Decellularization ve Recellularization metodoloji insan safen damarlar için

Summary

Burada, deterjanlar ve recellularization tarafından periferik kan ve endotel orta perfüzyon kullanarak safen ven decellularization için bir protokol açıklayın.

Abstract

Vasküler kanalların çoğu vasküler cerrahi sırasında kullanılan kez immünosupresyon ve zavallı a_ılabilinirse neden komplikasyonlara yol allojenik veya sentetik Greftler vardır. Doku mühendisliği doğal hücre dışı matriks decellularization ve recellularization yöntemini kullanarak alıcının hücreleri içeren kişiselleştirilmiş Greftler oluşturmak için yeni bir çözüm sunuyor. Biz insan safen ven ve recellularization decellularization periferik kan perfüzyon tarafından gerçekleştirmek için detaylı bir yöntemi gösterir. Ven ventriküler 1 oranında decellularized Triton X-100, % 1'tri-n-butil-fosfat (TnBP) ve 2.000 Kunitz birimleri deoksiribonükleaz (DNaz). DNaz 10 mL/dk 4 h için 37 ° C'de periosteum iken Triton X-100 ve TnBP 35 mL/dk 4 h için derin. Ven Ultrasaf Su ve PBS yıkanmış ve % 0.1 Perasetik asit sterilize edilmiştir. Tekrar PBS içinde yıkanmış ve endotel ortamda preconditioned. Damar bir biyoreaktör bağlı ve periosteum ile endotel orta 50 IU/mL içeren doldurmak biyoreaktör taze kan ile Steen çözüm seyreltilmiş 1:1 ve endokrin bezi kaynaklı eklemek için 1 h. Recellularization heparin gerçekleştirildi vasküler endotelyal büyüme faktörleri (80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörleri (4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL). Biyoreaktör sonra bir kuluçka taşındı ve glikoz 3-9 mmol/l arasında koruyarak 2 mL/dk 48 h için derin Daha sonra damar endotel orta ile dolu ve PBS ile yıkanmış kuluçka 96 h için derin. Triton X-100, TnBP ve DNaz ile tedavi 5 döngülerle safen ven decellularized. Decellularized ven normal ve recellularized damarlar (ışık kırmızı) aksine beyaz baktım. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama çekirdeği varlığı sadece normal ama decellularized damarlar gösterdi. Recellularized şekilde, H & E boyama ven luminal yüzeyinde hücreleri varlığını gösterdi.

Introduction

Vasküler kanallar gibi anevrizma, karotid arter stenoz ve ateroskleroz ciddi vasküler sorunlar için önde gelen birkaç klinik koşulları için gereklidir. Cerrahlar otolog, allojeneik veya sentetik vasküler kanallar fonksiyonel kan akımı geri yüklemek için kullanın. Otolog kan damarları kullanımı hala ideal yaklaşım olarak kabul rağmen hastalarda oldukça sınırlı olduğunu. Allojenik veya sentetik Greftler gibi alternatifleri immünsüpresif tedaviler ve zavallı açıklık reoperation^1,2önemli sağlık ülkelere ekonomik yükleri kaynaklanan, önde gelen derin sorunları var. Doku mühendisliği kan damarlarının doğal Homoloji ve otolog hücrelerin Greftler sunmayı amaçlamaktadır. Böylece, alıcı bağışıklık sistemi transplante greft kendini olarak tanır ve böyle bir greft doğal proteinler ve özgün yapılandırmayı hücrelerde içerdiğinden, daha iyi geçerli alternatifleri ile karşılaştırıldığında işlev. Mesane³, üretra⁴, nefes borusu⁵ve damarlar^6,7, başarıyla klinikte kullanılmış gibi doku organları, mühendislik.

Kişiselleştirilmiş Greftler üretmek için doku mühendisliği bir greft decellularization ve recellularization ardından bir donörden gerektirir. Decellularization hücreleri doku ve organların^8,9,10' dan kaldırmak için umut verici bir teknolojidir. Decellularization belirli fiziksel, kimyasal ve enzimatik Yöntemler¹¹ veya bunları birleştirerek tarafından gerçekleştirilebilir. Bu yöntemlerin en uygun kullanımı decellularized dokularda benzer yapısal ve işlevsel proteinler bir hücre dışı matriks yerli dokulara benzer olabilir. Böyle organları eki, geçiş, yayılması ve gelen kök hücre farklılaşma geliştirmek iç kapasitesine sahip.

Recellularization hücre greft tohum dinamik bir süreçtir ve alıcı kök hücre klinik ekimi için kullanılabilir. Şu anda bu tür amaçlar için kullanılan kök hücreler kemik iliği, mezenkimal ve organ sakinleri^3,5,6içerir. Hayvan ve araştırma odaklı çalışmalar fetal ve indüklenmiş pluripotent^12,13,14vardır mezenkimal kökenli kök hücrelerden kullandık. Bu işlem bir biyoreaktör (damarı tutar ve sıcaklık, gazlar, pH ve basınç gibi gerekli koşulları sağlayan bir odası) gerektirir hücreleri ve Kültür medya. Recellularization mücadelesine hücreleri belirli bir türü ve hangi tarafından bütün doku veya organ hücreleri ulaşabilirsiniz tohum bir strateji gerekli sayıda elde etmektir. Rağmen hiçbir tam doku veya organ yapısal ve işlevsel olarak yapılmış oluşturulan ve şimdiye kadar birkaç gelişmeler alan ve ilk sonuçları gelecekteki olasılığı¹⁵göster değerlendirildi. Ven tuşu fonksiyonu iltihabi hücre infiltrasyonu doku ve daralma içinde yardımcı olur ve kan basıncı¹⁶tutmak için güç sağlar orta düz kas katmanı içine denetler luminal endotel yatıyor. Çalışmalar sırasında hasar, anastomoz veya dolaşan endotelyal progenitor hücreler (EPCs) kan^17,18,19endothelialization oluştuğunu göstermiştir. Bizim strateji recellularization damarlar için kan dolaşan mevcut EPCs kullanır.

Doku mühendisliği damarları ve arterler farklı decellularization recellularization stratejileri^20,ve²¹takip çeşitli gruplar tarafından gerçekleştirildi. Grubumuz aynı zamanda gerçekleştirilen ve iliak ve meme damarlar^6,7için decellularization ve recellularization stratejiler geliştirdi. Decellularization Triton X-100, tri-n-butil fosfat (TnBP) ve enzim deoksiribonükleaz (DNaz) damarda ajitasyon tarafından gerçekleştirildi. Recellularization kemik iliği türetilmiş endotel ve düz kas hücreleri⁶ veya periferik kan⁷kullanılarak gerçekleştirildi. Ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı^6,7ile fonksiyonel kan akımı pediatrik hastalarda ekiminde sağlanmasında klinik vaat iki protokolü tarafından damarları recellularized.

Biz şu anda küçük çaplı damarlar decellularization, recellularization ve biyoreaktör işlenmesi kolay ve geliştirilmiş performans için aynı iletişim kuralını değiştirilmiş bir versiyonu geliştirdik. Geçerli decellularization iletişim kuralı deterjanlar ajitasyon deterjanlar ile yerine basınç uygulayarak ven yoluyla perfüzyon gerekli. Recellularization Protokolü Önkoşullanma hücre adezyon ve ek hücre adezyon, hayatta kalma ve yayılmasını önleme geliştirmek için kan dolaşan içinde büyüme faktörlerinin artırmak için ek bir adım içerir. Piyasada bulunan ürünleri kullanarak Biyoreaktör Tasarımı da iyileştirilmiştir. Bu yazıda, biz decellularization ve recellularization insan safen damar gerçekleştirmek için değiştirilmiş bir protokol ayrıntılı bir açıklama mevcut.

Protocol

Doku kullanılan ve bu kağıt Protokolü Göteborg Üniversitesi etik kuralları izler.

1. doku hazırlık ve depolama

1. Cerrahi forseps ve makas kullanarak alınan safen ven çevre dokudan kesin.
   Not: Safen ven insanlar alt ekstremite damar cerrahları tarafından disseke. Bu yazıda kullanılan safen ven bypass cerrahisi sonra un kullanılan bir parçasıdır.
2. Perfüzyon sırasında kaçağı önlemek için kendi amaçları dikişler ve forseps ile tüm yan şubelerinde ligate.
3. Ven fosfat tampon salin (PBS) 40 mL içeren bir 50 mL tüp içinde tutun. Ven aşırı kan kaldırmak için PBS 2 - 3 kez değişiklik yaparak yıkayın. Ven-80 ° C'de dondurarak saklamak

2. Decellularization kurulumları ve Recellularization biyoreaktör hazırlanması

Not: makas kullanarak, Tablo 1' de gösterildiği gibi silikon tüpler kesti.

1. Decellularization kurulumu 1 (Triton X-100 perfüzyon ve yıkama)
   1. Bir 2 L (plastik küvet) odası, tüp Şekil 1A' gösterildiği gibi A tüm üç adet bant.
      Not: teyp nerede odası (deterjan'ın giriş) alt kenarına dokunur bir duvar için bir tüp ve diğer iki tüp ven uzunluğuna bağlı olarak 5-10 cm arasında bir mesafe ile karşı duvara. En az 5 cm Bu tüpler de odası 's yere (damar'ın giriş ve çıkış) bantlanmış.
   2. Erkek ve dişi radarı bağlayıcılar, kullanarak bağlan serisinde tüp için tüp B F, tüp C tüp tarafından takip deterjan'ın giriş ve sonunda damar giriş için. Yer ve peristaltik kaset tüpüne F ben pompa.
   3. Başka bir tüp C al ve bir ucunu damar'ın prize bağlayın. Diğer ucunu 45 cm (deterjan çıkış) odası yerleştirilir alt hortum çıkış ile cam kavanoza yerleştirin ve güvenliğini sağlamak için Kaydet. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış itmek ve diğer ucunu ven odanın içine yerleştirin.
      Not: Tüm kurulum (kırmızı oklar), odası ve akış yönünü (beyaz ok) resimlerini Şekil 1Aile gösterilir.
2. Decellularization kurulum 2 (için TnBP perfüzyon)
   1. 1 L cam sürahi alıp tüp jar'ın alt dokunuyor kadar tüp C (deterjan giriş) bir ucunu kavanoza yerleştirin.
   2. Tüp F tüp tarafından C. yer tüp C diğer ucunu kavanozun içine yarım Derinlik (damar'ın giriş) kadar takip için diğer ucunu bağlayın. Tüp F peristaltik pompa kaset yerleştirin ben.
   3. Tüp D alın ve bir ucu kavanoza (damar'ın çıkış) yarım derinlik ve diğer ucunu cam kavanoza kadar damar'ın giriş (deterjan çıkış) 45 cm yükseklikten yer alt hortumu ile yerleştirin. Güvenliğini sağlamak için deterjan'ın giriş ve çıkış boruları teyp.
   4. 1 L cam sürahi bir manyetik karıştırıcı yerleştirin ve mıknatıs şişe içinde tutmak.
   5. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış üzerine itmek ve diğer ucunu 1 L cam sürahi yerleştirin.
      Not: Resim tam kurulumu (kırmızı oklar), Şekil 1Badımında odası ve akış yönünü (beyaz ok) gösterilir.
3. Decellularization Kur 3 (için DNaz perfüzyon)
   1. 250 mL Cam şişe alın ve her iki ucunda da tüp C. yer tüp ortasındaki alanı peristaltik pompa II kaset yerleştirin.
      Not: Tüp bir ucunu çözüm giriş ve tüp diğer ucunu damar'ın koya bağlı. Damar'ın çıkış çözümde serbest bırakılır.
   2. Pompa 37 ° C'de dahil olmak üzere tüm kurulum yerleştirin Kurulumu tamamlamak ve akış yönünde resmi Şekil 1 ciçinde gösterilir.
4. Recellularization biyoreaktör
   1. Tüm parçaları Şekil 2Agösterildiği gibi hazır tutun.
   2. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi 4-port kapağını ve her bağlantı noktasına takın, H (damar'ın çıkış) Tüp, tüp ben (medya giriş) ve J (damar'ın giriş) tüp. Tüp H diğer ucunu (medya çıkış) 4^th bağlantı noktasına bağlayın.
      Not: 4-port kapağı üstten görünüm Şekil 2Ciçinde gösterilir. Tüpler, sivri bir makas ile kenarları kesilmiş kolay ekleme için.
   3. Diğer ucunu ise tüp J U şekle viraj ve dikiş ile kravat. Azalan bakiyeli bağlayıcılar tüpler H & J. iç ucuna bağlayın
   4. 60 mL tüp düz taban ile 250 mL Cam şişe içine yerleştirin ve yukarıda yapılan Kur Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi tüp içine yerleştirin. Şekil 2Eiçinde gösterildiği gibi tüplerde K, E ve K serisi bağlayın. Bir tüp K damar'ın giriş ve medya giriş için başka bir tüp K bağlayın.
      Not: Kurulum ve akış yönü Şematik diyagramı Şekil 2Fiçinde görülür.
   5. Biyoreaktör tarafından ısıyla sterilize.

3. hazırlık çözümleri

1. Çözüm 1 (10 x su): için 1 L Ultrasaf Su, 2 g sodyum azid ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 18.6 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın.
2. Çözüm 2 (1 x su): 100 mL çözeltisi 1 alın ve 900 mL ultrasaf su ekleyin.
3. Çözüm 3 (Triton X-100 x 5): Triton X-100 50 mL, 1 g sodyum azid ve 9.3 g EDTA Ultrasaf Su 950 mL için ekleyin. Eriyene kadar karıştırın.
4. Çözüm 4 (Triton X-100 x 1): 200 mL çözüm 3 alın ve 800 mL ultrasaf su ekleyin.
5. Çözüm 5 (1 x TnBP): TnBP 10 mL 10 mL pipet ile çözüm 2 990 mL için ekleyin.
6. Çözüm 6 (40 Kunitz adet/mL DNaz): DNaseI, 2.000 Kunitz eklemek biriminde Dulbecco'nın fosfat tampon CaCl₂ ve MgCl₂içeren serum 50 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.
7. Çözüm 7 (PBS): 24 g sodyum klorür, potasyum klorür 0.6 g, 4,32 g sodyum fosfat ve potasyum fosfat 0,72 g için 3 L ultrasaf su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın. PH 7.4 için ayarlayın. 1 litre PBS Otoklav içinde sterilize ve ayrı ayrı saklayın.
8. Çözüm 8 (% 0,1 Perasetik asit): 50 mL steril çözüm 7, 50 µL Perasetik asit ekleyin. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.

4. endotel orta hazırlanması

1. L-glutamine, 5 mL 5 mL anti-anti, insan AB serumu 50 mL ve 500 ml steril bir başlık altında MCDB131 orta fetal Sığır serum dışında EGM-2 büyüme faktörü kitinin tüm bileşenleri de ekleyin.

5. safen ven decellularization

1. İnsan safen ven-80 ° c oda sıcaklığında erimek. Tekrar-80 ° C'de donmasına ve yine oda sıcaklığında erimek.
2. Biyopsi makas kullanarak 2 mm uzunlukta Kes ve formaldehit oda sıcaklığında 24-48 h için düzeltin. Damar dikiş ile erkek ve dişi radarı bağlayıcı barbs için her iki ucuna bağla.
3. Ven decellularization Kur 1 bağlanmak ve çözüm 2 1 litre doldurun. 15 dk 35 mL/dak., boş için kurulum içeriğini sıvı.
4. Çözüm 4 1 litre ekleyin ve 4 35 mL/dak. s kurulum içeriğini boşaltmak için sıvı.
5. Çözüm 2 500 mL ekleyin ve 5 dk. boş için kurulum içeriğini sıvı. Bu adımı yineleyin. Ven perfüzyon kurulumundan 1 çıkarıp perfüzyon kurulum 2 takın.
6. Çözüm 5 1 litre ekleyin, karıştırıcı üzerinde açmak ve 35 mL/dk 4 h için sıvı.
   Not: Çözüm 5 dönüm karıştırıcı ve perfüzyon boyunca sonra bulanık.
7. Ven perfüzyon kurulumundan 2 kesin ve 5-10dk Ultrasaf Su 4 değişiklikleri damar'ın iç ve dış şırınga veya 10 mL pipet ile yıkayın.
8. Perfüzyon Kur 3 damar bağlanmak, çözüm 6 50 mL ekleyin ve 10 mL/dk 37 ° C odasında 4 h kurulum içeriğini boş ve damar kurulumundan kesmek için sıvı.
9. Ven perfüzyon Kur 1 bağlanmak, çözüm 2 1 litre doldurmak ve gecede 35 mL/dak. tekrarlamak adım 5.4 ile adım 5,9 4 kez (için toplam 5 döngüleri), sıvı. Adım 5.2 belirtildiği gibi tekrar biyopsi alın.
   Not: Atla adım 5.8 ikinci bölümü döngülerle 1 ve 3.
10. Belgili tanımlık tertibat içeriğini temizleyin. Çözüm 2 1 litre doldurun ve sıvı 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için 2'den sonra 12 h. Kur içeriğini temizleyin. 1 L ultrasaf su doldurun ve 35 mL/dak değişiklik Ultrasaf Su 24 h için kurulum içeriğini sonra 12 h.Empty sıvı. Çözüm 7 1 L doldurun ve sonra 12 saat 7 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için sıvı.

6. Decellularization doğrulanması

1. Biyopsi standart protokolleri takip bir doku işlemci işlem 15 dakika süreyle Ultrasaf Su sabit formalin yıkayın ve parafin²²embed.
2. Bir microtome kullanma 5 µm bölümlerine kesmek ve leke Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin (H & E) ile aşağıdaki standart protokolleri²².
3. Çekirdekler için normal doku karşılaştırıldığında decellularized doku kaybı olup olmadığını denetlemek için mikroskop altında görüntüleyin.

7. recellularization

1. Ven çözüm 8 50 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirerek sterilize. Shaker 37 ° C'de 1 h için (devir/dakika) dakikada 80 rotasyonlar, kışkırtmak
2. Laminar akış (SMD) andan itibaren kısırlık korumak için kabin altında ven başa. 50 mL steril çözüm 7 ve 500 µL anti-anti, içeren yeni bir 50 mL tüp için steril forseps kullanarak ven aktarın. Yukarıdaki gibi 12 h. değişiklik çözüm 7 en az iki kez arasında için tahrik.
3. Steril forseps kullanarak, yeni bir 50 mL tüp ven aktarmak ve endotel medya 50 mL ekleyin. Yukarıdaki gibi 11 h için tahrik.
4. SMD Kabin altında steril eldiven kullanarak biyoreaktör bir araya getirin. Ven biyoreaktör'ın damar giriş ve çıkış steril dikiş ve forseps ile için kravat.
5. Ven biyoreaktör ve dolgu aynı orta ile bağlayın. 50 IU/mL heparin ekleyin ve 2 mL/dk 37 ° c 1 h için sıvı
6. Heparin kaplı tüp tüpler donörden 15-25 mL taze kan (bağlı olarak damar'ın uzunluğu) toplamak ve Steen çözüm ile 1:1 oranında seyreltin. Daha sonra endokrin bezi kaynaklı vasküler endotelyal büyüme faktörü (EG-VEGF, 80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-b, 4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL) ekleyin.
7. 37 ° C kuluçka %5 CO₂ biyoreaktör taşımak ve 2 mL/dk 48 h için sıvı.
8. Yaklaşık 12 h sonra biyoreaktör bir LAF dolap, hareket bir damla kan al ve kullanarak izleme cihazı bir kan şekeri glukoz ölçümü. Düzeyi daha az 3 mmol/L ise, glikoz getirmek için eklemek 7-9 mmol/l yineleme aralığı içinde bu adım her 8-12 h.
9. 48 h sonra biyoreaktör LAF kabin taşımak ve biyoreaktör kandan drenaj. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. drenaj çözüm sıvı. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. tekrar iki kez veya kan kırmızı renk kaybolur kadar sıvı.
   Not: Hücre ek doğrulama için biyopsi alınabilir. Damarı kesmek, ven 5 mm kenarları makasla kesmek ve onları atın. 5.2. adımda belirtildiği gibi bir biyopsi almak ve damar yeniden biyoreaktör (isteğe bağlı adım) bağlanın.
10. Endotel orta 30-45 mL ekleyin ve 2 mL/dk kuluçka 96 h için sıvı.
    Not: endotel orta damarı batık kadar ekleyin.
11. Biyoreaktör LAF kabinin taşımak, recellularized damar bağlantısını kesin, makas kullanarak ven 5 mm kenarları kesilmiş ve atmak. Biyopsi 5.2. adımda belirtilen şekilde alın.

8. Recellularization doğrulanması

1. 6 bölümündeki yönergeleri izleyin ve H & E boyama gerçekleştirmek. Slaytları hücrelerin varlığı için mikroskop altında incelemek.

Results

Normal bir damar brüt morfolojisi ışıktır kırmızı (Şekil 3A). Kırmızı renk ilerici decellularization döngülerle kaybolur (döngüsü 2, Şekil 3B; 3, döngüsü Şekil 3 c) ve 5^th döngüsü tarafından görünüyor soluk ve beyaz (şekil 3D). Recellularized damar kan perfüzyon (Şekil 3E) ve endotel medya perfüzyon (Şekil 3F) sonra parlak kırmızı renkte görünüyor. (Şekil 4B) H & E boyama içinde yok Mavi çekirdeği görüldüğü decellularization tedavi 5 döngüleri damar hücreleri başarıyla kaldırıldı. Buna ek olarak, birkaç çekirdek normal şekilde (Şekil 4A) görüldü. Luminal tarafındaki ekli hücrelerin varlığı recellularized ven kan 48 h (Şekil 4 c, siyah ok) ve sonra 96 h (şekil 3D, siyah oklar) endotel orta ile perfüzyon ile H & E boyama içinde görülür.

Resim 1 : Perfüzyon kurulumları için decellularization montajı. A) birleştirilmiş decellularization kurulumu 1 Triton X-100 için gösteren ve yıkama resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. B) TnBP perfüzyon monte decellularization kurulum 2 gösteren resim. Benzer şekilde, decellularization Kur 1, olduğu gibi beyaz ok çözümleri için akış yolunu göstermek ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. C) deoksiribonükleaz perfüzyon monte decellularization Kur 3 gösteren resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar alıcılar ven ve çözümler için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Resim 2 : Hazırlık ve recellularization için biyoreaktör montajı. A) resim gösteren malzemeler biyoreaktör montajı için gerekli. B) bağlayıcılar (kırmızı oklar), azaltmak amacıyla yerleşim gösteren 4-port kap içine resmini puan damar giriş ve çıkış (beyaz ok) ve düzeni tüpler H, ben ve J. bağlanmak için Ücretsiz Tüp H sonuna medya dönmek için biyoreaktör yerleştirilir. C) ve dışarı gidiyor ilgili tüpler 4 bağlantı noktası kap üst taraftan görülebilir. D) monte biyoreaktör gösteren resim. E) bütün biyoreaktör Kur peristaltik pompa ile gösteren resim. Tüpler K biyoreaktör bağlantılarından peristaltik pompa uzatın. F) bütün biyoreaktör perfüzyon sistemi şematik gösterimi. Turuncu oklar, akış yönünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Şekil 3 : Decellularization ve recellularization sırasında damarlar morfolojisi brüt. A) normal damar brüt morfolojisi parlak kırmızı renkte görünüyor. Rengi decellularization devir sayısının artması ile kaybolur B) 2 döngüsü ve C) 3 döngüsü. D) 5 tarafından devir, damar görünüyor soluk ve beyaz. E ile ventriküler sonra ven) kan 48 h ve F) endotel ortamı için 96 h ile bir kez daha parlak kırmızı renkte görünüyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Decellularized ve recellularized damarlar karakterizasyonu. Hematoksilen ve görüntü boyama eozin A) normal damar içeren birçok mavi çekirdeği ama yok bunlar içinde B) decellularized damar. İle recellularized ven C) kan ile ve 48 h için D) 96 h, ek hücre (siyah oklar) lümen, endotel orta olduğunu fark ettim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Discussion

Safen damarlar decellularization için burada sunulan teknik umbilikal ve meme damarlar gibi tüm küçük çaplı damarlar için uygulanabilir kolay, basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Decellularization çözümleri ve bu yöntemde kullanılan onların konsantrasyonları bizim önceki sonuçları^6,7' den vardır. Decellularization 5 döngüleri öneririz rağmen bazı damarlarda biz de 3 kür tam decellularization fark ettim. Ancak, tekrarlanabilir sonuçlar 5 döngüleri kullanarak elde edilmiştir. Bu iletişim kuralı uygulayarak, biz uzunlukları değişen damarları decellularized 30 cm'ye kadar başarıyla (yayınlanmamış sonuç). Decellularization çözümün çıkış tarafından 45 cm kaldırma 33 mmHg ven içinde basınç oluşturur. Deneyim, biz bütün damar düzgün decellularizing ve tekrarlanarak 5 döngüleri önemli bir adım olarak bu fark. Seçilen basınç normal safen ven basınç (5-10 mmHg) 3 kat daha yüksek ama yetersiz olduğu (varis)²³damarlar. Ayrıca, bu yüksek basınç önemli bir güç damar duvarlarında oluşturur ve bu nedenle, verimli ve daha hızlı hücre kaldırılmasına yardımcı olabilir spekülasyon.

TnBP bir organik çözücü ve suda çözünmez olduğundan, deterjan bulutlu hale gelinceye kadar karıştırarak önemlidir; Aksi takdirde, deterjan yüzer olacak. Aynı nedenle, hortum çıkış ile cam kavanoz üstündeki deterjan'ın çıkış tüp çözümde, karışık TnBP tutmak için yerleştirildi. TnBP verimli kaldırılması damardan sonra onun kullanım her döngüsünde TnBP damlacıkları yıkanmış suda yüzen yokluğu tarafından görülebilir. Ayrıca DNaz adım atlama da decellularized bir doku üretti ama birkaç durumlarda, decellularized doku nispeten yüksek bir DNA içeriği fark etmişsinizdir. Yüksek basınç ve yüksek akış oranları verimli DNaz etkinlik için gerekli değildir, bir düşük perfüzyon oranı (10 mL/dak) kullanılabilir. Onun küçük boyutta kurulumu kolay İşlemede yardımcı olarak farklı peristaltik pompa kullanıldı. Çoğu hücre hasarı dönemi 2 sonuçlarında decellularization sırasında fark ettik beri DNaz tedavi döngüleri 1 ve 3 (yayınlanmamış sonuç) sırasında atlama öneririz. Karakterizasyonu ve miktar hücre dışı matriks proteinleri bu el yazması yapıldı değil olsa bile, bizim önceki deneyim benzer decellularization protokollerle biyomekanik özellikleri korunması gösterdi, hücre dışı matriks⁷yapısı ve proteinler. Bu damarlar ile bizim ön miktar deneyler (yayınlanmamış) benzer bir sonuç üretilen rağmen zaten yayınlanmış sonuçlarımız bu güven güçlendirecektir.

Bir önlemek uzun hücre genişletme kez, genişletilmiş hücreleri, cerrahi işgali ve rahatsızlık spontan mutasyonlar hasta için kan kullanarak recellularization bir rahat ve kolay kemik iliği genişletilmiş hücrenin üzerine işlemdir. Bu bilinen beri endothelialization da EPCs dolaşan oluşabilir, biz o perfüzyon ile endotel orta perfüzyon ardından kan ile olan recellularization için yeterli olacaktır. İki tür damarlar ile ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı⁷çocuk içine implante edildi Emanet benzer bir yöntemle mühendislik ven dokuların nakli başarılı sonuçlarından görülür. Decellularized hücre dışı matriks içinde büyüme faktörleri EPCs kan²⁴dolaşan eki verecektir spekülasyon. Recellularization benzer bir protokol sonrası damar hücreleri VEGF reseptör-2 ve farklılaşma (CD) 14 lümen CD45 ifade hücreleri adventitia⁷' de görüldü ise küme için olumlu gösterdi. Ayrıca sürekli endotel katman her durumda bu kişilerin progenitör hücre²⁵dolaşan numaraları azalma Bilindiği gibi özellikle büyük ve hastalıklı hastalardan kan ne zaman istimal gözlenen değil ki hayal. Ancak, biz bu perfüzyon ile alıcının kendi önermeyi kan yüzünden decellularization maruz kalır ve böylece olumsuz inflamatuar reaksiyonları sadece dikim yerine nakledilen olasılığını azaltmak antijenleri pek çok maske decellularized kan damarları. Buna ek olarak, kan perfüzyon büyüme faktörleri lümen ve hangi sırayla recellularization vivo içindehızlı bir işlemde ortaya çıkan progenitör hücre dolaşımdaki artan numaraları işe olabilir adventitia, daha yüksek düzeyde yatırabilirsiniz.

Bu çalışmada kullanılan biyoreaktör tasarım avantajı tam Isıyla, kolay montaj, maliyet-etkililik, kolay kullanım ve en az zarar olasılığı vardır. Deneyim, dakikada 10 cm uzunluğunda recellularized geçerli Tasarım, damarları kullanarak. Düz-se bile kadar damarları 25 cm uzunluğunda de recellularized damar "U" şeklinde biyoreaktör içinde tutarak, bu doğrulanması gerektiğini. Biyoreaktör Tasarımı ven akış yönünü yerçekimine karşı ve normal insanlarda bu damarlar için akış yönünü olduğundan bu nedenle tasarlanmıştır gösterilmiştir. Endotel orta adım 12 h perfüzyon ven yaygõn ve gelen EPCs eki benzeşim artırmak olduğunu. İlave heparin ve perfüzyon 1 h için eklenmesi kan pıhtıları kan perfüzyon sırasında tüplerde şekillendirme riskini düşürür.

Gerekli kan kan hacmi damarın uzunluğuna bağlıdır. Damar içinde kan sokulmasına biz kan hacmi için takip temel ilkedir. Kan 45 mL büyük birimler işlerken, ara sıra karıştırma biyoreaktör alt hücre birikimi önlemek için gerekli olabilir. Biz Steen'ın çözüm yüksek miktarda protein ve dokuların sağlıklı organ nakli^26,27sırasında korumak için gerekli bileşenler içerdiğinden kan için ekledi. VEGF ve b-FGF ek olarak onlar güçlü anjiogenik büyüme faktörleri²⁸ ve geçiş, yayılmasını önleme ve EPCs^{29,30,31,32 farklılaşma varlıklarını indükler faydalıdır} . Eklendi VEGF miktarı EPCs yayılması 80 ng/mL nerede görülmüş önceki yayınlanmamış sonuçlarımız temel alır. Aspirin ilavesi böylece endotel tabakası kendi eki olasılığını azaltarak trombosit³³ aktivasyonu engeller. Sürekli izlenmesi ve glikoz ilavesi de hücre çoğalması ve hemoliz kırmızı kan hücrelerinin önlenmesi için faydalı olacaktır.

Sadece basit kan örneği alıcıdan gelen gerekli olduğu için daha az teknik uzmanlık gerektiren bir kolay ve uygulanabilir prosedür olarak kabul edilebilir. Burada bitirmek için baştan gösterilen tüm prosedürü 20 gün alır rağmen, decellularized damarlar olarak saklamak bir raftan ürün hastalar için 8 gün yordamına kısaltacaktır. Decellularized damarlar depolanmasını Teknik olarak recellularization verimliliği etkilememelidir rağmen değerlendirilmelidir. Aşağıdaki yordamı oluşturulan doku mühendisliği damarları tıkalı damarlar, varis bağışıklık suppression gerek kalmadan önde gelen ve böylece daha iyi bir kalite sağlayan venöz yetmezlik yerine bypass ameliyatları için klinikte kullanılabilir hayat hasta için.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 Bağlantı Noktalı Kapak	CPLabSafety	WF-GL45-4Kit
Asetil salisilik asit	Sigma Aldrich	A5376
Anti-Anti	Yaşam Teknolojileri	15240-062
B-FGF	Lonza	cc-4113B
Kan Şekeri izleme sistemi - Serbest stil Lite	Abbott	70808-70
D-Glikoz	Sigma Aldrich	G8769
DNase-I	Worthington
EGM-2 Büyüme Faktörleri Kiti	Lonza	CC-4176
EG-VEGF	Peprotech	100-44
Cam şişe 250ml	VWR	2151593	GL45 kapaklı herhangi bir şişe kullanılabilir
Cam şişe 1L	VWR	2151595	GL45 kapaklı herhangi bir şişe kullanılabilir
Alt hortum çıkışlı cam kavanoz 500ml	Kimble Chase Yaşam Bilimleri	14607
Heparin	Leo	387107
Heparin Kaplı Vacutainer Tüpleri	Becton Dickinson	368480
İnsan AB Serumu	Sigma Aldrich	H3667
L-Glutamin	Yaşam Teknolojileri	25030-024
Luer Dişi 1/8 "ID Barb	Oina	LF-2PP-QC	3X5mm silikon tüp
Luer için 3/32 "ID Barb Oina		LF-1.5PP-QC	ile Kadın 2X4mm silikon tüp için
Luer Erkek 3/32 "ID Barb	Oina	LM-1.5PP-QC	ile 2X4mm silikon tüp
için Luer Erkek 1/8 "ID Barb	Oina	LM-2PP-QC	3X5mm silikon tüp için
Luer Erkek 5/32 "ID Barb Cole Parmer		EW-45518-06	5X8mm silikon tüp için
MCDB 131	Life Teknolojiler	10372-019
Asetik asit başına	Sigma Aldrich	433241
Peristaltik pompa I	Masterflex	7524-45	Hücre Giderme kurulumu 1 ve 2 için. Kullanılan kaset 7519-75
Peristaltik pompa II	Hücre	Giderme kurulumu 3 ve Yeniden Hücrelendirme biyoreaktörü için	ISM941'dir
Potasyum klorür	Sigma Aldrich	P5405
Potasyum hidrojen fosfat	Sigma Aldrich	P9791
İndirgeyici Konnektör 1.5mmX2.5mm	Biotech	ISM569A
Shaker	Ika	KS4000 kontrol
Sodyum Azide	Sigma Aldrich	71290
Sodyum klorür	Sigma Aldrich	13423
Sodyum hidrojen fosfat	Merck	71640-M
Steen çözeltisi	Xvivo	19004
Sütür	Agnthos	14817
Tri-n-bütil Fosfat	AlfaAesar	A16084.AU
Triton-X-100	AlfaAesar	A16046. OF
Tüp 60ml düz tabanlı	Sarstedt	60596
Tüp A	VWR	2280706	Hücre giderme perfüzyon steup 1 ve 2 için her biri 25 cm uzunluğunda 3 parça kesin
Tüp B	VWR	2280706	Hücre giderme perfüzyonu için 35 cm uzunluğunda 1 parça kesin Steup
Tüp C	VWR	2280706	Decellularization perfüzyonu için her biri 75 cm uzunluğunda 5 parça kesin Steups 1-3
Tüp D	VWR	2280706	Kesim Hücre giderme perfüzyonu için 90 cm uzunluğunda 1 parça steup 2
Tüp E	VWR	2280706	Kesim Reselülerizasyon için 20 cm uzunluğunda 1 parça steup
Tüp F	VWR	2280713	Hücre giderme perfüzyonu için her biri 15 cm uzunluğunda 2 parça kesin steup 1 ve 2
Tüp G	VWR	2280713	Hücre giderme perfüzyon steup 1 ve 2 için her biri 60 cm uzunluğunda 2 parça kesin
Tüp H	VWR	2280703	Reselülerizasyon perfüzyon steup için 15 cm uzunluğunda 1 parça kesin
Tüp I	VWR	2280703	Reselülerizasyon perfüzyon steup için 20 cm uzunluğunda 1 parça kesin
Tüp J	VWR	2280703	Hücreselleştirme perfüzyon için 25 cm uzunluğunda 1 parça kesin steup
Tüp K	VWR	2280703	Hücreselleştirme perfüzyon steup için her biri 35 cm uzunluğunda 2 parça kesin