Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

6.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57797

⸱

3 Temmuz 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical & Aerospace Engineering, Old Dominion University, 2Department of Biological Sciences, Old Dominion University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Yüzeyler ile sertlik kilopascal aralıktaki hücreler yanıt fizyolojik ilgili mikro-çevre sertlik olarak çalışmaya yararlıdır. Sadece bir widefield floresan mikroskop kullanarak, yumuşak silikon jelleri, Young katsayısı ile uygun bir küre bir girinti kullanarak belirlenebilir.

Özet

İnsan vücudunda yumuşak dokular genellikle kilopascal (kPa) aralığında sertlik var. Buna göre silikon ve hidrojel esnek yüzeylerde kısmen vivo içinde koşulları taklit eden bir fiziksel microenvironment hücrelerde kültür için yararlı yüzeylerde olmak kanıtlanmış oldu. Burada, Young'ın dönmeler izotropik doğrusal elastik yüzeyler genellikle mechanobiology çalışmaları için kullanılan, karakterize için basit bir protokol mevcut. Protokol bir Petri kabına veya sert silikon yumuşak silikon yüzey hazırlama, silikon substrat floresan boncuklar ile üst yüzey kaplama, floresan Imaging üst yüzeyi (yerçekimi) tarafından girintilemek için bir milimetre çaplı küre kullanarak oluşur boncuk floresan mikroskop kullanarak ve Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için sonuç görüntüleri analiz girintili silikon yüzeyi. Substrat'ın üst yüzeyi dönmeler hücre dışı matriks proteini (ek floresan boncuklar) ile kaplin kolayca sonraki çalışmalar traksiyon kuvvet mikroskobu deneyler kullanarak ve hücre kaplama için kullanılmak üzere silikon yüzey sağlar. Yumuşak silikon temeli olarak bir petri yerine sert silikon kullanımı dış streç içeren mechanobiology çalışmalar kullanımını etkinleştirir. Bu iletişim kuralı belirli bir avantajı birçok laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılabilir, widefield floresan mikroskop büyük ekipman bu yordam için gerekli olmasıdır. Biz bu iletişim kuralı, yumuşak silikon yüzeylerde farklı elastik dönmeler, Young katsayısı ölçerek göstermek.

Giriş

Yumuşak doku hücrelerinde bir mikro-kimin sertlik kilopascal Aralık1, doku kültürü yemekleri olan sertlik büyüklükte birkaç emir daha yüksek olduğunu aksine ortamı yer alır. Hücre dışı matriks proteini kaplı yumuşak yüzeylerde hücrelerdeyse ile erken deneyler yüzey sertliği nasıl hücreleri üzerinde hareket yanı sıra2,3altında hücre dışı matriks uygun etkiler gösterdi. Aslında, yüzey sertliği temelde yaygın biyokimyasal sinyalleri için benzer bir şekilde hücre fonksiyonu4 etkiler. Polyacrylamide (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı) jelleri (su-permeating) kapsamlı5mechanobiology çalışmalar için kültür yüzeylerde hücre olarak kullanılmış olan hydrogels. POLYDİMETHYLSİLOXANE (PDMS), en sık kullanılan silikon (polysiloxane), yaygın sert bir silikon ile megapascal menzilli sertlik mikron ölçekli imalat6için kullanılmıştır. Son zamanlarda, daha yumuşak silikon yüzeyler ile sertlik daha fizyolojik ilgili kilopascal aralığındaki hücre kültür yüzeyler için mechanobiology çalışmalar7,8olarak istihdam edilmiştir.

Atomik kuvvet mikroskobu, makroskopik deformasyon küreler kullanarak ve küresel microindentors9 uçlu depoladığınız ve Reolojisi, germe üzerine tüm örnekleri de dahil olmak üzere esnek yüzeylerde sertliği ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır . Her tekniği kendine özgü avantajları ve dezavantajları olsa da, girinti bir küre ile yalnızca erişmesi gereken widefield floresan mikroskop bir özellikle basit ama oldukça doğru yöntemdir. Girinti metalik bir küre ile ön çalışma3,9,10hydrogels sertliği ölçmek için kullanılmaktadır. Yüzey sertliği hücre hareketi için önemini gösterdi erken dönem çalışmaları hidrojel yüzey sertliği3belirlemek için bu yöntemi kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, confocal mikroskobu da zarif karakterizasyonu10için kullanılmıştır.

Burada, floresan boncuk kaplin yumuşak silikon yüzey hazırlama adım adım bir iletişim kuralı mevcut (ve bir hücre dışı matriks protein kollajen gibi ben) düşsel bir indenting küre ve üst yüzey kullanarak sadece üst yüzeye, faz ve Imaging, sırasıyla ve nihayet Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için görüntüleri analiz floresan. Bu şekilde hazırlanan yumuşak silikon substrat çekiş kuvveti mikroskopisi deneyler için kolayca kullanılabilir. Yumuşak silikon üs olarak (yerine bir petri) sert silikon kullanımı da mechanobiology çalışmaları harici bir streç kullanarak sağlar. Garanti nerede pratik hususlar komplikasyonlar kaçınmak için gerekli ayrıca belirtilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. yumuşak silikon substrat imalatı

  1. 1,75 g bir bileşeni ve B bileşeni 1,75 gram ağırlığında (A:B = 1:1) (Polistiren) kullanarak yumuşak silikon elastomer Seti'nden tepsiler ağırlığında.
  2. B bileşeni tartı tepsisinde bir bileşeni eklemek ve bunları birlikte 5 min için bir uygun aplikatör stick kullanarak karıştırın.
  3. Yukarıdaki karışımı bir 35 mm Petri kabına ekleyin. Eşit yayılmış Petri kabına birkaç dakika karışım izin verin.
    Not: Seçtiğiniz bir Petri kabına çapı ve yumuşak silikon miktarı yumuşak silikon kalınlığı belirler. Burada, kalınlığı yaklaşık 3.5 mm olacak; tartışma bölümünde elastomer kalınlığı belirlemeyle ilgili daha çok.
  4. Herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak 15 dakika vakum odasında, kapak ile silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Bu süre içinde sıcak bir tabak ile 70 ° c ön ısı
  5. 70 ° C sıcak plaka ulaştıktan sonra bir cam slayt üzerine yerleştirin ve cam slayt üzerinde silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Silikon izin tedavi için 30 dk 70 ° c. Petri kabına erime gibi polistren çanak doğrudan sıcak tabakta koymayın.

2. yumuşak silikon için floresan lastikteki kaplin

  1. Tedavi yumuşak silikon (içinde ele geçen Petri kabına) derin bir UV odası (185 ve 254 nm ışık dalga boylarında ve derin bir UV lamba ile bir kasada) yerleştirin. Yumuşak silikon örnek (~ 5-10 cm uzaklıkta UV lambası) derin UV ışık için 5 min için maruz.
    1. Silikon derin UV ışığına maruz iken, aşağıdaki adım 2.2-2.6 ile devam edin. Derin UV Işınlarına maruz kalma sonra örnek almadan önce en az 5 min için derin UV odası degas.
  2. Bu arada, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 19 mg dışarı tartmak ve 500 μL deiyonize su (DI) su ekleyin. EDC tüpü hafifçe sallayarak geçiyoruz.
  3. Bir ayrı 1.5 mL microcentrifuge tüp N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) 11 mg tartmak, 500 μL DI su ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak sulfo NHS geçiyoruz. Sonra bir tek microcentrifuge tüp EDC ve sulfo-NHS çözümlerinde birleştirir.
  4. Bu EDC/sulfo-NHS, 30 μL 0,44 mikron çapında kırmızı (veya Floresan Mikroskobu kullanılabilir filtre küpleri göre başka bir floresan renk) değiştiren karboksilat floresan lastikteki (ile % 1 w/v hisse senedi toplama) ekleyin.
  5. EDC/sulfo-NHS/boncuk karışıma kollajen 0,02 mg (dan fare kuyruğu, hisse senedi 4 mg/mL 0,02 M asetik asit konsantrasyonu) 0,02 mg/mL konsantrasyonu elde etmek için.
  6. Girdap EDC/NHS/boncuk/kollajen ben karışımı kısa bir süre boncuk eşit boyunca, kaplin önce dağınık emin olun.
  7. Pipet EDC/NHS/boncuk/kollajen 1 mL ben karışımı parafilm başka bir sığ, düz kapak (daha küçük çaplı) üzerine yerleştirilen bir parçası üzerinde. Yumuşak silikon yüzey karışımı bağlantı kurar ama doğrudan küçük Petri kabına kapağı aşağıdaki yüzey dokunmatik değil böylece bu karışım üzerinde yumuşak silikon ile Petri kabına tersine çevirin. Ters Petri kabına artırmak için bir veya iki cam slayt ters Petri kabına çubukları iki tarafında altında kullanın.
    Not: Lütfen adım 2.7 nasıl gerçekleştirildiğini görmek için Şekil 1 ' e bakın.
  8. Alüminyum folyo ile örnek kapak ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  9. Petri kabına yumuşak silikon ile kaldırın ve dik ayarlayın (silikon-yan).
  10. Yemek için PBS (pH 7,4) 2 mL ekleyerek yumuşak silikon yüzeyi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile yıkayın. Birkaç dakika için oturup izin. PBS Aspire edin ve silikon PBS 2 mL ile tekrar yıkayın. Silikon tedavisi daha da yaklaşık bir gün ver. Bu nedenle, yumuşak silikon örnek 37 ° C'de gecede PBS içinde yerleştirin.

3. küre Widefield floresan mikroskop kullanarak girinti ile silikon sertlik ölçümü

  1. Petri kabına yumuşak silikon ile almak ve en az 1 mL silikon yüzeyi sıvı yüzeyinin altında birkaç mm için PBS içerdiğinden emin olun.
  2. Sivri uçlu cımbız kullanarak, beş 1 mm Zirkonyum küre indentors yumuşak silikon üzerinde bırakın. Küre sıvı orta bırakın ve bırakın, silikon katmanı ve diğer indentors konumunu uzak en az 5 indentor çapları kenarlarını uzak.
    Not: sıvı yüzeyi üzerinde bıraktığımda, küreler sıvı orta (float) girmek sıvı orta 's yüzey gerilimi nedeniyle başarısız olabilir.
  3. Petri kabına temel görüntüyü mümkün böylece Petri kabına yumuşak silikon ile mikroskop sahne alanı'nda yer.
  4. 10 X amacı ile faz Imaging'i kullanma (Kuru 10 X gibi objektif na 0,30), bulun ve bir küre indentor odak haline getirmek.
  5. Bir faz görüntü bir bölümünün ya da indentor bütün al ve bu resmi kaydedin. Bir kiremit tarama varsa kullanır. İndentor görünür herhangi bir kusur varsa, atın ve eski yerine koymak o ile başka bir indentor.
  6. Çerçevenin sol kenar en az ~1.5 R indentor Merkezi'nden bir mesafe olması canlı faz görüntüleme altında indentor'ın kenar sola çevir. İndentor merkezinin sağ tarafında görüntü çerçeve sağ kenarına yakın görünür kalmasını sağlamak. Bir faz görüntü alın ve kaydedin.
  7. Kırmızı floresan kanal için aydınlatma için mikroskop ışık kaynağı geçin. X- ve y-küre indentor'ın merkezi altında kırmızı floresan lastikteki kadar değişmeden koordinatları ( x-y konumu indentor merkezinin içinde ancak çerçevenin sağ kenarına yakın), focus (azalış Z) aşağı odak dışında git.
  8. Lastikteki silikon (yakın görüntüleme çerçevesinin sol kenarı) indentor uzak üst tabakası içinde odak dışında gidene 0.5 µm her z-artışı için görüntü yığınıyla z al.
  9. Örnek olarak diğer indentors ile 3.4-3,8 arasındaki adımları yineleyin.

4. silikon'ın sertlik (Young katsayısı) hesaplama

  1. ImageJ, tıkırtı üstünde çizgi aracını kullanarak indentor faz görüntüyü açmak ve indentor'ın çapı piksel cinsinden ölçün. Tıklatın ve bir noktada indentor kenarda tutun kenarında taban tabana zıt bir noktasına imleci hareket ve uzunluğu, pixel imleç serbest bırakmadan önce ImageJ ana pencerenin durum çubuğunda görüntülenen dikkat edin.
    1. Analiz tıklatarak uzunluk birimi piksel olarak ayarlandığından emin olun | Ayarla ölçek ve uzunluk birimikontrol.
    2. İndentor'ın RADIUS piksel cinsinden nesnel büyütme ve CCD kamera piksel boyutunu dikkate alarak mikron için dönüştürmek (mikron R piksel CCD kamera piksel boyutunu mikron x = R / nesnel büyütme).
  2. (Eğer lastikteki kırmızı floresan) kırmızı kanal z yığını microbead görüntüleri ImageJ içinde dosyası açmak | Alma | Görüntü sırası ve yığındaki herhangi bir görüntü seçin ve yığın açmak için Tamam ' ı tıklatın.
    Not: F1 hangi lastikteki indentor Merkezi altında en iyi olası odakta ve F2 (at ~1.5 R boncuk merkezinden bölgesi) lastikteki çerçevenin sol kenar yakınındaki en iyi olası odakta olan çerçeve numarası çerçeve sayısıdır. Z-iki kare arasındaki farktır girinti derinlik δ.
    1. Çizgi aracı ImageJ kullanarak, görüntü iyi tanımlanmış bir microbead arasında bir çizgi çizin. Tıkırtı üstünde analiz | Profil Arsa ve farklı çerçeve seçerken boncuk Güncellenme Zamanı satır tarama yoğunluğu elde etmek için Live düğmesini tıklayın. Maksimum yoğunluk en yüksek değerini verir kare kare odak olarak seçilebilir.
    2. Z-artış z-yığın çerçeveler arasında 0.5 mikron olduğundan, mikron olarak δ girinti derinlemesine hesaplamak (F2-F1) = 0.5 x.
  3. Yani üzerinde jel (eksi karşıt batmaz kuvvet), ağırlığı nedeniyle indentor tarafından sarf güç hesaplamak, girinti kuvvet F, (indentor - sıvı Orta yoğunluk yoğunluğu) x indentor x ivme yerçekimi nedeniyle hacmi olarak. Denklem F kullanın (4/3) x = (ρindentor - ρOrta) x (R3) x 3.142 indentor yarıçapı R nerede g x ρindentor olduğunu indentor, ρOrta yoğunluk sıvı Orta yoğunluk ve g ivmesi (9,81 m/s2) yerçekimi nedeniyle. Tüm miktarlar SI birimlerinde F (N) elde etmek için sağ taraftaki hızlı.
  4. Young katsayısı (E) değiştirilmiş bir11 Hertz model12 denklemi kullanarak silikon Hesapla:
    figure-protocol-1
    Nerede:
    c = o; aşağıdaki Hertz modeli ifade değiştirir bir düzeltme faktörü
    v = Poisson oranı (0.5 incompressible malzemeler7gelince olarak alınan); silikon jel
    F = girinti kuvvet;
    R indentor RADIUS; = ve
    Δ girinti derinlik =.
    Tüm miktarlar SI birimlerinde E PA elde etmek için sağ taraftaki hızlı
    1. 3aşağıdaki gibi düzeltme faktörü c Hesapla:
      figure-protocol-2
      Nerede:
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4; ve
      figure-protocol-5.
      Bu düzeltme faktörü ne zaman sadece yumuşak silikon de Petri kabına (veya sert silikon) (Bu durumda burada) onun altına'nin özel olarak kullanılmak üzere olduğunu belirtmek.
    2. S silikon eklendi ve Petri kabına çapı miktarına göre yumuşak silikon tabaka yüksekliği hesaplayabilirsiniz. Alternatif olarak, doğrudan silikon tabakanın alt ve üst yüzeyleri z koordinatını faz görüntüleme tarafından belirlenerek h elde etmek (küçük yabancı maddelerin her iki yüzeyde odak haline gelir). Bir büyük h için dikkat edin (s2 > Rδ), düzeltme faktörü c yakın 1'dir.
  5. 4.1-4.4 her indentor için yineleyin. Young katsayısı silikon örnek için Ortalama Young katsayısı elde etmek için her indentor elde edilen ortalama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, biz 35 mm Petri kabına yumuşak silikon hazırlanan, 70 ° c 30 dk için tedavi ve floresan lastikteki birleştiğinde (ve kollajen ben) Şekil 1' de şematik olarak tasvir üst yüzeyi için. Derin UV yüzeylerde13için kaplin nihai protein için daha önce kullanılmış. Biraz daha bir gün boyunca tedavi etmek için yumuşak silikon beklendiği gibi (I) burada kullanılan kür koşulları bu yumuşak sili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Küre girinti yöntemi uygulamak çok kolay olmakla birlikte, indentor seçimi ve yumuşak silikon örnek kalınlığı dikkat ödenmelidir. Denklem Young katsayısı hesaplamak için kullanılan birtakım koşullar11altında geçerli olduğundan ve silikon örnek kalınlığı > %10 indentor yarıçap olduğunda bunlar genellikle memnun musunuz ve < ~ 13 x indentor yarıçapı. 5-10 x silikon kalınlığı indentor RADIUS neyin örnek kalınlığı çok yüksek değil iyi bir seçim olduğunu ortaya koymuştur (yani, nesnel çalışma ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Margaret Gardel cömertçe rheometer kullanımına izin verdiğiniz için teşekkür ederim. Bu eser etkin NIH (1R15GM116082) destek anıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CY 52-276 A/B silikon elastomer kiti Dow CorningCY 52-276Oda sıcaklığında saklayın
Thermo Scientific Pierce EDCFisher ScientificPI22980-20 ° C'de saklayın; C
Thermo Scientific  Pierce Sulfo-NHS çapraz bağlayıcıFisher ScientificPI-24510Mağazası 4 derece; C
Karboksil floresan pembe parçacıklar, 0.4-0.6 &mikro; m, 2 mLSpherotech, Inc.CFP-0558-24 derecede saklayın; C, donmayın
1.0 mm Asitle yıkanmış Zirkonyum boncuklarOPS Diagnostics LLCBAWZ 1000-250-33
Ozon tahliye cihazlı derin UV odasıNovascan Technologies, Inc.PSD-UV4, OES-1000D
Geniş alan floresan mikroskobuLeica MicrosystemsDMi8
Kollajen I, sıçan kuyruğundanCorning354236Stok konsantrasyonu = 4 mg / ml; 4 derecede saklayın; C
ImageJ-NIHN/AN/A Kamumalı yazılım

Kaynaklar

  1. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  2. Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  3. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
  4. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  5. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  6. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).
  7. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  8. Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
  9. Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
  10. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  11. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  12. Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
  13. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
  14. Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
  15. Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).
  16. Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Young Mod l l mSubstrat Sertli i KarakterizasyonuFloresan Boncuk Ba lamaZirkonyum K re ndantasyonuImageJ Analiz ProtokolSilikon Substrat Haz rlamaH cre K lt r Substratlar
Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.