamak (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7.5, 5mM DTT, % 0.5 IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 proteaz inhibitörü x).
    Not: IGEPAL, Superase ve proteaz inhibitörü kokteyl eksik hücre lizis arabelleği bir hisse senedi önceden hazırlanmış ve oda sıcaklığında depolanır. Tam hücre lizis arabellek taze bir dizi hisse senedi hücre lizis arabellek için önerilen son konsantrasyonlarda yukarıdaki takviyeleri ekleyerek ve buz üzerinde depolama hazır olun.
  4. Microfuge tüp (her microfuge tüp 6-şey plaka bir kuyudan hasat hücreleri içerenyani ) her örnekte buz gibi tam hücre lizis arabelleği 260 µL ekleyin ve hücre Pelet homojen bir süspansiyon pipetting tarafından resuspend.
  5. Donma-çözülme yöntemini kullanarak hücreleri parçalayıcı: tüpler için 10-15 dk-80 ° C'de kuluçkaya. O halde, buz erimek için hücreleri izin.
  6. Elde edilen hücre 16.000 x g 5 dakika içinde 4 ° C'de ayarla buzdolabında benchtop santrifüj için de lysate santrifüj kapasitesi
  7. Temizlenen hücrenin lysate steril 1.7 mL microfuge tüp buza aktarın. Pelet atmak.
    Not: Son hacmi lysate temizlenmiş ~ 240-250 olmalıdır µL.
  8. 5 M NaCl lysate temizlenen için 1 M son bir konsantrasyon ekleyin ve buz üzerinde örnekleri korumak.

4. Streptavidin manyetik boncuklar hazırlanması — II

  1. Taze tam açılan yıkama arabellek (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, %0,5 IGEPAL, 60U/mL Superase ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl) hazırlamak
    Not: IGEPAL, Superase ve proteaz inhibitörü kokteyl eksik açılan yıkama arabelleği bir hisse senedi önceden hazırlanmış ve oda sıcaklığında depolanır. Tam hücre lizis arabellek taze bir dizi hisse senedi hücre lizis arabellek için önerilen son konsantrasyonlarda yukarıdaki takviyeleri ekleyerek ve buz üzerinde depolama hazır olun.
  2. Tüp mıknatıs 2 dakika süreyle üzerinde (Kimden adım 2,9) boncuk hazırlanan dikkatle kaldırmak ve süpernatant içeren yerleştirin.
  3. Buz gibi tam açılan yıkama arabelleği 150 µL boncuk için ekleyin. Girdap 15 s ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle mıknatıs üzerine boruları dikkatle kaldırmak ve süpernatant 30 – 60 s. yer için kuluçkaya.
  4. 4.3 Toplam 3 kez tekrarlayın.
  5. Boncuk tam açılan yıkama arabellek 300 µL içinde resuspend.

5. hedef mRNA miRNA kompleksleri, pull-down

  1. Hücrenin lysate 300 µL (adımından 3.8) aktarmak için 300 µL boncuk (Kimden adım 4.5) içeren microfuge tüp.
  2. Karışımı oda sıcaklığında 1 h için nutating Mikser üzerinde kuluçkaya.
  3. 5 dakika süreyle mıknatıs tüp dikkatle kaldırmak ve süpernatant yer.
  4. Buz gibi tam açılan yıkama arabelleği 300 µL boncuk için ekleyin. Girdap 15 oda sıcaklığında ve yerde 5 dakika süreyle mıknatıs tüp dikkatle kaldırmak ve süpernatant s.
  5. 5.4 iki kez daha tekrarlayın.
  6. Boncuk nükleaz ücretsiz su 100 µL içinde resuspend ve buz üzerinde kuluçkaya.

6. Toplam RNA çıkarma, cDNA sentezi ve qPCR

  1. Resuspended boncuk (Kimden adım 5.6) Toplam RNA ayıklamak uygun bir yöntem kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek). Ayıklanan toplam RNA nükleaz ücretsiz su 25 µL içinde resuspend. RNA konsantrasyon ve bir spektrofotometre (260/280 absorbans) kullanarak kalitesini belirler. 50 ng/µL adlı bir çalışma hisse senedi-RNA'ın hazırlayın.
  2. CDNA sentezi, triplicates içinde 50 kullanarak gerçekleştirmek ng (Kimden adım 6.1) Toplam RNA'ın bir uygun cDNA sentez kullanarak kiti ( Tablo malzemelerigörmek) 20 µL (Tablo 1) son bir hacim içinde oligo dT primerler kullanılarak. Sonra Tablo 2' de tanımlanan koşullara göre termal Bisiklete binme gerçekleştirmek için qPCR araç içine yük PCR tüpleri.
  3. QPCR (Kimden adım 6.2) CDNA gerçekleştirmek SYBR yeşil kimya kullanarak (tablo malzemeleri görmek):
    1. Tüm qPCR reaksiyonlar triplicates 96 uzak alt plaka steril koşullarda içinde gerçekleştirin.
    2. QPCR ana tepki karışımı aliquot 9 µL plaka her kuyunun içine karıştırın (bkz. Tablo 3). Daha sonra 1 µL cDNA 10 µL. bir son hacmi elde etmek için her şey için ısıya dayanıklı PCR plaka sealer kullanarak PCR plaka mühür ekleyin ve qPCR araç yük
    3. Tablo 4' te tanımlanan koşullara göre termal Bisiklete binme gerçekleştirin.
    4. Her örnek ifade düzeyde şifreli denetimler için ifade düzeyleri (Ct değerler) normalleştirmek. Kat değişiklikleri ifade hesaplamak için bu değerleri kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs hedef mRNA'ların bağlama yaparak hücresel işlemleri düzenler. Bu nedenle, tanımlayıcı mRNA miRNA işlevini anlamak için bir anahtar hedefleridir. Burada hücresel miRNA mRNA hedefi tanımlamak için bir yöntem ayrıntılı. Bu iletişim kuralı Wani ve ark. adapte 35 biotinylated LNA tabanlı miRNA taklit eder için açılan kullanarak değişiklik ile mRNA hedef. LNA tabanlı oligonükleotid taklit eder özgüllük hedef bağlama değiştirilmiş riboz yüzük toksik etkile...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel miRNAs mRNA hedefleri tanımlaması düzenleyici işlevleri anlamak için önemlidir. Birkaç hesaplama araçları tohum sıra tamamlayıcılık ve koruma hedef sıraları19,20temel hedeflerini tahmin etmek için istihdam edilmektedir. Bu araçları değerli olmasına rağmen yüksek düzeyde yanlış pozitif ve yanlış negatifleri oluşturabilirsiniz. Bu nedenle, bu tahminler ile onların anılan sıraya göre hedefler27,31mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali ve mali olmayan ilgi bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kısmen ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe DA037779 (için J.P.), tarafından desteklenen DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 ve MD007586 (CD için). Çalışma Ayrıca RCMI Grant G12MD007586 Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975 tarafından desteklenmiştir Meharry Translational Araştırma Merkezi (MeTRC) CTSA vermek (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 NIMHD/NIH üzerinden ve AIDS Tennessee Merkezi Araştırma (P30 AI110527).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hücre hattı HEK293T hücreleriATCCCRL-3216
Isı ile aktive edilmiş Fetal sığır serumu (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Fosfat tamponlu salin (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Tripsin-EDTA (%0,25) GIBCO/Thermofisher25200-056
Penisilin-Streptomisin çözeltisi (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM Azaltılmış serum ortamıGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfektamin 2000 Transfeksiyon reaktifiInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Biyotinile has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Biyotinile karıştırılmış şifreli kontrolExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidin Manyetik boncuklarPierce88816
Maya tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA2153
Potasyum klorür (KCl) çözeltisiSigma-Aldrich60142
Magnezyum klorür (MgCl2) çözeltisiSigma-AldrichM1028
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu (EDTA) çözeltisi, 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Ditiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Proteaz İnhibitörü kokteyliSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAse içermeyen suGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy ekstraksiyon kitiQiagen74104
iScript-Select cDNA sentez kitiBiorad170-8897
qPCR Primerleri Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR yeşil supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MıknatısInvitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340(2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

Related Articles