Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

13.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57801

⸱

6 Haziran 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Bu makalede

Özet

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Özet

Maya 2-hibrid tahlil kullanarak protein-protein etkileşimleri için tarama uzun etkili bir araç olmuştur ama kullanımı büyük ölçüde son derece etkileşen adaylar Kütüphanesi'ndeki zenginleştirilmiş yüksek benzeşme interactors keşfi için sınırlı olmuştur. Geleneksel bir biçimde düşük benzeşme interactors bulunduğu düşük sıkılık yürütülen çözümlemek için çok fazla kolonileri Maya 2-hibrid tahlil yol açabilir. Ayrıca, farklı yem plazmid karşı aynı Kütüphanesi bir kapsamlı ve eksiksiz sorgulama karşılaştırmalı bir analiz elde edilemez. Her ne kadar bazı bu sorunları dizilmiş av kütüphaneleri kullanarak ele alınabileceği böyle ekranlar çalışması için gereken altyapı ve maliyetini engelleyici olabilir. Alternatif olarak, aynı anda geçici düzinelerce ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması ve bir strateji kullanarak tek bir ekran içinde statik protein etkileşimler olarak adlandırdığı DEEPN (dinamik zenginleştirme değerlendirme Protein ağları için), hangi yüksek işlem hacmi DNA sıralama ve hesaplama etkileşen ortakları kodlamak plazmid nüfusu evrimi takip içerir. Burada, özelleştirilmiş reaktifler ve kolayca ve uygun maliyetli yürütülecek bir DEEPN ekran izin iletişim kurallarını açıklar.

Giriş

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına1bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., 'füzyon protein av') ve protein oluşan bir verilen 'yem' plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş2için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane 'av' klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.

Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları3az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama4kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat7,8av vurgulu.

Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein 'yemler üzerinde' odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi4' te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim9göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.

Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1' de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:

Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid'ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.

Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan 'yem' füzyon protein faiz ve DNA'ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST3210gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.

Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları11çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid'ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlanması medya ve plakaları

Not: Tüm plakaları en az 2 gün protokol başlamadan önce yapılması gerekir. Medya herhangi bir noktada yapılabilir. Ancak, arabelleğe alınmış maya ekstresi pepton dekstroz adenin (bYPDA) hangisinin kullanılacağı gün yapılması gerekir. Bazı medya ne genellikle kullanılan daha büyük olan adenin düzeyini içeren bir ek karışımı kullanılarak yapılır. En az medya takviyeleri 10 mg/L adenin belirtin. Etiketli takviyeleri '+ 40Ade' 40 mg/L adenin toplam belirtin.

  1. Glikoz çözüm hazırlamak (% 50 w/v). İçin 1 L, D-(+) 500 g çözülür-800 mL distile su bir 1000 mL ölçek glikoz. Bir mezun silindir ve filtre bir steril 1000 mL medya depolama şişe içine bir 0.2 µm steril filtreden kullanmanın 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.
  2. Maya özü pepton Dekstroz (YPD) tabak hazırlamak. İçin 1 L, 20 g pepton ve 10 g Maya Extract 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek geçiyoruz. Mezun silindir içine dökün, 960 mL distile su ile doldurun. 2000 mL Erlenmeyer şişe dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  3. Tam sentetik en az medya (CSM) hazırlamak-Trp plakaları. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 6,7 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 960 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve Trp - 0.7 g ekleyin-çıkarma mix, metiyonin 20 mg ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 40 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  4. CSM-Leu araya geldi tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün ve ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Leu ekleyin-çıkarma mix ve agar 15 g bir araya geldi. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  5. CSM-Leu-Trp tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 1.005 g - Trp ekleyin-Leu + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  6. CSM-Leu-Trp-O'nun tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. De dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  7. CSM-Leu-Trp-His-3AT tabak hazırlamak. İçin 1 L, 800 mL distile su bir 1000 mL ölçek içine Maya azot Bankası 10,05 g amino asitler olmadan çözülür. Mezun silindir içine dökün, ilâ 940 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve 0.975 g - Trp ekleyin-Leu-onun + 40Ade çıkarma mix, adenin 240 mg ve agar 15 gr. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda Bir pipet 60 mL % 50 glikoz eklemek için kullanın. 3-amino-1,2,4 triazole (3AT) 1 M steril stokunun 100 µL içinde dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  8. LB-Kanr tabak hazırlamak. Erime 10 g Tryptone, Maya 5 g için 1 L, hulâsa ve NaCl 10 g 800 ml distile su bir 1000 mL ölçek. Mezun silindir içine dökün, en fazla 1000 mL distile su ile doldurun. Erlenmeyer şişesi bir 2000 mL dökün ve agar 15 g ekleyin. Basınçlı kap ve serin su banyo sıcaklığı yaklaşık 42-50 ° C'ye soğuduktan kadar 37 ° C su banyosunda 50 mg sefaloridin ve dönen tarafından karıştırın.
    1. 100 mm plakalar bir dizi ile 20 mL medya tarafından pipet dökün.
  9. YPD, CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp ve CSM-Leu-Trp-O'nun ortam hazırlamak. Dışında bir Erlenmeyer şişesi dökme yerine, medya depolama şişe içine dökün ve agar ihmal plakalar için yukarıdaki yordamı kullanın.
  10. BYPDA (arabelleğe alınmış YPDA) hazırlayın. Steril YPD medya alıp 200 mg/L adenin steril distile su ekleyin. 3.7 için pH HCl. filtresiyle 0.2 µm steril filtre bir steril şişe içine ayarlayın.
  11. Dönüştürme arabelleği hazırlayın: 2 M sorbitol, 1 M Lityum asetat dihydrate, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0.2 mM kalsiyum klorür distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
  12. PEG çözüm hazırlamak: % 70 w/v Polietilen glikol 3350 distile su içinde. Otoklav tarafından sterilize.
  13. Dön hazırlayın: 8 M üre, % 4 w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, % 10 v/v gliserol, distile su %0.02 w/v bromophenol olarak steril mavi.
  14. STE (güçlü TE) hazırlamak: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 distile su içinde. 0.2 µm steril filtreden bir steril şişe içine filtre.
  15. Zymolase hisse senedi çözüm hazırlamak: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM potasyum fosfat dibasic pH 7.5, % 50 v/v gliserol arabellekte steril distile su (-20 ° C'de depolanan).

2. klonlama ve yem plazmid doğrulanması

Not: Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı plazmid inşaatı. Şu anda piyasada bulunan ve akademik olarak kullanılabilir Y2H sistemleri çeşitli vardır. DEEPN protein DNA'ya bağlanıcı etki alanına erimiş ilgi ifade yem plazmid içinde TRP1koşuluyla bunların çoğu karşılamak-plazmid içeren. Diğer aşağı akım gereksinimleri olan sıra hemen akıntıya karşı av Kütüphanesi Ekle bilinir ve bu olumlu Y2H etkileşim His3 üretimini bırakmak için seçim histidin eksik medya tarafından attı. Burada biz yeni Y2H yem plazmid (pTEF-GBD, Şekil 2) nasıl kullanılacağını açıklar, ancak, pGBKT7 de dahil olmak üzere diğer Y2H yem plazmid de kullanılabilir. İnşaat ve yem plazmid değerlendirilmesi için pTEF-GBD kullanımı anlatacağız. Genel bir not olarak, iyi ifade ve klonlama ile kolaylığı sağlamak için Maya kodon önyargı'nin bir açık okuma çerçevesi üretmek için gen sentez öneririz. Klonlama düzeni Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı ile çerçeve ve 3' siteye klonlama zaman bir kodonu yem kodlama bölge izleyen olmak için yem sağlar emin olun.

  1. Plazmid vektör hazırlayın. Plazmid pTEF-GBD sağlar ilgi protein kodlama bir parçası klonlama için 5' ya da 3' bir hızlı derleme yöntemiyle Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı kodlama bölgesi. Ekleme 5' sitesinde, pTEF-GBD NarI ve EcoRI ile 3 µg sindirmek veya 3' sitesinde sokmak için BamHI ile sindirmek ve XhoI için 2-4 h. Electrophorese örnek % 1 DNA özel jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür (EtBr) 100 tüketim kesim 5,630 bp TEF-GBD ve üreticinin yönergelerine uygun olarak bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek spektrofotometre12nm.
    Not: Nesil yem kodlama ekler. Kodlama proteinler DNA parçaları veya protein parçaları ilgi gen sentezi kullanılarak yapılmış ve uncloned parçaları olarak kullanılabilir olabilir. Bu kodon Saccharomyces cerevisiae ifade için en iyileştirilmiş ve çevrimiçi araçlar kodon optimizasyonu için malzeme listesinde bulunan önerilir.
  2. 5' için ekleme, ATG başlama kodonu 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 tarafından kodlama DNA parçası kanattan 've 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', anılan sıraya göre. 3' Gal4 DNA bağlayıcı etki ile çerçeve için ekleme, kodlama parçası 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa tarafından -3 kanat 've 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Plazmid İnşaat için hızlı montaj üreticisinin yönergelerini belirtildiği gibi klonlama parçaları için kesilmiş pTEF GBD uymalısınız.
    1. Tüm E. coli LB-Kanr levhalar değiştirdi ve 16-20 h 37 ° C'de için kuluçkaya plaka PTEF-GBD istenen eklemek ile konut koloniler tarafından PCR güçlendirme oligonucleotides kullanarak belirlenebilir: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' ve 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' ekleme ve 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' ve 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' eklemek için. Bu oligonucleotides de ekleme sıralama için astar olarak hizmet verebilir.
    2. Planı hazırlanması üzerinde > her pTEF-GBD türev ve rahat sıralama ve Maya dönüşümleri malzeme sağlamak için pTEF-GBD 10 µg.
    3. Aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 3 dk 98 ° C'de 30 25 döngüsü tarafından takip 98 ° c, 30 s s 55 ° c ve 2 dk 72 ° C'de takip 2.5 mM MgCl2 içeren bir arabellek kullanarak 72 ° C'de 5 min tarafından , 0.5 U/100 µL DNA polimeraz ve özel tampon.

3. ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı Fusion proteinlerin

  1. Yetkili Maya olun.
    1. Çizgi PJ69-4A Maya YPD plaka üzerine dışarı 1 mm3 -80 ° c kazıma steril bir ahşap aplikatör alarak stok ve yavaşça YPD plaka arasında sürtünme donmuş. Ahşap aplikatör her geçişte medya yüzey el değmemiş bir parçası arasında gider plaka taşıyın. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. Donmuş hisse senedi PJ69-4A Maya Maya su veya büyüme medyada askıya alma, DMSO ile % 7 ilave ve-80 ° C'de depolayarak olun
    2. Bir koloni 5 ml steril bir ahşap aplikatör kullanarak bir 20 x 150 mm Kültür tüp YPD kültürünün aşılamak ve gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de büyür.
    3. YPD 50 mL steril Erlenmeyer şişesi bir 250 ml PJ69-4A Maya zorlanma gecede kültür 4 mL ile aşılamak. 30 ° C arasında için bir optik yoğunluk (OD600) 200 d/d, titreyen bir kuluçka standart 1 cm ışık yolu ile spectrophotometry tarafından belirlenen yaklaşık 1,2, büyümek. Büyüme genellikle 5-7 saat sürer.
    4. Maya sedimantasyon konik tüp 4696 x g benchtop santrifüj oda sıcaklığında 5 min için de bir 50 ml tarafından izole et. Süpernatant sıvı atık damping tarafından atmak. Bir pipet kullanarak, Pelet dönüştürme arabelleği ve transfer konik tüp 15 mL 5 ml resuspend. Süpernatant atmak ve dönüştürme arabelleği 1000 µL pipet ile son Hacim 1 ml Maya resuspend için Resediment.
    5. 200 devir / dakikada sallayarak süre Maya hücreleri 30 ° C'de 60 dk için kuluçkaya ve buz 30-90 dakika yerleştirin.
  2. Maya plazmid dönüşümü.
    1. 1.5 mL steril microcentrifuge Tüp, pTEF-GBD tabanlı plazmid 1 µg ve 5 µL 10 mg/mL somon sperm taşıyıcı DNA çözüm ekleyin. Ayrıca yalnızca somon sperm taşıyıcı DNA negatif dönüşümü kontrol olarak içeren bir tüp içerir. Buz gibi Maya hücre süspansiyon 100 µL pipet tarafından her tüp için ekleyin. %70 100 µL eklemek bir 1000 µL pipet ve karışımı yavaşça tarafından tüp 5 - 10 kat (yapmak değil girdap) flicking PEG çözümle.
    2. 200 devirde titreyen bir kuluçka için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya.
    3. 15 dakika 42 ° C'de Isı şok.
    4. Tortu 845 x g 3 dakika oda sıcaklığında, microcentrifuge içinde kapalı pipet ve süpernatant atmak, Pelet steril su 150 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve bir CSM-Trp plaka yüzey üzerine yayıldı.
    5. 30 ° C kuluçka makinesine plakaları sağ tarafında yukarı yerleştirin ve 2-3 kolonileri görünür hale gelene kadar gün kuluçkaya. Tabak baş aşağı kuluçka için 6-12 h 30 ° C'de sonra plaka yüzeyinde yoğunlaşma önlemek için açık olabilir.
    6. Steril bir kürdan kullanarak CSM-Trp plaka üzerine bir yama olarak dönüştürme ve çizgi başına 2-3 kolonileri alın. 30 ° C'de 24 h için büyümeye izin
  3. Lysates protein ifade için yapmak.
    1. CSM-Trp sıvı medya 3 mL maç kafa boyutlu Maya yama ile aşılamak ve gecede bir 20 x 150 mm Kültür tüp 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak süre büyür. İki gecede kültür boş pTEF-GBD vektör başı yem olun.
    2. 1 mL YPD CSM-Trp gecede kültür için her 3 mL ekleyin. 30 ° C'de 1 h için 200 devir / dakikada sallayarak süre büyümek. Hücre OD spektrofotometre tarafından kontrol edin.
    3. Tortu OD göre normalize hücreleri, aynı sayıda. Steril 1.5 mL microcentrifuge tüplerinin 2,348 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile kullanın. Bir pipet süpernatant iptal etmek için kullanın. Son stok 2.1 OD minimumda karşılık gelir.
      Not: eşdeğer hücre sayısı hesaplanırken, farklı birimlerde her gecede kültür en az 2.1 OD elde etmek için gerekli olabilir oluşabilir.
    4. Pelet 0.2 M NaOH 450 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Hücreler için 2 dk 2,348 x g oda sıcaklığında, recentrifuge ve süpernatant pipet tarafından atın.
    5. Pelet 50 µL dönüş arabelleği ile yukarı ve aşağı dikkatle kabarcıklar yapmak değil gibi pipetting tarafından resuspend. 70 ° C'de 5 min için ısı örnek
  4. Protein ifade SDS-sayfa tarafından kontrol edin.
    1. Kullanım bir degrade jel moleküler ağırlık geniş bir ürün yelpazesi sağlamak için % 4-20 çözülebilir. Yük eşit miktarda (aynı OD) örnekleri bir SDS-sayfa içine jel ve değiştirilmemiş pTEF-GBD vektör13,14,15içeren en az bir örnek eklemeyi unutmayın.
    2. Elektroforetik ayrılıktan sonra nitroselüloz ve anti-myc monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm (Şekil 3) kullanan immunoblot jel aktarın.

4. kendi kendine harekete geçirmek Test

  1. Steril bir ahşap aplikatör alarak, Maya az miktarda şişeyi dışarı kazıma ve YPD plaka üzerinde çizgiler faiz YPD plaka üzerine av Kütüphanesi konut zorlanma karşılık gelen-80 ° C stoktan çizgi MATalpha Maya dışarı. YPD plaka 30 ° C'de 2 gün veya tek kolonileri görünür hale gelene kadar kuluçkaya. YPD plaka üzerine bir kaç tek kolonileri yama ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
    Not: bazı uyumlu piyasada bulunan Y2H kütüphaneler Y187 içinde saklanır, ancak burada ev av kitaplığına geliştirilen yeni yük PLY5725 olduğunu.
  2. 3.3.1 - bölümündeki yordamları izleyin PLY5725 LEU2ile dönüştürmek için 3.3.4-plazmid istenen av kitaplığı barındırmak için kullanılan dayalı. Burada geliştirilen kitaplıkları için karşılık gelen plazmid pGal4AD olduğunu (pPL6343). Maya transformants, CSM-Leu araya geldi tabak tabağa kurtarmak için. Koloniler sonra ortaya çıkan, CSM-Leu araya geldi plaka üzerine yamalar olarak çizgi ve 30 ° C'de 24 h için kuluçkaya
  3. Anti boş vektör pPL6343 kullanarak ifade onaylamak için 3,4 protokolünde izleyin-HA monoklonal veya poliklonal antikorlar ve ECL algılama çözüm.
  4. Her PLY5725 ile çapraz desende dönüştürülmüş PJ69-4A Maya oluşturur çizgi YPD tabakta Protokolü Bölüm 3.4 ve 4.3 protein ifade etmek ve 30 ° C'de gecede kuluçkaya doğrulandı. Burada iki suşlar birlikte büyüdü ve üzerine yama hücre almak 1 mm3 ayrı CSM-Leu-bir araya geldi, CSM-Trp ve CSM-Trp-Leu plakaları ve 24 h büyümek.
    Not: İstenen diploitler CSM-Trp-Leu tabaklarda büyüyecek. CSM Leu met büyüme ve CSM-Trp tabak maya büyüme için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
  5. CSM-Trp-Leu medya gecede 30 ° C'de 1 ml diploitler büyümek 2,348 x g, bir microcentrifuge oda sıcaklığında 3 dk de tortu 500 µL hücreleri microcentrifuge 1,5 ml tüp. Süpernatant pipet tarafından atmak. 1 mL steril su hücrelerde resuspend ve sedimantasyon ve resuspension tekrarlayın. Hücre OD600 denetleyin.
  6. 1:10 bir dizi çoğu başlangıç ile steril su kullanarak her hücre süspansiyon, seri dilutions yapmak konsantre her 0,5 aşırı doz, çözüm. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka, CSM-Leu-Trp-O'nun bir tabak ve bir CSM üzerine 5 µL spot-Leu-Trp-onun + 3AT plaka. 30 ° C'de kuluçkaya ve büyüme için incelemek günlük 3 gün içinde (Şekil 4).
    Not: 1:10 için seri seyreltme, tüpün içine su 90 µL aşırı doz 0,5 içeren 10 µL pipet ve mix yukarı ve aşağı pipetting. Toplam altı farklı konsantrasyonlarda noktaya kadar seri dilutions 1:10 yapmaya devam.

5. yem ve av Kütüphane ile Maya nüfus oluşturma

Not: ticari av Kütüphane plazmid evler Y187 zorlanma iyi dostum değil. Bu nedenle, aşağıdaki en iyi duruma getirilmiş koşullar Kütüphane karmaşıklığı korumaları gerekmektedir. PLY5725 strain içeren Y2H av kitaplıkları arkadaşları daha iyi ve aynı çiftleşme prosedür-ebilmek var olmak kullanılmış bu türe (Şekil 5).

  1. Her biri çeşitli TRP1taşıyan PJ69-4A transformants kültürleri 3 mL aşılamak-pTEF-GBD yem plazmid CSM-Trp medya bir kültür tüp içeren. Yalnız yordam denetimi olarak hizmet etmek için pTEF-GBD vektör plazmid içeren iki ayrı kültür içerir. Kültürler 30 ° c, 200 rpm 6 h için kuluçkaya ve 25 mL steril bir Erlenmeyer şişesi gecede büyüme için kültür içine oranında seyreltin.
  2. LEU2içeren MATalpha hücreler dondurulmuş (-80 ° C) şişe tezcan-"av" Kütüphane, oda sıcaklığında taşıyor. CSM-Leu araya geldi medya ile tamamen çözülmüş flakon steril bir Erlenmeyer şişesi 125 mL aşılamak. Tüm kültürler gecede 30 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek.
    Not: Bir gecede kültür OD600 1.0-1.5 sonraki adımlara geçmeden önce arasındaki aralığı gerekiyor.
  3. 21 OD karşılıkları her 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin ile PJ69-4A transformant kültürlerin santrifüj kapasitesi. Her 10 reaksiyonlar çiftleşme için istenen, Pelet 39 OD600 eşdeğerleri büyük kütüphane plazmid konik tüpler ayrı 50 mL taşıyan MATalpha yük.
    1. 10 mL steril su hücrelerde ve yeniden cips yeni 50 ml konik tüp 4696 x g 5 dk benchtop santrifüj oda sıcaklığında resuspend. Bir pipet kullanarak, yavaşça süpernatant pelleted hücreleri aksatmadan çıkarın.
    2. Granül 4 mL PJ69-4A hücreleri ve PLY5725 hücre bYPDA (pH 3.7) 10 ml resuspend.
  4. Set-up çiftleşme reaksiyonlar, ekleyin 1 mL PJ69-4A hücreleri, MATalpha kitaplığı içeren hücre 1 mL ve 1 mL konik tüp yeni 50 ml bYPDA pH 3.7 dönüştürdü. Nazik yörünge ajitasyon (100-130 devir/dakika) 90 dk ile 30 ° C'de kuluçkaya.
    1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından kaldırmak ve Pelet 2 mL 1:1 bYPDA:YPD resuspend. 100 mm YPD levha üzerine tüm 2 mL pipet tarafından plaka ve yaklaşık 20 h 30 ° C'de kuluçkaya.
  5. Hücreleri 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak YPD plakaları hücrelerden hasat. 50 mL konik tüpün yerinden pipet hücrelere. 4 - 5 kere ile 2-3 mL CSM-Leu-Trp medya tabak 1000 µL kullanarak ortamın pipet yukarı pipetting ve yavaşça YPD plaka yüzeyi boyunca ortam çıkarma tarafından durulayın.
    1. Hücreler için bir benchtop santrifüj oda sıcaklığında 4696 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından atın ve 40 mL CSM-Leu-Trp medya hücrelerde (yapmak değil girdap yukarı ve aşağı) pipetting tarafından resuspend.
  6. Oluşan diploit hücre sayısını tahmin etmek için 200 µL ve 2000 µL CSM-Trp-Leu medya diploit karışımı 4 µL sulandırmak. Her seyreltme CSM-Leu-Trp plaka üzerine 200 µL plaka.
    Not: 1:10,000 ve 1:100,000 kat seyreltme hasat ve beklenen ~ 9.000-27.000 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde 36-40 h. için 30 ° C'de kuluçka sonra onay plakaları adımdan sonra 5,7 verimli diploitler stokunun iki tabak temsil ediyor. 200 koloniler 1:10,000 seyreltme plaka üzerinde en az sayıda adım 5,8 devam etmek için gerekli
  7. Hemen her 40 mL cep resuspension de geri kalanını al ve Erlenmeyer şişe 500 mL CSM-Leu-Trp medya içeren bir 1000 mL aşılamak. Bir ilk OD600al. Doygunluk (~2.0 OD/mL) ulaşana kadar 180 rpm'de sallayarak ile bu şişeler 30 ° C'de kuluçkaya. Bu genellikle yaklaşık 36-40 h. monitör büyüme 24 h sonra tekrar 36 h OD600tarafından alır.
  8. Bir pipet kullanarak her kültür ve innoculate Erlenmeyer şişeler, bir içeren 750 mL CSM-Leu-Trp medya ve ikinci içeren 750 mL CSM-Leu-Trp-O'nun 3AT en düşük düzeyi olan 2000 mL doymuş 500 mL aliquots 20 mL kaldırmak bu arka plan (daha önce belirlenen Bölüm 4.5) ortadan kaldırır. Yeni kültürler (770 mL) de dönen tarafından mix ve bir ilk OD600al.
  9. 30 ° C'de kültürler genellikle seçili olmayan CSM-Leu-Trp kültür için 24 saat içinde ortaya çıkar ve 70 h altında seçim Y2H etkileşimleri için kültürler için üzerinden alabilir doygunluk erişene dek 180 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
  10. Kültürler Doygunluk (OD ~ 2.0) alabilirseniz, 11 mL pipet, tortu 4696 x g oda sıcaklığında bir 5 dk spin hücrelerle kaldırmak, süpernatant pipet, atmak ve -20 ° C'de dondurmak veya DNA ekstraksiyon devam. Seçili ve seçili olmayan örnekleri her ikisi de derin sıralama için kullanılır.

6. numune hazırlama DEEPN derin sıralama için

  1. DNA ekstraksiyon.
    1. Hücre çökeltilerini Protokolü Bölüm 5,7 500 µL sTE arabellek ve transfer microcentrifuge tüp 1.5 mL resuspend için bir pipet kullanın. Betamercaptoethanol 3 µL ve Zymolase stokunun 10 µL ekleyin. Mix iyi ve 24-36 h 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
    2. İki kez 500 µL fenol/kloroform/izoamil alkol ile örnek bir duman hood16kullanırken ayıklayın.
    3. 4 M NaCl 7 µL, buz gibi % 100 etanol (alkol), mix INVERSION tarafından ve her iki donma sıcaklığı-20 ° C 900 µL ekleyin veya tortu DNA iplik 21,130 x g bir microcentrifuge oda sıcaklığında 10 dakika için de tarafından devam edin.
    4. Süpernatant pipet tarafından atmak. Pelet 900 µL % 70 ile üç kez yıkayın alkol.
    5. Tortu 21,130 x g 2 min için cips ve artık alkol yıkama tarafından pipet kaldırın. 7 dk. 42 ° C'de için kuru Pelet
    6. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 120 µL Pelet resuspend, her 30 dakikada karıştırmak için tüpler hafifçe vur.
    7. Ayıklanan DNA'ın 60 µL microcentrifuge tüp steril bir 1,5 mL pipet. STE, 3,5 µL RNase A stok, mix ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya flick 120 µL ekleyin.
    8. Daha önce bölümü 6.1.3 - 6.1.5, yaptığımız etanol çökelti ama 4 M NaCl yerine 5 M amonyum asetat 7 µL kullanın.
    9. 0.1 x sTE için 90 dk 37 ° C su banyosunda 55 µL RNase A tedavi DNA resuspend, 260 absorbans tarafından her 30 dk. miktarını DNA karıştırmak için tüpler fiske nm bir spektrofotometre üzerinde.
  2. PCR cDNA ekler.
    1. İki DNA örneği başına 50 µL PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Her reaksiyon 25 pmol av-Kütüphane plazmid eşleşen her ileriye ve geriye doğru astar içerir (malzemeleri görmek). Reaksiyonlar da High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, DNA örneği, 5 µg 25 µL içerir ve en fazla 50 µL. genişletme reaksiyonlar uzantısı kez 3 dk 72 ° c, anneal sıcaklık 30 55 ° c ile 25 devir için su s ve 10 s. Precede için 98 ° C'de denaturing Bisiklete binme bir 30 s denatürasyon 98 ° C ve takip ile 72 ° C'de 5 dk kuluçka tarafından
    2. 4 analiz µL % 1 DNA özel jel elektroforez ile DNA özel tarafından her PCR reaksiyon jel içeren 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr17. DNA örneği tarafından UV transillumination gözünün önüne getir. Örnekleri DNA yaklaşık 1-3 kb, bantlama deseni örnekleri için Y2H etkileşim neredeydi bulunduğu bir smear (Şekil 6) seçili gösterir.
    3. Yinelenen PCR örnekleri birleştirmek ve üreticinin yönergelerine uygun olarak PCR arıtma seti kullanarak arındırmak ve 260 absorbans tarafından DNA ölçmek nm bir spektrofotometre üzerinde.

7. derin sıralama

Not: Numune hazırlama ve sıralamanın bir derin sıralama platformda genellikle ticari ve akademik DNA sıralama çekirdek tesislerde kullanılabilir.

  1. Yamultma 600 ng bir ortalama uzunluğu ~ 300 fragments vermek için bir yüksek performanslı ultra-sonicator kullanarak PCR ürününün bp.
  2. Barkodlar, kodlama bağlayıcı siteleri, priming ekler derin sıralama için bir hazırlık seti kullanarak Dizin oluşturulmuş sıralama kitaplıkları oluşturmak ve dizileri asimetrik olarak DNA parçalarının uçlarını yakalamak.
  3. Kütüphane hazırlık üretici yönergelerine göre gerçekleştirin. Havuzu kütüphaneler ve dizi uzun eşleştirilmiş uç okuma bir derin sıralama platformda (Örneğin, 2 x 150 bp PE okuma) olarak dizine. 10 ve daha fazla okuma genellikle daha karmaşık seçili olmayan nüfus için istenen ile 40 milyon arasında istenen okuma sayısı, her örnek için hedef olduğunu. Seçili olmayan nüfus için en az 20 milyon veya daha fazla okuma öneririz.

8. Bioinformatic işleme ve doğrulama

  1. Tek başına yazılım programları (1) sıra eşlemek için inşa dosyaları bir evrensel SAM biçiminde (2) ölçmek okumak bir dizi ile fastq formundaki verileri sıralama işlemi DNA gen zenginleştirme arasında veri (3) verileri istatistiksel analizi gerçekleştirmek hangi aday gen sıralaması için sipariş Y2H etkileşim () 4 olumlu) ne region(s) ve ne translasyonel çerçevesinde her av cDNA gen başına bu parçaları oluşur etkileşimler vardır olumlu Y2H verim bilgi ve (5) sağlamak sağlamak sadece 5' aynı zamanda onların yeniden yapılanma ve doğrulama geleneksel bir Y2H biçimde izin etkileşen parçaları 3' sonunda yeniden oluşturmak için araçlar. Bu programların çalışması eşlik eden çalışmada detaylı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Y2H tahlil protein: protein etkileşimleri bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır ve çeşitli uyarlamalar ve sistemleri geliştirilmiştir. Çoğunlukla, bu önceki yaklaşımlar ile başarı sağlamak aynı konuları DEEPN için önemlidir. Bazı önemli kriterler şunlardır: Füzyon protein, sahte düşük bir arka plan onun + ilgi bir boş av plazmid, yem yüksek bir çiftleşme verimliliği ile yem içeren diploitler artış sağlanması ifade DNA'ya bağlanıcı etki alanının sağlanması MATA Maya ile Kütüphane içer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada bir rehber en iyi duruma getirilmiş yöntemleri kullanarak toplu iş iş işlemde Y2H deneyleri gerçekleştirmeye ilişkin sağlamak. Halkın seçimi altında gelebileceğini söyledi Maya başlangıç Kütüphane temsilcisidir ve yeterli başlangıç Maya nüfusun bu değişkenliği sınırlamak için seçim geçmesi için kullanılan emin olmak için yordamda birkaç kritik adım vardır . Önemlisi, bu kriterler geleneksel bir Y2H yöntemi, böylece bu yaklaşım çoğu laboratuvarlar için standart moleküler biyoloji donatılmış erişilebilir yapmak için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

Biz personel içinde Enstitüsü, insan genetiği NGS Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Einat Snir genomik Kütüphanesi parçaları burada yapılan Y2H plazmid Kütüphane için hazırlarken onun uzmanlık alanı için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir: NIH R21 EB021870-01A1 ve NSF araştırma projesi hibe: 1517110.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler




Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Illumina HiSeq 4000Illuminaderin dizileme platformu
Monoklonal anti-HA antikorlarıBiolegend901514pGal4AD'de HA ekspresyonunu tespit etmek için Primer Antikor
Poliklonal anti-myc antikorlarıoluşturur QED Biosciences Inc18826pTEF-GBD yapılarında MYC ekspresyonunu tespit etmek için Primer Antikor,
NarINew England BioLabsyaparR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Polietilen Glikol 3350, tozJT BakerU2211-08
50-948-286 tarafından satılanSomon Sperm DNATrevigen, Incmaya transformasyonu için taşıyıcı DNA, bölüm 3.2.1.
Kanamisin MonosülfatAraştırma Ürünleri UluslararasıK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
Sodyum KlorürAraştırma Ürünleri UluslararasıS23025
TriptonAraştırma Ürünleri UluslararasıT60060
D-SorbitolAraştırma Ürünleri UluslararasıS23080
Lityum Asetat DihidratMP Biyomedikal155256
Kalsiyum KlorürThermoFisherC79
EDTA Sodyum TuzuAraştırma Ürünleri UluslararasıE57020
Maya Özü TozuAraştırma Ürünleri UluslararasıY20020
Maya Azot Baz (amonyum sülfat) amino asitlerolmadanAraştırma Ürünleri UluslararasıY20040
CSM-Trp-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-Trp-MetBio 101, Inc4520-922
L-MetioninFormediumDOC0168
AdeninAraştırma Ürünleri UluslararasıA11500
D-(+)-GlikozAraştırma Ürünleri UluslararasıG32045
Bacto AgarBD214010bölüm 1'de ortam plakaları yapmak için kullanılır
PeptonAraştırma Ürünleri UluslararasıP20240
3-amino-1,2,4 TriazolSigmaA8056
2- Merkaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiolojikZ1004
Potasyum fosfat dibazikSigmaP8281
Fenol: Kloroform: IAAAmbionAM9732
Amonyum AsetatSigma-Aldrich238074
EtanolDecon Laboratuvarları, INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
Üre AraştırmaÜrünleri UluslararasıU20200
SDSAraştırma Ürünleri UluslararasıL22010
gliserolSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
bromofenol mavisiAmresco449
Gibson Montaj Klonlama KitiNew England BiolabsE5510SBölüm 2'de plazmitlerin klonlanması için hızlı montaj yöntemi
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SBölüm 2.3'te Gibson Montajı için ürünlerin amplifikasyonu ve ayrıca bölüm 6.2.1'de DEEPN derin dizilimi için numune hazırlama için kullanılır
Etidyum BromürAmresco0492-5G
QIAquick PCR saflaştırma kitiQiagen28104Bölüm 6.2.3'te pcr ürünlerinin saflaştırılması için kullanılır
Qiaquick DNA Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Bölüm 2.1'de sindirilmiş pTEF-GBD'nin saflaştırılması için kullanılır
KAPA Hiper Hazırlık kitiDerin dizileme içinKAPABiosystems KK8500
Kodon optimizasyonuhttp://www.jcat.de
gBlocks
Dizeler2.2'de klonlama için kullanılanThermofisher
GenCatch Plazmid DNA mini hazırlık KitiEPOCH Yaşam BilimleriBölüm 2.3'te DNA miktarlarını hazırlamak için kullanılır
Covaris E220Covarisyüksek performanslı ultrasonikatör bölüm 7
oligo nucelotide 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Plazmid yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılanentegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Plazmid yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılanentegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Entegre DNA Teknolojileri veya ThermofisherPlazmid yapımı sırasında 3' insert pTEF-GBD
oligo nucelotide 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Plazmit yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılanentegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
ekleyin oligonükleotid 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		insert amplifikasyonu için kullanılanentegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
insert amplifikasyonu için kullanılanentegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
suşunun insert amplifikasyonu için kullanılanEntegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher
. GENETİK 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA bağlayıcı doimain ekspresyon plazmid
pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper LabGal4-aktivasyon alanı ekspresyonu plazmid
100 mm petri kaplarıKord-Vallmark VWR2900
125 mL PYREX Erlenmeyer şişesiFisher ScientificS63270
250 mL PYREX Erlenmeyer şişesiFisher ScientificS63271
1.000 mL PYREX Erlenmeyer şişesiFisher ScientificS63274
2.000 mL PYREX Erlenmeyer şişesiFisher ScientificS63275
20 X 150 mm Tek Kullanımlık KültürTüpü Thermofisher14-961-33
pipet yardımcısıDrummond4-000-100
5 mL Serolojik PipetDenvilleP7127
10 mL Serolojik PipetDenvilleP7128
25 mL Serolojik PipetDenvilleP7129
1.000 mL PYREX GriffinBeher Fisher Scientific02-540P
1.000 mL PYREX Yeniden Kullanılabilir Medya DepolamaŞişesi Fisher Scientific06-414-1D
1.000 mL dereceli silindirFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Hücrelerin Optik Yoğunluğunu ölçmek için kullanılanMoleküler Cihazlar
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000DNA Elektronik UV miktarını ölçmek için kullanılan spektrofotometre
transilluminatorUltra LumMEB 20bir Etidyum Bromür agaroz jelinde DNA'yı görselleştirmek için kullanılır
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 ve mikro; L Düşük Tutma Pipet UçlarıGeneMateP-1236-1250
200 & LLow Tutma Pipet UçlarıVWR10017-044
10 & L XL Düşük Tutmalı Pipet UçlarıVWR10017-042
50 mL konik boruVWR490001-627
15 mL konik boruVWR490001-621
hücre sıyırıcıDenville ScientificTC9310
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpleriABD Bilimsel1615-5500
HClFluka Analitik318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Ahşap aplikatörlerSolon Care55900
Eppendorf mikrosantrifüj 5424Fisher Scientific05-400-005mikrosantrifüj
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381tezgah üstü santrifüj
Amersham ECL Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (eşekten itibaren)GE Sağlık HizmetleriNA934-1MLİkincil Antikor
Amersham ECL Fare IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (koyundan)GE HealthcareNA931-1MLİkincil Antikor
SuperSignal West Pico Kemilüminesan YüzeyThermo Fisher Scientific34080ECL algılama çözümü
Isotemp İnkübatörThermo Fisher Bilimselİnkübatör
Mutitron 2INFORS HTÇalkalama inkübatörü
Isotemp Dijital Kontrollü Su Banyosu Model 205Fisher Scientificsu banyosu
Y2H fare cDNA kitaplığı Y187 (tava dokusu)Clontech630482ticari olarak temin edilebilen cDNA Kitaplığı
Y2H fare cDNA kitaplığı Y187'de (fare beyni)Clontech630488ticari olarak temin edilebilen cDNA Kitaplığı
pGADT7 AD VektörüClontech630442birçok cDNA kitaplığını barındıran ticari olarak temin edilebilen AD Vektörü
pGBKT7 DNA-BD VektörüClontech630443ticari olarak temin edilebilen DNA-BD Vektör
Biolaz DNA PolimerazBiolineBIO-21042Bölüm 2.4 için kullanılan DNA polimeraz
GeneMate GCL-60 Termal DöngüleyiciBioExpressP-6050-60pcr makinesi
TempAssure 0.5 mL PCR tüpleriABD Bilimsel1405-8100
, Fisher Scientific DNA agaroz jelleri yapmak için kullanılan hazırlık kiti https://www.idtdna.com/CodonOpt kodon optimizasyonu Entegre DNA Teknolojileri Bölüm 2.2'de klonlama için kullanılan DNA parçaları Bölüm DNA parçaları 5 5Pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılan pTEF-GBDpGAL4AD oligonükleotid 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'ün 5' PimerpGAL4AD oligonükleotid 5'-ACCCAAGCA> GTGGTATCAACG-3'ün insert amplifikasyonu için kullanılan 3' PimerpGADT7 oligonükleotid 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'ün 5' PimerJames P, Halladay J, Craig EA: Genomik Kütüphaneler ve mayada yüksek verimli iki hibrit seçim için tasarlanmış bir konakçı suş http://depts.washington.edu/yeastrc/ pGADT7 PJ69-4A MatA maya 3' Pimer tarafından satılmaktadır,

Kaynaklar

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Protein Etkile imleriDEEPN Y ntemiDerin SekanslamaYem Plazmid Konstr ksiyonuAv K t phanesi Haz rlMaya iftle me ReaksiyonlarDNA Ekstraksiyon ProtokolPCR AmplifikasyonuBiyoenformatik leme
Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.