Method Article

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-RNA'ların (miRNAs) tek iplikçikli RNA transkript haberci RNA (mRNA) bağlamak ve onların çeviri inhibe veya onların yıkımı teşvik vardır. Bugüne kadar miRNAs içinde miRNA transkript güvenilir algılama yöntemleri ihtiyacını miktarlara hastalığı ve Biyolojik süreçler, çok sayıda karıştığı olmuştur. Burada, biz fare kalp bölümlerinde protein immunostaining ile birlikte digoxigenin etiketli (kazmak) kilitli nükleik asit (LNA) miRNA sonda tabanlı algılama için detaylı bir protokol tanımlamak. İlk olarak, situ hibridizasyon tekniği miRNA-182 ifadede denetim ve kalp hipertrofisi fareler kalp bölümleri tanımlamak için sonda kullanarak gerçekleştirilen. Daha sonra immunostaining kardiyak Troponin T (cTnT) protein, miRNA-182 cardiomyocyte hücrelerle birlikte yerelleştirmek için aynı bölümleri için gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralını kullanan, biz Renkölçer tahlil ve floresan boyama yoluyla cTnT miRNA-182 alkalen fosfataz aracılığıyla göre tespit edebildik. Bu iletişim kuralı aracılığıyla kazmak etiketli LNA probları ilgi herhangi bir miRNA ifade ve fare kalp doku bölümlerinde ilgili protein ifade algılamak için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-RNA'ların (miRNAs) çoğu kısa (18-25 nukleotid), gen ekspresyonu çoğu düzeyinde negatif düzenleyiciler olarak inhibe mesajcı RNA (mRNA) çeviri ve/veya mRNA yıkımı teşvik tarafından işlev tek iplikçikli, kodlamayan RNA'ların 1. miRNAs transkripsiyonu intron veya kodlama ekzonlar veya kodlamayan genler ve are i ciddi kısa sap-ilmik yapılar 70 nükleotit2habercisi miRNAs (pre-miRNAs), DROSHA tarafından çekirdeğine içinde. Sitoplazmik takip verme, pre-miRNAs daha da 18-25 nükleotit3,4span olgun miRNAs DICER tarafından işlenir. Daha sonra RNA-induced silencing kom....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kalp doku örnekleri bu çalışma için ilgili kanun ve kurumsal yönergelere uygun olarak elde edilmiştir ve Yale Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. çözüm hazırlık

  1. RNase free GKD2O hazırlamak, GKD2O 5 L 5 mL % 0,1 diethylpyrocarbonate (DEPC) ile tedavi tarafından (O/N), gecede oda sıcaklığında (RT). DEPC devre dışı bırakmak için (121 ° C) basınçlı kap. Kullanım DEPC tedavi GKD2O hazırlanması için aşağı akım çözümleri gösterilir.
    Dikkat: DEPC bilinen bir kanserojen, sadece duman mahallede işlemek.
  2. 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm DEPC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA in situ hibridizasyon kapış miRNA ve U6-snRNA, sırasıyla negatif ve pozitif denetimleri hizmet kullanarak fare kalp bölümlerde optimize edildi. Pozitif boyama belirtilir mavi, negatif boyama renk geliştirme eksikliği gösterilir iken (Şekil 1A-1B). MiRNA-182 Cardiomyocyte belirli ifade denetim ve PlGF overexpressing fareler kalp bölümleri değerlendirildi. Bir αMHC organizatörü altında PlGF transgene taşıyan fareler kalp hipertro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA transkript algılama duyarlılık, özgüllük ve nicel güç farklı farklı teknikleri ile elde edilebilir. Burada, biz miRNA in situ hibridizasyon immunostaining ile kaplin göstermek ve aynı kalp bölümlerinde miRNA ve protein molekülleri ifade düzeylerde eşzamanlı değerlendirilmesi için izin veren bir protokol açıklayın. Biz ilk kazmak etiketli LNA miRNA probları in situ hibridizasyon gömülü parafin kalp bölümler üzerinde gerçekleştirmek nasıl göstereceğim. Daha sonra aynı bölümlerinde cTnT için immunost.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Athanasios Papangelis, el yazması kritik Yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. FM Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC; tarafından desteklenen BB/M009424/1). IP Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe tarafından (17SDG33060002) desteklenir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DietilpirokarbonatSigma AldrichD5758DEPC
Fosfat tamponlu salinSigma AldrichP4417PBS
Tween-20Amerikan BiyoanalitikAB02038iyonik olmayan yüzey aktif madde
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinaz K, rekombinant, PCR SınıfıSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehitSigma AldrichP6148PFA
Sodyum KlorürThermoFisherS271NaCl
Magnezyum Klorür HekzahidratThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Hidroklorik Asit Çözeltisi, 1 NThermoFisherSA48HCl
Hidroklorik Asit Çözeltisi, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-MetilimidazolSigma Aldrich336092
N- (3-Dimetilaminopropil) -N′-etilkarbodiimid hidroklorürSigma Aldrich39391EDC
Hidrojen peroksit çözeltisi H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodyum sitrat dihidratSigma AldrichS1804Sodyum Sitrat
miRCURY LNA miRNA ISH Tampon Seti (FFPE)Qiagen339450karıştırma miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 algılama probuQIagenYD006157015'-DIG ve 3'-DIG etiketli
Levamisol hidroklorürSigma Aldrich31742
Sığır Serumu AlbüminiSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletleriSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Potasyum KlorürThermoFisherP217KCl
DAPI çözeltisi (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
Cam lamelThermoFisher12-545ECam lamel
Plastik lamelGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase içermeyen plastik lamel
Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçalarıSigma Aldrich11093274910DIG antikoru
Hidrofobik bariyer kalemVektör LaboratuvarlarıH-4000Pap kalem
Anti-Kardiyak Troponin T antikoruAbcamab92546cTnT antikoru
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Emilen İkincil Antikor, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011anti-tavşan-568 antikoru
Dako Floresan Montaj OrtamıDAKOS3023montaj ortamı
Koyun serumuSigma AldrichS3772
Keçi serumuSigma AldrichG9023
Deiyonize FormamidAmerikan BiyoanalitikAB00600
Hibridizasyon FırınıThermoFisherUVP HB-1000 Hibridizatör

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Related Articles