Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Özet

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Özet

Obezite bir geniş yağ dokusu adipocyte hipertrofisi ile öncelikle remodeling tarafından eşlik ediyor. Aşırı adipocyte büyüme insülin, yerel hipoksi ve inflamasyon zavallı bir yanıt sonuçlanır. Tarafından ataları gelen fonksiyonel beyaz adiposit farklılaşma uyarıcı, radikal hipertrofisi adipocyte nüfusun önlenebilir ve sonuç olarak, yağ dokusu metabolik sağlık bir azalma ile birlikte geliştirilebilir iltihap. Ayrıca, bej/kahverengi adiposit bir farklılaşma uyararak, toplam vücut enerji harcaması, kilo kaybına kaynaklanan artırılabilir. Bu yaklaşım obezite komorbiditeler tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişimini engelleyebilir.

Bu kağıt yalıtım, genişleme ve beyaz ve bej adiposit CD31 ve CD34 işaretleri Co hızlı insan yağ dokusu endotel hücre alt grubunu üzerinden farklılaşma açıklanmaktadır. Yöntem nispeten ucuzdur ve emek yoğun değil. İnsan yağ dokusu erişimi gerektirir ve subkutan depo örnekleme için uygundur. Bu iletişim kuralı için taze yağ doku örnekleri morbid obez bir konu [vücut kitle indeksi (VKİ) > 35] Bariatrik cerrahi prosedürler sırasında toplanır. Stromal vasküler kesir üzerinden sıralı bir immunoseparation kullanarak, yeterince hücre gibi 2-3 g yağ küçük üretilmektedir. Bu hücreler kültür-ebilmek var olmak genişlemek 10-14 gün içinde cryopreserved ve geçiş kadar 5-6 passaging ile onların Adipojenik özellikleri korurlar. Hücreleri bir Adipojenik insan insülin bir arada ve PPARγ agonist-rosiglitazone kullanarak kokteyl ile 14 gün için kabul edilir.

Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış yağ endotel hücrelerinde Adipojenik yanıt-e doğru götürmek moleküler mekanizmaları üzerinde kavramı deneyler kanıtı elde etmek için veya Adipojenik artırabilir yeni ilaçlar eleme için yanıt ya beyaz doğru yönetmen ya da bej/kahverengi adipocyte farklılaşma. Küçük subkutan biyopsi kullanarak, Bu metodoloji Yanıtlayıcı olmayan konular için klinik çalışmalarda bej/kahverengi ve beyaz adiposit komorbiditeler ve obezite tedavisi için teşvik etmek amaçlı dışarıda için kullanılabilir.

Giriş

Son kanıtlar hem fareler ve insanlar, yağ dokusu damarlara ikamet eden hücre alt grubunu beyaz veya bej/kahverengi adiposit^1,2,3Ayrıştırılan gösterir. Bu tür hücrelerin fenotip tartışmalara, endotel hücreleri, düz kas/pericyte veya ara fenotipleri^4,5,6,7bir spektrum destekleyen kanıt ile bir konudur. Bu metodoloji geliştirme kapsam CD34 + CD31 + endotel hücreleri obez insanlar farklı yağ depoları dan izole Adipojenik potansiyelini test etmek için yapıldı. Diğer çalışmalar literatürde potansiyel toplam stromal vasküler fraksiyonunun veya bilinen adipocyte ataları^2,8,9Adipojenik üzerinde duruluyor. Şu anda mevcut teknolojilerin özellikle yağ dokusu endotel hücreleri ilaç teslim¹⁰için hedef olabilir olduğundan, potansiyel böyle hücrelerinin Adipojenik geçmesi anlama indüksiyon beyaz veya bej adiposit doğru için önemlidir gelecekte hedefli tedaviler.

Farklı gruplar CD31 ve CD34 işaretleri arada insan yağ dokusu^11,12,13endotel hücreleri izole etmek için vekilleri olarak bildirdi. Genellikle, yalıtım iki sıralı adımları ve manyetik boncuklar kullanarak pozitif seçimi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu raporda, CD31 plastik boncuk ile kombine CD34 + manyetik bir boncuk kullanarak immunoseparation kullanılmıştır. Bu teknik sıralı manyetik immunoseparation tipik Arnavut kaldırımlı endotel morfoloji korunması ile ilgili olarak daha üstün bulduk. Ayrıca, 1-2 g yağ gibi küçük başlangıç genişleme ve Adipojenik indüksiyon için gerekli yeterince hücre oluşturmak başardık. Küçük örnek biyopsi subkutan yağ hücreleri aşağı akım uygulamaları için gerekli miktarı üretmek için yeterli olacaktır. Bu açıdan özellikle bu yöntem insan denekler Adipojenik indüksiyon bir kavramaları için tarama için kullanılacaktır, potansiyel olarak önem kazanır.

Literatürde bildirilen diğer sistemlerin aksine, bu yöntem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için sadece iki malzemeler kullanır: bir PPARγ agonist — rosiglitazone — ve insan insülin. Önemlisi, insanlar¹⁴post-absorptive insülin dolaşan normal/yüksek Aralık içinde kullanılan insülin miktarı düşer. Akt fosforilasyon tarafından ölçülen hücreleri vitro, insülin duyarlılık derecesini indüksiyon kokteyl tepki yeteneğini kendi ile ilişkili değil. İlginçtir, bu indüksiyon kokteyl ve deneysel koşullar kullanarak, beyaz ve bej/kahverengi hücreleri bir karışımı elde edilen boyutu ve sayıda hücre içi lipid damlacıkları ve moleküler işaretleyicilerin görünümünü ifade tarafından belirlendiği gibi. Bu basit ve maliyet-etkin indüksiyon Protokolü (bej beyaz vs. ) Yanıtlayıcı hücrelerinin fenotip kantitatif değerlendirilmesi ile birlikte potansiyel olarak farklılaştırılmış bej dengesini değiştirebilir ajanlar bir tarama için izin verir : beyaz adiposit.

Bu yöntem aynı zamanda insan yağ dokusu içinde vasküler endotel ataları adipogenesis temel mekanizmaları anlamak için translasyonel bir yaklaşım sağlar. Bu özel yalıtım/farklılaşma tekniği kullanarak, müfettişler çeşitli yolları yalın ve obez insanlarda çeşitli yağ depoları dan adipogenesis vasküler endotel hücre alt grubunu içinde sorumlu sorguya çekebiliriz.

Protokol

Kurumsal teftiş kurulu Derneği Doğu Virginia Tıp Fakültesi, araştırma ve çalışmada kullanılan insan yağ doku örnekleri toplanması onayladı. Bilinçli yazılı izni hastalardan toplanmıştır.

1. hazırlanması arabellekleri, medya ve aletleri

1. Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered çözüm (KRBBS) hazırlamak: 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibasic, 5.5 mM glikoz, 1 mM Adenozin, % 0,01 antibiyotik/antimycotic mix (50 µg/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin, gentamisin 30 µg/mL, amfoterisin 15 ng/mL) ve 10 mM HEPES (pH 7.4 =). Bu çözüm doku toplama ve sindirim için her zaman taze hazırlanır.
2. Taze collagenase çözüm hazırlamak: 1 mg/mL collagenase, tip 1, KRBSS; 3 mL/g yağ olun. Doku sindirim önce su banyosunda 37 ° C'de collagenase çözüm önceden ısıtmak.
3. CD34 hücre izolasyon arabellek hazırlamak: % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM EDTA steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
4. Adipogenesis ortam hazırlamak: DMEM/F12, % 5 FBS, 50 µg/mL penisilin/streptomisin, 1,25 µL/mL (5 µg/mL veya 144 mU/mL) insan insülin ve 0,36 µL/mL 2.8 mM rosiglitazone (1 µM).
5. %0,3 yağ kırmızı O (ORO) hisse senedi çözüm (ağırlık/hacim) ORO 0.3 g isopropanol 100 mL içine çözülerek hazırlayın.

2. yağ Stromal vasküler kesir yalıtım

Not: Morbid obez tip 2 diyabetik (T2D) ve Sentara metabolik ve kilo kaybı cerrahi Merkezi'nde (Sentara Medikal Grubu, Norfolk, VA) obezite cerrahisi uygulanan diyabetik olmayan konular, 18-65 yaş arası kesitsel bir kohort çalışma dahil. Dışlama kriterleri bir otoimmün hastalığı tip 1 diyabet, kronik immünsüpresif tedavi, Anti-inflamatuar ilaçlar, thiazolinendiones, etkin tütün kullanımı, kronik veya akut enfeksiyonlar veya bir geçmiş gerektiren koşullar da dahil olmak üzere dahil Son 12 ay içinde tedavi malignite. T2D 126 mg/dL veya daha büyük bir açlık plazma glukoz, 200 mg/dL veya daha büyük 2 h glikoz tolerans testi sonra bir glukoz veya antidiyabetik ilaçların kullanımı tanımlanmıştır.

1. İnsan omental (OM) ve subkutan (SC) Yağ dokusundan (AT) insan denekler obezite cerrahisi uygulanan toplamak.
2. OM ve SC AT hemen doku çıkarma sonra Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 50 µg/mL penisilin/streptomisin, oda sıcaklığında içeren ayrı şişeleri tutun.
3. Dikkatli bir şekilde temiz ve fibrotik ve dağlanmış bölümleri doku örneği laboratuarda doku çıkarma sonra geldiğinde % 70 etanol makas örnek aldım ve cımbız kullanarak kaldırın.
4. Yağ dokusu tartmak ve BT 5 g (veya daha az) aliquots collagenase sindirim için bölüm.
5. İnce iki çift makas kullanarak at 5 ml collagenase çözüm oda sıcaklığında bir mercek şişe içinde 5 g kıyma.
6. 15 mL toplam için kıyılmış doku için ek bir 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin.
7. Sürekli titriyor ile bir su banyosu içinde 37 ° C'de 1 h için örnekleri sindirmek.
8. Künt bir son yapmak için bir 20 mL şırınga ihbar kesti.
9. 250 µm kafes üzerinden 9 cm x 9 cm kare şeklinde bir kesik ve künt son şırınga kullanarak 50 mL konik tüp yarıya kadar itin.
10. Örnekleri 20 mL künt son şırınga ve 250 µm naylon mesh adiposit ve stromal damar hücreleri sindirilmemiş dokusundan ayırmak için 50 mL konik tüp içine filtreden içine dökün.
    Not: mesh aşırı fibrotik sindirilmemiş malzeme nedeniyle tıkanmış olsun AT 5 g 50 mL konik Tüp, başına birden fazla kullanmayın.
11. KRBBS 10 mL ile mercek şişe dışarı yıkama ve kalan hücreleri toplamak için filtreden dök.
12. Filtre uygulanmış örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    Not: Adipositler float tüp üstünde ve bazı stromal damar hücreleri tüpün dibinde yerleşmek için izin vermek bu adım önemlidir.
13. 20 mL şırınga ve bir 20 G x 6'pipetting iğne stromal vasküler kesir katmanı kaldırın ve temiz 50 mL konik tüp aktarmak için kullanmak.
14. KRBBS 10 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için bankta oturmak örnekleri sağlar.
15. 2.12-2,14 adımları iki kez tekrarlayın.
    Not: Aşağıdaki adımları hiçbir kirlenme ile kayan adiposit stromal vasküler hücre olduğundan emin olun.
16. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi her iki depoları için daha fazla alay, buzda stromal vasküler kesirler tutmak.
    Not: Bu hücre canlılığı üzerinde bir etkiye sahip gibi hücreleri daha 1 h, buz üzerinde terk etmeyin. Adiposit deneyler için taze kullanılan ya da flash donmuş sıvı azot uzun süreli depolama için olabilir.

3. yağ dokusu endotel hücre izolasyon

1. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de stromal vasküler kesirler (SVF) spin
2. Örnekler santrifüj kaldır ve dikkatle süpernatant dökün; SVF hücreleri içeren pelet tutun.
3. Yavaşça hücre topakları PBS 5 mL resuspend.
   Not: bir AT depo daha--dan 5 g (bkz. Adım 2.4) birden çok aliquots işlendiyse, hücre topakları birlikte havuz.
4. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de spin
5. Süpernatant kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri saymak.
   Not: Burada, bir otomatik hücre sayaç hücre sayımı için kullanıldı. Hücre canlılığı 12 µL hücre süspansiyon, akridin turuncu/propidium iyodür (AO/PI) çözümünü 12 µL ile karıştırılarak elde edildi ( Tablo malzemelerigörmek). Hücreleri her depo için at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 1,69 x 10⁵ ± 4.51 x 10⁴; (b) SC depo: 1,24 x 10⁵ ± 6.45 x 10⁴. Her iki depoları hücrelerden canlılığı yapıldı > % 90.
6. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
   Not: CD34 immunomagnetic seçim Protokolü ( Tablo malzemelerigörmek) adımlar için 3.7-3.15 uyarlanmıştır.
7. Pelet CD34 yalıtım arabellek 100 µL içinde resuspend.
   Not: Toplam hücre sayısı aşağıdaki re-süspansiyon birimleri gerektirir: (a) < 2 x 10⁷ hücreleri: Pelet 100 µL; resuspend (b) 2 x 10⁸–5 x 10⁸ hücreleri: pelet 1 mL resuspend. 3.9-3,16, adımda kullanılan reaktifler hacimleri için küçülttüm < 2 x 10⁷ hücreleri.
8. CD34 kokteyl 10 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında örnek kuluçkaya.
9. Manyetik boncuklar 5 µL ekleyin ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
10. CD34 yalıtım arabellek 2.5 mL her örnek için ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için mıknatıs örnekleri yerleştirin.
11. Mıknatıs 5 için ters çevir'i s yalıtım tampon dökün.
12. Örnekler mıknatıs kaldırmak ve 3.10 ve 3,11 4 x arasındaki adımları yineleyin.
13. Tüp mıknatıs kaldır ve CD34 yalıtım arabellek 2 mL ekleyin.
14. Hücreleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
15. Hücre topakları 1 mL CD34 yalıtım arabellek resuspend ve hücreleri saymak.
    Not: İşte, at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 4,75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC depo: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10³. Bir CD31 plastik immunobead iletişim kuralı için adımları 3,16-3,34 ( Tablo malzemelerigörmek) uyarlanmıştır.
16. Hücreleri 500 x g 5 min için de cips ve Pelet arabellek b 250 µL ve yıkama arabelleği 250 µL'resuspend.
17. İyice CD31 boncuk vortexing tüp tarafından resuspend.
18. 20 µL CD31 boncuk ekleyin.
    Not: Toplam hücresini nedeniyle sayar > 1 x 10⁶, birimin üreticinin giriş göre küçültülmüş.
19. Oda sıcaklığında 30 dakika sallanan ile örnek kuluçkaya.
20. Bir süzgeç steril 50 mL konik tüp takın.
    Not: Süzgeç büyük açılış üstte olması gerekir.
21. Önce hücre ayırma, yıkama arabelleği süzgeç equilibrate 1 mL ekleyin. Süzgeç 3,16 adıma altında oluşturulan karışımı uygulamak.
22. Dairesel bir hareketle toplam hacmi 20 mL için süzgeç yıkama arabelleği 5 mL ile yıkayın. Bağlayıcı bir steril 50 mL konik tüp takmak ve radarı kilit kapatın.
23. Süzgeç konektöre takın. Yıkama arabellek süzgeç duvar boyunca 1 mL ekleyin. Süzgeç duvar boyunca aktif arabellek D 1 mL ekleyin. Örnek hafifçe girdap ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
24. Yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Yukarı ve aşağı 10 x pipetting tarafından boncuk ayrı hücreler.
    Not: hava kabarcıkları oluşturulmasını engellemek.
25. Radarı-kilidi açmak ve 50 mL konik tüp içine akmaya müstakil hücreleri izin vermek. Süzgeç 10 yıkama yıkama arabelleği her zaman 1 mL x.
26. Bağlayıcı ve süzgeç atmak ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Hücre Pelet komple EGM-2 Medya kültürü için 2 ml resuspend.
    Not: Hücreler bu noktada at gram başına ortalama sayısıdır: (a) OM depo: 5.92 x 10³ ± 4.27 x 10³; (b) SC depo: 4.12 x 10³ ± 2.1 x 10³. Her iki depoları hücrelerden canlılığı üzerinde % 90 oldu.

4. indüksiyon Adipogenesis izole endotel hücrelerinde

1. 6-iyi doku kültürü tedavi plakaları hücrelerde bir 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka komple EGM-2 medya ile büyümek. Ortamı her 3-4 hücreleri % 80 – 90 izdiham ulaşana kadar gün değiştirin.
   Not: 2-3 gün arasında nüfus katlama olduğunu.
2. 100 mm Petri yemekler üzerinde kaplama tarafından hücreleri genişletin ve 1:3 kez hücreleri bölme. Bu aşamada, geçiş 2 hücrelerdir.
3. (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik bir hücre kullanarak hücreleri counter Count.
4. Tohum yaklaşık 100-200.000 hücrelere 6-şey plakaları her depo ve onları buna 2 gündür EGM-2 medya tamamlandı kültür için yinelenen wells sağlanması.
5. Aspire herhangi bir büyüme medya ve DMEM/F12 2 mL % 5 ile onun yerine FBS ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin denetim için hücreleri ve 2 mL (bkz. Adım 1.4) Adipogenesis medya için tedavi hücreleri ile değiştirin.
6. Hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya ilgili medya her 3-4 gün yerine CO₂ kuluçka 13 gündür.
   Not: Hücreleri tedavi 4 gün sonra lipidler toplamaya başlayacaktır.
7. ORO ve Nil yayınlanan yöntemleri^15-17göre boyama kırmızı yürütmek.
8. Bir RNA çıkarılması için hücreleri izole etmek için 6-iyi indüksiyon plakalar medyayı çıkarın ve 1 mL steril PBS ile yıkayın.
9. Guanidium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm 350 µL ekleyin (her şey ve oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya Malzemeler tablobkz:).
10. Hücreleri kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka kapalı kazımak ve hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
    Not: Örnekleri RNA çıkarma ve daha sonraki bir tarihte işlenmesi için-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
11. MRNA adapte bir RNA ayıklama kullanarak örnekleri ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.
12. Bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gen ifade aşağıdaki problar kullanarak değerlendirmek için gerçekleştirmek: adiponektin, UCP-1 ve CIDEA (bkz: Malzemeler tablo).
    Not: Burada, RT-PCR yordamlar aşağıdaki standart protokolü kullanılarak yapılmıştır: denatürasyon (95 ° C; 15 s), tavlama ve uzantısı (60 ° C; 1 dk) 40 döngüleri için. C_T değerleri ile gen ifade örnekleri > 35 belirlenemeyen kabul.

Sonuçlar

Bizim iletişim kuralı CD34 + CD31 + insan yağ dokusunun farklı depoları damar hücreleri Adipojenik potansiyelini belirlemek için bir vitro yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Basitleştirilmiş akış diyagramı Şekil 1A

<...

Tartışma

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + visseral ve subkutan depoları insan yağ dokusunun endotel hücrelerden bir metodoloji sağlamak için bu kağıt odak noktasıdır.

Metodolojisi kemirgenler veya öncelikle teknikleri fluorescently etiketli veya manyetik boncuklar-^18, birleştiğinde CD31 antikorları kullanarak dahil insanlar çeşitli vasküler yatak endotel hücrelerinin yalıtım için bildirilmiştir ^{19 ,}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Büyük Ekipman
Biyogüvenlik Kabini	Nuaire	nu-425-400
Hücre Kültürü İnkübatörü	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Su Banyosu	Forma Scientific	2568	Karşılıklı Çalkalayıcı
RT-PCR Makinesi	BIO-RAD	CFX96-C1000
Elektroforez Kutusu	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Hücreli
Transblot Kutusu	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Hücresi
Elektroforez Güç Kaynağı	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Okuyucu	Moleküler Cihazlar	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Yakın Kızılötesi
Soğutmalı Santrifüj	Eppendorf	5810 R
Masa Üstü Santrifüj	Eppendorf	MiniSpin Plus
Floresan Mikroskop	> Olympus	BX50
Ters Mikroskop	Nikon	TMS
KRBSS Tampon
HEPES	Research Products International	H75030
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	792519
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma-Aldrich	C7902
Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P5655
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M2643
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	746398
Sodyum fosfat monobazik monohidrat	Sigma-Aldrich	S9638
Potasyum klorür< / p>	Sigma-Aldrich< / p>	P9333< / p>
Glikoz< / p>	Acros Organics < / p >	410950010< / p >
Adenozin < / p>	Acros Organics < / p >	164040250< / p>
Sığır Serum Albümini < / p >	GE Healthcare Bio-Sciences< / p>	SH30574.02< / p>
Penisilin / Streptomisin< / p>	Thermo-Fisher Scientific< / p>	15070063< / p>
Doku Sindirimi< / strong>< / p>
20 mL Şırınga< / p>	Global Medical< >	67-2020
Naylon Mesh, 250 ve mikro; m	Sefar	03-250/50
Pipetleme İğneleri	Popper	7934
İnce Makas	> Güzel Bilim Aletleri	14058-11
Doku Forseps	George Tiemann & Co< / p>	160< / p>
Kollajenaz, Tip I< / p>	Worthington Biyokimyasal< / p>	LS004196< / p>
Petri Kapları, 100 mm < / p>	ABD Bilimsel <	> 5666-4160 < / p>	TC Tedavi Edilmiş< / p>
Eppendorf Tüpleri, 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500
Konik Tüpler, 15 mL	Nest Scientific	601052
Konik Tüpler, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Sintilasyon Şişeleri	Kimble	74505-20	Doku Doğrama
Hücre İzolasyonu
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Canlılık Boyası	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Akridin Portakal/Propidin yum İyot
Anti-CD34 Manyetik Boncuklar	StemCell Teknolojileri	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastik Boncuklar	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Yıkama Tamponu	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Bağlantı Halkası	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Ayırma Arabelleği	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Kuluçka Tamponu	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Hücre Süzgeci	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6 oyuklu Plakalar	USA Scientific	CC7682-7506	TC Tedavi Edilmiş
4- iyi odacıklı slaytlar	Corning Life Sciences	354559	Fibronektin kaplı
4 kuyulu odacıklı slaytlar	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Kaplamasız cam
İnsan Yağ Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HAMVEC)	Sciencell Araştırma Laboratuvarları	7200	Birincil hücre hattı
Endotel Hücre Ortamı (ECM)	ScienCell Araştırma Laboratuvarları	1001	Komple Kit
DMEM/F12 Bazal Ortam	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
İnsülin	Lilly	> U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	İzopropanol içinde hazırlanmıştır
96 kuyulu plakalar	USA Scientific	1837-9600
96 kuyu PCR plakaları	Genesee Scientific	24-300
RNA Ekstraksiyonu	Zymo Research	> R2072	> Kit
cDNA Sentezi	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polimeraz	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	PCR
Magnezyum Klorür Çözeltisi	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	PCR reaksiyonunda 3 mM final
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Testi	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-akrilamid	BIO-RAD	1610146	40% stok solüsyonu
Amonyum Persülfat	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glisin	BIO-RAD	1610718
Sodyum Dodecal Sülfat	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromofenol Mavisi	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membran	EMD Millipore	IPFL00010
Metanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Engelleme Tamponu, Tris	LI-COR	927-50000
< p>Anti-AKT antikoru	Hücre Sinyal Teknolojisi	2920S	Fare monoklonal
Anti-pAKT antikoru	Hücre Sinyal Teknolojisi	9271S <	p>Tavşan poliklonal
Anti-UCP1 antikoru	Abcam	ab10983	Tavşan poliklonal
Anti-Fare IgG antikoru	LI-COR	926-68070	Keçi Poliklonal, IRDye 680RD
Anti-Tavşan IgG antikoru	LI-COR	926-32211	2><
> <	Jackson ImmunoResearch< >	111-025-003	Keçi Poliklonal, TRITC
Fosfat Tampon Salin	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehit Çözeltisi	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15686	hücre fiksasyonu için 4% çözelti
Normal Keçi Serumu	Vektör Laboratuvarları	S-1000	10% engelleme çözümü
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0. % 1 geçirgenlik çözeltisi< / p>
DAPI< / p>	Thermo-Fisher Scientific< >	D1306
Calcein	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Hücre floresan görselleştirme
Matrigel Temel Membran Matrisi	Corning Life Sciences	356231	Büyüme faktörü azaltıldı
DiI etiketli Asetillenmiş LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484