Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Canlı organizmalar düzenli olarak dalgalanan ortamları ile sıcaklık, pH, reaktif oksijen türleri birikimi, daha fazla ve değişiklikleri de dahil olmak üzere kendi yaşam döngüsü sırasında başa çıkmak gerekir. Bu dalgalanmalar unfolding, bir yaygın protein için toplama, kurşun ve ölüm hücre. Bu nedenle, hücreleri "sağlıklı" Proteom stres koşullarında korumak moleküler chaperones dinamik ve stres özel ağının gelişmiştir. ATP bağımsız chaperones ilk satır savunma molekülleri, bir stres bağlı şekilde protein toplama karşı koruma olarak hizmet moleküler chaperones bir ana sınıfı oluşturur. Bu chaperones ortak olan bir özelliği yeteneğini kendi stres özgü etkinleştirme, tanıma ve misfolded istemci sürümü için yapısal plastisite kullanmak olmasıdır.
Bu yazıda, bir tür özünde düzensiz refakatçi, bakteriyel redoks düzenlenir Hsp33, proteinler oksidatif stres sırasında toplama karşı koruyan fonksiyonel ve yapısal analizi odaklanmak. Burada, kendi faaliyet altında yatan bir araç çeşitli teknikleri redoks düzenlenir refakatçi etkinlik eğitim için hem de refakatçi konformasyon değişiklikleri eşleştirmek için mevcut. Özellikle, biz tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler, ışık saçılım kullanarak, derecesi üzerinde odaklanan refakatçi anti-toplama etkinliği vitro analizine ardından hazırlanması içeren bir iş akışı tarif Anti-toplama etkinliği ve onun kinetik. Sık outliers toplama deneyleri sırasında biriken üstesinden gelmek için Kfits, kinetik ölçümleri kolay işlenmesini sağlayan yeni bir grafik araç kullanımını açıklar. Bu aracı kolayca diğer türleri kinetik ölçümlerin outliers kaldırma ve kinetik parametrelerin montaj için uygulanabilir. Işlev protein yapısı ile ilişkilendirmek için kurulum ve iş akışı bir yapısal kütle spektrometresi tekniği, refakatçi eşleme konformasyon değişikliklerinin sağlayan hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi, tarif ve Hsp33 faaliyet farklı aşamalarında alt katman. Aynı metodoloji diğer protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için uygulanabilir.
Giriş
Hücreleri reaktif oksijen türleri (ROS) solunum1,2, protein ve lipit oksidasyon3,4ve ek işlemler5yan üretilen bir birikimi sık karşılaşırsanız, 6,7. ROS yararlı rolü rağmen8,9 ve bağışıklık yanıtı10sinyal cep gibi farklı biyolojik süreçleri, ROS üretim ve onun detoksifikasyon arasında bir dengesizlik, oksidatif için önde gelen ortaya çıkabilir 7stres. Bi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler hazırlanması
-
Tam olarak azaltılmış bir protein hazırlanması
Not: Burada, biz bir çinko içeren protein ve Zn dahil, düşük protein durumuna için kullanım ZnCl2 çözüm azalma tarif. ZnCl2 çözüm yerine atılan veya. Not zaman ve sıcaklık azaltma işleminin protein istikrar ve işlev bağlıdır ve böylece başına protein özgüdür.- Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı sıralayacağız. Örnek en az 1,5 saat 37 ° C 5 mM DTT ile ve 20 µM ZnCl2 için kuluçkaya (ilâ protein konsantrasyonu %70).
Not: Bu adımda sıcaklığı protein bağımlı ve protein istikrar....
- Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı sıralayacağız. Örnek en az 1,5 saat 37 ° C 5 mM DTT ile ve 20 µM ZnCl2 için kuluçkaya (ilâ protein konsantrasyonu %70).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sunulan iki yöntem kinetik etkinlik ve protein etkileşimleri, substrat arasındaki bir koruyucuya dinamikleri takip olanak sağlar. Ayrıca, oksidasyon azaltma Protokolü redoks bağımlı düzensiz chaperones etkinleştirme mekanizması daha derinlemesine bir anlayış vererek bir tam olarak azaltılmış ve tam okside koruyucuya hazırlanması sağlayan.
İlk olarak, ışık saçılma refakatçi redoks bağımlı etkinliğini incelemek için kullanılır. Iş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, redoks bağımlı refakatçi etkinlik analizi ve yapısal değişiklikler bir istemci protein bağlama üzerine karakterizasyonu için protokolleri sağladı. Bu potansiyel refakatçi-substrat kompleksleri tanımlamak ve olası etkileşim siteleri çözümlemek için tamamlayıcı yöntemler vardır.
Burada, biz bu protokollerin iyi okudu refakatçi substrat CS ile redoks düzenlenir refakatçi Hsp33 arasında karmaşık bir karakterizasyonu için uygulanır. Biz onların kinetik ve ilk durumda farklı protein topla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar onun yararlı tartışmalar için Meytal Radzinski için müteşekkir ve kritik HDX analiz platformu kurmak onların sınırsız yardım için makale ve Patrick Griffin ve laboratuvar üyeleri için okuma. Yazarlar Almanca-İsrail Vakfı (ı-2332-1149.9/2012), iki uluslu Bilim Vakfı (2015056), Marie-Curie tümleştirme grant (618806), İsrail Bilim Vakfı için minnettar (1765/13 ve 2629/16) ve insan sınır bilim Mali destek programı (CDA00064/2014).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Kimyasallar, Reaktifler< / güçlü > | |||
| Asetonitril HPLC artı | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | çözücü |
| Formik asit Optima LC / MS | Fisher Chemicals | A117-50 | çözücü takviyesi |
| İzopropil alkol, HPLC sınıfı | Fisher Chemicals | P750717 | çözücü |
| Metanol | Fisher Chemicals | A456-212 | çözücü |
| Tris(hidroksimetil)aminometan | Sigma Aldrich | 252859 | tamponu |
| Trifloroasetik asit | Sigma Aldrich | 76-05-1 | çözücü |
| HPLC için su | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | çözücü |
| ZnCl2, Çinko Klorür | Merck | B0755416 308 | reaktif |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | indirgeyici ajan |
| PD mini tuzak G-25 sütunları GE sağlık | GE sağlık | 29-9180-07 | tuz giderme sütunu |
| Potasyum Fosfat | Amerika Birleşik Devletleri Biyokimya Şirketi | 20274 | tampon |
| Hidrojen peroksit %30 | Merck | K46809910526 | oksitleyici ajan |
| sitrat sentaz | sigma aldrich | C3260 | substrat |
| HEPES asitsiz | sigma aldrich | 7365-45-9 | tampon |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denatürant |
| Döteryum Klorür Çözeltisi | sigma aldrich | 543047-10G | tampon |
| Döteryum Oksit %99 | sigma aldrich | 151882-100G | çözücü |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | indirgeyici ajan |
| 150uL Mandrel İç Mekanlı Mikro Uç & Polimer Ayaklar, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Şeffaf Kısa İplik Flakon 9mm Dişli, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| kuvars küvet | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Florospektrometre | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, tezgah üstüSantrifüj | Thermo Scientific | ||
| pH metre, PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro İmmobilize Pepsin sütunu (20 mm uzunluk, 2,0 mm çap). | AffiPro | ||
| Sular Ön sütun (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analitik kolon (ACQUITY UPLC Peptid BEH c18 Kolon, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinil Hava kilitli kapılı anaerobik oda | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap kütle spektrometresi | Thermo-Fischer Bilimsel | ||
| PAL sistemi LHX - HDX numunelerini işlemek için robotik sistem | PAL sistemi | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pompası | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS yardımcı pompa | Thermo Scientific | ||
| Yazılım, Yazılım Araçları, Veritabanı araması< / güçlü> | |||
| Kfits: Uygun toplama Verileri | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur yazılımı | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Serisi Ayar Arayüzü (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos yazılımı (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 yazılımı | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX tezgah yazılımı | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
Kaynaklar
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
