Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Özet

Burada, Drosophila larva sürekli termal degrade kullanarak tercih edilen ortam sıcaklığında belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Meyve sineği Drosophila melanogaster, dahil olmak üzere birçok hayvan onların tercih edilen termal manzara aramaya sağlayan çevre sıcaklığı, ayrımcılık dakika farklılıklar yeteneğine sahiptirler. Larva sıcaklık tercihleri üzerinde tanımlanmış bir doğrusal Aralık tanımlamak için biz bir sıcaklık gradyanı kullanarak bir tahlil geliştirilmiştir. Bir tek yönlü eğim kurmak için iki Alüminyum blok her biri bireysel blok sıcaklığını denetler bağımsız su hamama bağlanır. İki blok geçişin alt ve üst sınırlarını ayarlayın. Sıcaklık gradyanı plaka aralarındaki uzaklığı kapsaması su kontrollü iki blok ötede bir özel kaplamalı alüminyum levha koyarak kurulur. Su blok üst kısmında ayarlanır alüminyum plaka uçları minimum ve maksimum sıcaklık tanımlar ve bölgeler arasında doğrusal bir sıcaklık gradyanı iki blok oluştururlar. Degrade tahlil farklı yaş larva için uygulanabilir ve mutasyonlar TRP kanalları ve sıcaklık ayrımcılık için gerekli olan opsins, kodlama genler etkileyen olanlar gibi fenotipleri sergi mutantlar tanımlamak için kullanılan.

Giriş

Thermotaxis hareket eden hayvanlar tarafından en uygun koşulları^1,2,3bir ortam seçmek için istihdam edilmektedir. Eğer iklim aşırı sıcak veya soğuk, bu davranış yaşam için hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, birçok hayvan çok küçük rahat aralığında sıcaklık farklılıkları duyarlıdır ve çevresi ile ideal bir sıcaklık ararlar. Bu onların vücut ısısı çevre ile equilibrate meyve sinekleri gibi poikilothermic organizmalar için belirli önem taşıyor. Larva thermotaxis izlemek için deneyleri ve moleküler sensörler Drosophila geçici potansiyel reseptör (TRP) kanalları^4,5,6gibi rolleri açıklığa kavuşturulması enstrümantal oldunuz. rhodopsins^7,8ve ionotropic reseptör reseptörleri (IRS)⁹, hangi sıcaklık hassasiyeti ile bu hayvanların farklı sıcaklık aralıklarında bağışlamak.

Bir iki yönlü seçim test termal larvaları^6,7tercihlerinde çalışmaya bir yaklaşım sağlar. Tahlil iki farklı sıcaklık bölgeleri kurulması üzerine kuruludur ve hayvanlar üzerinde başka bir tarafı seçmek izin verir. Çift yönlü seçenek test sonuçlarından sağlam, özellikle sıcaklık iki seçenek arasında büyük farklar olabilir. Her tahlil sadece iki grup tabulating gerektirdiğinden, buna ek olarak, verileri bir basit tercih dizin olarak ifade edilebilir. Rahatlık ve kolaylık-in iki yönlü seçim deneyleri de genetik ekranlara mükellef bulunmaktadır. Ancak, büyük bir sınırlama birçok deney vahşi-türü veya mutant hayvanlar tercih edilen sıcaklığını kurmak için gerekli olmasıdır.

Degrade bir tahlil tercih edilen sıcaklık tek tahlil⁸' kurmak için bir fırsat sunuyor. Ayrıca, iki yönlü seçim test farklı olarak, bu hayvan, bir grup dağılımı değerlendirilmesi sıcaklıklar sürekli bir dizi ile karşı karşıya izin verir. Bir degrade tahlil bir petri ve tek hayvan kullanır ve bireysel hayvanlar¹⁰ayrıntılı davranışını karakterize için uygundur. Ancak, Petri yemekler yuvarlak olduğundan, sıcaklık bölgeleri boyutları değişir ve Merkezi'nden mesafeye göre aşamalı olarak daha küçüktür. Bu nedenle, bu kurulum nüfus hayvanların sıcaklığı seçimleri izlemek için ideal değildir.

Larva grupları sıcaklık tercihlerini değerlendirmek için uygundur sürekli bir termal degrade aparatı ve dikdörtgen bir arena istihdam burada açıklanmıştır. Aparatı oluşturmak ve montajı kolaydır. Buna ek olarak, gradyandaki doğrusal ve 42 ° C. 10 ° C arasında büyük sıcaklık aralıkları üzerinden thermotaxis değerlendirmek için kullanılabilir gibi esnektir Tahlil hızlı ve doğru sözlü gerçekleştirmek ve tekrarlanabilir veri verir. Larva tercih sıcaklığını raporlama yanı sıra, hayvan nüfusu tercihleri tek bir deneyde bir tüm doğrusal aralığında ortaya çıkarır. Bu avantajlar nedeniyle thermotaxis için gerekli genler tanımlamak için mükemmel bir seçimdir.

Protokol

1. ekipman imalat ve Montaj cihazları, degrade deneyleri için

1. Alüminyum tahlil plakaları tek yönlü degrade tahlil için imal.
   1. Trim ve her alüminyum tahlil plaka (Şekil 1A) alüminyum şerit testere kullanarak tek bir parça dışarı eziyet ve aşağıdaki boyutları ile dikey değirmen keskin: dış boyutu 140 x 100 x 9 mm ve iç boyutu 130 x 90 x 8 mm (Şekil 1B). Larvalar görselleştirmek ve pas önlemek kolaylaştırmak için siyah boya ile her tahlil plaka içine Eloksal.
      Not: Tek yönlü eğim için alüminyum tahlil plakaların imalat makinesi salonu tarafından yapılır. Anodization ticari bir satıcı tarafından gerçekleştirilir.
   2. Her tahlil plaka ile 13 demarcations, kalıcı bir kalem kullanarak 10 mm tarafından ayrılmış alt ve üst jantlar işaretleyin. İlk ve son demarcations 5 mm iç kenarından tahlil plakaların (Şekil 1A, B) yerleştirin.
2. Alüminyum tahlil plaka çift yönlü gradyan için imal etmek, bir alüminyum levha sac makası kullanarak aşağıdaki boyutları ile kesme: 250 x 220 x 2 mm. Eloksal siyah boya ile tahlil plakalar.
   Not: Çift yönlü degradeler için alüminyum tahlil plakaların imalat makinesi salonu tarafından gerçekleştirilir. Anodization ticari bir satıcı tarafından yapılır.
3. Alüminyum blok imal.
   Not: İki blok tek yönlü eğim için gerekli olan ve üç blok çift yönlü degrade için ihtiyaç vardır.
   1. Alüminyum blok (Şekil 1 c) alüminyum şerit testere (50 x 255 x 14 mm boyutlarında) kullanarak tek bir parçası uzak kesmek (Şekil 1 c, D).
   2. Matkap dikey bir değirmen ve iş parçacığı yiv açık biter bir tarafta (Şekil 1 d) kullanılarak su kanalı (7 mm içinde çap) bloktaki. Cıvata ve U şeklinde su kanalı (Şekil 1 c, D) oluşturmak için iplik mühür bandı ile yivli delikleri kapatın.
      Not: Alüminyum tahlil blok imalatı imalat tarafından gerçekleştirilir.
   3. Alüminyum blok (Şekil 1 d) konektöre vidaların ile düzeltmek ve iplik mühür bandı bir ucunda. Birden çok barbs ile diğer ucunu silikon (ID 1/4" x 3/8" x 1/16" duvar OD) boru içine sığacak.
4. Buzdolabında/ısıtmalı iki dolaşımdaki banyo almak.
5. Degrade tahlil sistemi için ısı kontrollü taşları bir araya getirin.
   1. Böylece her bloğu sıcaklığı bağımsız bir su sistemi (Şekil 2A) dolaşan tarafından kontrol edilir tek yönlü eğim için her iki alüminyum blokların ayrı su banyosu için bağlanma. Silikon tüp (ID 1/4" x 3/8" x 1/16" duvar OD) su banyosu çıkış Alüminyum blok (Şekil 2A) iç tarafında konektörüne bağlamak için kullanın. Ayrıca, boru su banyosu koya Alüminyum blok dış yan konektörüne bağlamak için kullanın.
   2. Çift yönlü gradyan için iki üç blok altında sol ve sağ taraflarındaki, plaka koyun ve onları aynı su banyosu (Şekil 2B) boru ile bağlanın. Üçüncü Alüminyum blok ikinci bir su banyosu ve yer aşağıda (Şekil 2B) plaka ortasına takın.
      Not: Eğer larvalar bir kenar veya diğer tek yönlü eğim bölgede birikir bu cihazları ve tahlil tek gerekli olan. Eğer öyleyse, olsun veya olmasın bir kenar efekti değerlendirmek önemlidir. Bu olasılığı sınamak için tek yönlü eğim (örneğin 18 ° C) kullanarak larva tarafından tercih edilen kenar bölge sıcaklık sıcaklık çift yönlü eğim (Şekil 3E tabak ortasında olduğu bir çift yönlü degrade oluşturmak , F).

2. larva eşitleme

1. Sinekler yumurta döşeme için kullanılacak besler.
   1. Mix Maya granül ve hamur maya yapmak bir havaneli ile distile su. İyice eziyet ve hamur tutarlılık fıstık ezmesi için benzer kadar karıştırın. Sinekler için taze ampul aktarırken pul, veya sinekler tuzak Yapıştır ıslak aşırı kuru hamur, kaçının.
   2. Bir havaneli ile kullanarak, Maya Yapıştır gıda yüzeyinin hemen üzerinde standart Drosophila şişeleri iç duvarları yakın ekleyin.
   3. Sayısı 12-35 kadın bir CO₂ yastık üzerinde (ama hayır daha--dan 10) yarım gibi birçok erkek için ve kadın ve erkek her Maya Yapıştır içeren flakon için ekleyin.
   4. Anında tutmak için Maya-hamur nemli, yemekle sinekler yemek yerken birleştirmek ilâ 100 şişe içeren 20 açık şişeleri ile distile su sadece tutan bir tepsi içinde bu tüpleri. Tepsiyi şeffaf plastik bir torbaya koyun ve kapatın.
   5. Böylece kadın yeterince, böylece çok sayıda yumurta bırakmaya sağlayarak beslenir tepsiyi 25 ° C kuluçka 48 h için kuluçkaya.
2. Tüpleri yumurta döşenmesi için ayarlayın.
   1. Beslenen sinekler üzerinden dokunarak yeni gıda tüpleri yumurta toplamak için içine aktarın. CO_2, sinekler aşağıdaki kısa süre penceresi üzerinde daha az yumurtlamak neden olabilir kullanmayın.
      Not: Standart Drosophila gıda tüpleri yumurta toplama için Maya Yapıştır kullanılır.
   2. Böylece tüm yumurta bir nispeten dar zaman pencere üzerinde toplanan 25 ° C'de 3 h için yumurtlamak sinekler izin.
      Not: Bu aynı gelişim aşamasında eşitlenecek larvalar sağlayacaktır.
   3. Su flakonluk tepsi içinde yumurta içeren şişeleri yerleştirin ve çanta sıkın. 25 ° c altında 12 s ışık: 12 kuluçkaya s karanlık döngüleri.
   4. Larvalar saat sonra yumurta (AEL) bağlı olarak larva sahne döşeme istenen belirli bir dizi için yaş.
      Not: Tablo 1 saat AEL ve sinek hisse senedi bağlı olarak değişir, larva sahne arasındaki ilişkinin bir tahmin olduğunu kullanılan, gıda sıcaklık AEL ve gelişimsel sahne kesin ilişkisi olması gerekir vb yetiştirme ağız kanca ve vızıltısı¹¹morfolojisi gibi fiziksel ölçütler kullanarak her araştırmacı tarafından doğrulanmadı.

3. Sıcaklık gradyanı Kur

1. Tek yönlü eğim hazırlamak
   1. Deneyleri sırasında bir nemli ortam ortam oluşturmak için iki su banyo 10 cm (Şekil 2A) tarafından ayrılmış ıslak kağıt havlu üzerinde bağlı iki Alüminyum blok yerleştirin.
   2. İki su banyo ~ 2 h equilibrate için alüminyum blokların sıcaklık için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatılıyor önce açın.
      Not: İstenen lineer sıcaklık gradyanı sağlanması için gerekli her su banyosu sıcaklığı belirlemek için sahte bir deney gerçekleştirmek için önerilir. Su banyoları ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 2' de listelenmiştir. Ancak, yüzey sıcaklıkları ortam sıcaklığı tarafından etkilendiğini unutmayın. Ayrıca etkiler boru uzunluğu sıcaklık olarak orada soğutma tüplerde. Bizim kurulumunda boru 1,5 m uzunluğundadır.
   3. % 1'özel, yüksek güçlü ayarında yuvarlak geniş ağız şişe 500 ml 100 mL mikrodalga ve 25 mL dökün/plaka üzerinde bir düzey benchtop tahlil. Alüminyum bloklar üzerinde aynı anda (Şekil 2A) yerleştirilen iki tahlil tabak hazırlamak.
   4. Sonra özel (10-20 dk) katılaşmış, böylece su üzerinde özel jel ilaçlama, düz ince su membran oluşturulur bir standart mutfak sünger veya özel yüzeyi biraz kaba olmak için bir Melamin Sünger ile her özel yüzey hafifçe ovalayın, ve hiçbir su damlacıkları oluşturacak.
   5. Tahlil plakaları kurumuş gelen önlemek için yapılması hazır olması ne kadar tamamen distile su ile bir kapta plakaları daldırın.
2. Bir çift yönlü eğim (isteğe bağlı) hazırlamak
   1. Deneyleri sırasında bir nemli ortam ortam oluşturmak için üç Alüminyum blok 8 cm arayla (Şekil 2B) ıslak kağıt havlu üzerine yerleştirin.
   2. İki su banyo ~ 2 h equilibrate için alüminyum blokların sıcaklık için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatılıyor önce açın.
      Not: Her su banyosu için çift yönlü degrade sıcaklığı belirlemek için sahte bir deney gerçekleştirmek için önerilir. Bazı tipik sıcaklık çift su banyoları ayarlamak için Tablo 3' te listelenir. Ancak, yüzey sıcaklıkları ortam sıcaklığı tarafından etkilendiğini unutmayın. Ayrıca etkiler boru uzunluğu sıcaklık olarak orada soğutma tüplerde. Bizim kurulumunda boru 1,5 m uzunluğundadır.
   3. Özel plaka dışarı dökülmesini önlemek için bir 10 mm-yüksek duvar (Şekil 2B) oluşturmak için teyp etiketleme ile alüminyum plaka kenarlarını sarın.
   4. Yüksek güç ayarı, mikrodalga 200 mL % 1'özel bir 500 ml kullanarak geniş ağız şişe yuvarlak ve 120 mL bir tahlil tabağa dökün.
   5. Her özel yüzey bir standart mutfak sünger veya özel yüzey üzerinde özel jel su püskürtme, düz ince su membran oluşturulur ki biraz kaba, yapmak için bir Melamin Sünger ile ve Hayır özel (~ 30 min) katılaşmış sonra hafifçe ovalayın su damlacıkları formu.
   6. Tahlil kurumasını engellemek için yapılması hazır olması ne kadar tamamen distile su ile bir kap içinde tahlil plakaları daldırın.
3. Tek yönlü eğim ayarla
   1. Reaktifler ve öğeleri ( Tablo reçetesigörmek) degrade tahlil aparatı yanında bir bankta hazırlayın.
   2. Verimli ısı transferi teşvik etmek, blok ve plaka arasında arayüz, su püskürtülerek Alüminyum blok ve tahlil plakaları arasındaki boşlukları doldurun.
   3. Eldiven kullanarak, tahlil plakaları su kapsayıcıdan kaldır. Su özel jel ve plaka arasında işgal etti ve yüzeyde darbe forma neden olursa, P1000 micropipette suyla kaldırın.
   4. Her iki kenarından 2 cm tam olarak vardır demarcations kenarları alüminyum blokların (Şekil 2A, C) eşleşecek şekilde tahlil Levha alüminyum bloklar üzerinde yerleştirin.
   5. Sprey su (özel yüzeyini örten bir ince su membran yeterli) plaka yüzeyine özel jel kurumasını önlemek için. Larva su damlacıkları tuzağa olsun bu yana su membran sürekli ve su damlacıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
   6. Degrade sistemi su buharlaşma azaltmak için bir karton kutu ile kapak ve jel yüzey sıcaklığını istikrara yardımcı. 5-10 dakika için sıcaklık equilibrate izin vermek bekleyin.
   7. Plaka (Şekil 2C) üzerinde 12 noktalarda yüzey sıcaklığını kontrol edin. Olup olmadığını bir bölgedeki değişkenlik kurmak için her bölgedeki iki ölçümler almak. Her iki noktalar sıcaklığında ± 0.2 ° C istenilen sıcaklık içinde olduğundan emin olun.
      Not: Alüminyum blok kenarına iki noktalar tam mesafeleri aynı değildir değişkenlik bir bölgedeki genellikle kaynaklanır. Her iki kenarından 2 cm tam olarak vardır demarcations kenarları alüminyum blokların eşleştiğinden emin olmak için alüminyum blok tabağa konumunu ayarlamak.
   8. Ölçülen sıcaklık değişimi istediğiniz degrade sapma, artırmak veya su banyo sıcaklığı setting(s) azaltmak ve su bath(s) sıcaklığını stabilize(s) sonra yüzey sıcaklığı tekrar kontrol.
   9. Bir karton kutu degrade sistemiyle tahlil başlangıç kadar kapsar.
4. Çift yönlü degrade kadar (isteğe bağlı) ayarla
   1. Reaktifler ve öğeleri ( Tablo reçetesigörmek) degrade tahlil aparatı yanında bir bankta hazırlayın.
   2. Sprey su verimli ısı transferi Alüminyum blok ötede tahlil plakaları yüzeyler arasındaki boşlukları doldurarak tanıtmak için üç Alüminyum blok yüzeylerde.
   3. Tahlil plakaları dikkatle su kapsayıcıdan kaldır ve alüminyum bloklar üzerinde yerleştirin. Özel jel ile çarpmak forma yüzeyde neden olabilir, plaka arasında su işgal P1000 micropipette suyla kaldırın.
   4. Böylece ilk ve son bölgeleri her iki kenarından midlines tam olarak iki yan alüminyum blok (Şekil 2B, D) kenarlarına uyacak tahlil plaka alüminyum bloklar üzerinde yer.
   5. Sprey su (özel yüzeyini örten bir ince su membran yeterli) plaka yüzeyine özel jel kurumasını önlemek için. Larva su damlacıkları tuzağa olsun bu yana su membran sürekli ve su damlacıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
   6. Degrade sistemi su buharlaşma azaltmak için bir karton kutu ile kapak ve jel yüzey sıcaklığını istikrara yardımcı. Equilibrate sıcaklık izin vermek için 5-10 dk bekle.
   7. Her 10 bölgeleri (Şekil 2B) orta hat boyunca iki noktalarda yüzey sıcaklığını kontrol edin. Olup olmadığını bir bölgedeki değişkenlik kurmak için her bölgedeki iki ölçümler almak. Her iki noktalar sıcaklığında ± 0.2 ° C istenilen sıcaklık içinde olduğundan emin olun.
      Not: Alüminyum blok kenarına iki noktalar tam mesafeleri aynı değildir değişkenlik bir bölgedeki genellikle kaynaklanır. Midlines ilk ve son bölgeleri her kenarı en yakın tam olarak iki yan alüminyum blokların kenarlarına uyacak emin olmak için alüminyum blok tabağa konumunu ayarlamak.
   8. Ölçülen sıcaklık değişimi istediğiniz degrade sapma, su banyo sıcaklığı setting(s) ayarlamak ve su bath(s) sıcaklığını stabilize(s) sonra yüzey sıcaklığı tekrar kontrol.
   9. Bir karton kutu bloklarla tahlil başlayana kapsar.

4. larva toplama ve yıkama

1. Temiz larva (seçenek 1) izole
   1. ~ 40 mL % 18 sükroz çözüm 50 mL tüp bebek için ekleyin. Gıda vial(s) bir scoopula ve transferi ile-% 18 sükroz çözüm bütün larva kepçe.
   2. Yavaşça bir scoopula larvalar yiyecek enkazı ayırarak ama iyice karıştırın. 30-60 s için tüp üst tabakası için larva kayan nokta kadar bekleyin. Larva (~ 10 mL) içeren üst tabaka için başka bir 50 mL tüp dökün ve tüp taze % 18 sükroz çözüm ile doldurun. 30-60 s için tekrar üst tabaka için larva kayan nokta kadar bekleyin.
      Not: Büyük yemek parçaları bazen birlikte larva transfer ve değil kaldırılırsa larva thermotaxis etkileyebilir. Büyük yiyecek parçacıklarının üst katmanda kalırsa, adımları 4.1.1-4.1.2 yinelemek veya bir scoopula kullanarak bunları el ile kaldırın.
   3. Larva (~ 10 mL) üst tabakası iki diğer 50 mL tüpler için aktarmak ve larva hızla suya lavabo iki tüp sükroz konsantrasyon azaltmak için distile su ile doldurun. Larvalar lavabo altına kadar 30-60 s için bekleyin. Larvalar boğulmaktan önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde bu ve aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   4. Daha fazla su mümkün olduğunca tüpler hafifçe eğerek atmak. Kalan su ile larva dökülen bir tüpün içine larva birleştirin ve tüp distile su ile doldurun.
   5. 30-60 s için tüm larvaların lavabo ve tüpler hafifçe eğerek mümkün olduğu kadar su kaldırın bekleyin. 2 - 4 kez tamamen kaldır sukroz ve tüm görünür yemek için bu çamaşır tekrarlayın.
   6. Su mümkün olduğunca daha fazla atın ve larvalar decanting tarafından bir boş 35 mm Petri kabına aktarmak. Tüp su ile sprey ve larva transferi yardım için küçük bir boya fırçası kullanın.
   7. Aşırı su Petri kabına P1000 micropipette kullanarak kaldırın. ~0.5 mL larva susuzluktan önlemek için su bırakın.
   8. Kapağı larvalar kaçan gelen önlemek için çanak yerleştirin. Baş aşağı larva küçük boşluk çıkış kapağı ve yemek arasında yeteneği azaltmak için kapağı açın. Larvalar 10-20 dk için kurtarmak izin verir.
2. Temiz larva (seçenek 2) izole
   Not: larva temizlik için bu alternatif yöntemi larvalar yıkama işlemi sırasında boğucu olasılığını açığının etkisini azaltır. Bu yöntemi kullanmak için yukarıdaki adımları 4.1.1-4.1.2 yaptıktan sonra aşağıdaki adımlara devam edin.
   1. Bir hücre süzgeç koyun (300 µm, larva 72 h AEL korur veya daha büyük) 50 mL tüp üstüne.
   2. Hiçbir yetişkin organları veya sukroz çözüm yüzeyinde yüzen gıda artıkları olduğunu onayladıktan sonra mesh ekrandaki bütün larva yakalamak için süzgeç aracılığıyla larva içeren üst tabaka dökün. 50 mL tüp doldurulana kadar larva distile su ile iyice yıkayın.
   3. Larva ve kullanılan su atmayın hücre süzgeç tüm tüpünden kaldırın. Boş tüp üzerine larva içeren süzgeç koyun ve 50 mL tüp doldurulana kadar larva tekrar distile su ile yıkayın.
   4. Süzgeç baş aşağı bir boş 35 mm Petri kabına açmak ve sprey su larvalar Petri kabına aktarmak için hücre süzgeç tepesinden. Küçük bir boya fırçası kullanarak kalan larvalar aktarın.
   5. Devam etmeden önce yukarıda 4.1.7 adım adım 5'e devam.

5. tahlil ve hesaplama

1. Çıkarmak belgili tanımlık karton kutu ve hemen plakasına larvalar aktarmadan önce jel yüzey sıcaklığını kontrol edin. Karton kutu sıcaklık denge etkilemesini önlemek için açık olduğu süreyi en aza indirmek. Yüzey kuru ise, sprey su küçük bir miktar yüzeyi.
2. Her plaka (bölgeler arasında 3 ve 4 6 bölgeleri dışında) için tek yönlü eğim (bırakma bölgesine; merkezine yakın 150 ± 50 larva dağıtmak Şekil 2C).
   Not: çift yönlü degrade için 200-400 larva her yarı orta bölge boyunca dağıtmak (Şekil 2B).
3. Mikroplaka kapak larvalar dışarı taramasını engellemek için her tahlil plaka üzerine getirin. Kur özel jel larva seçim etkileyebilir ışığa maruz önlemek için bir karton kutu ile kapak.
   Not: çift yönlü degrade için bir kapak ile plaka plaka daha büyük olduğu ve larvalar tercih edilen sıcaklığını Orta bölgesinde karşılamak gerekli olması gerektiği değil. Sonuç olarak, birkaç larva kenarlarında birikir ve sürünerek fırsatınız.
4. Tahlil için 10-30 dakika ve 15-35 dk larva (Tablo 4) yaş bağlı olarak çift yönlü gradyan için tek yönlü eğim için devam etmek izin verir.
5. Karton kutu ve Mikroplaka kapağı kaldırın. Bir dijital kamera ile yukarıda plakaları fotoğraf. Böylece araştırmacı olan daha iyi bir kontrast ve parlaklık analiz için seçebilirsiniz her tahlil plaka iki fotoğraf çekmek.
6. Tüm larvalar tahlil plakaları ve herhangi bir yeri plakaları dışında aspirasyon tarafından kaldırmak.
7. Tahlil tabaklar, tüpler ve hücre süzgeç distile su ile iyice temizleyin. Özel yüzeyi hasarlı sürece o gün hazırlanan tahlil levhaları yeniden.
8. Larva her bölge yüzde dağılımı hesaplayın.
   1. Fotoğrafik görüntü işaretler görüntüye eklemek verir herhangi bir yazılım kullanarak tahlil sonuçları açın. Tahlil bölgeleri belirtmek için her 2 cm demarcations tahlil plaka üzerinde temel alan dikey çizgiler çizin.
   2. Larva her bölge saymak ve sayıları kaydetmek. Larva bölgelerde herhangi bir duvar 0.5 cm dikkate alınmaz. Jel duvarlar kalındır ve yüzey sıcaklıkları bu bölgelerde doğrusal değildir.
   3. Tek yönlü eğim için her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplar:
      (verilen 2 cm bölgesinde larva sayısı) / (Toplam sayısı 6 bölgelerinde larva) x 100.
   4. Çift yönlü degrade için her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplar:
      (verilen 2 cm bölgesinde larva sayısı) / (larva geçişin her tarafta 5 bölgelerinde toplam sayısı) x 100.

Sonuçlar

Bir 18 ° C - 28 ° C tek yönlü kurmak için degrade, biz iki su banyo sıcaklıklarında 16.8 ° C ile 31 ° c için ayarla Biz 13 puan sıcaklıklarda tüm 6 bölgeler, bölgeler arasında kenarlık çizgisi üst ve alt bölümleri içinde 26 pozisyonlarda ve özel jel yüzeyi (Şekil 2C, 2E) aşırı ucundaki sıcaklık ölçülerek elde. Sıcaklık dağılımı degrade boyunca yaklaşık doğrusal (Y 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961 =) (Şekil 2E

Tartışma

Bu protokolü başarılı olmasını sağlamak için larva deneyler yapmak için yeterli sayıda elde etmek için ilgili adımları uygulamak önemlidir. Bu Maya tüpler için 2-3 yumurta atarken geliştirmek d Yapıştır içeren sinekli ön besleme içerir. Şişeleri su şişeleri içeren bir tepsiye yerleştirilir ve gıda nem korur ve etkili tarafından larvaları besleme iken normal koyu döngüleri maruz izin teşvik şeffaf plastik bir torbaya alınmış gerekir. Ancak, Maya Yapıştır sinekler tuzak haline çok yumuşak olmamalıdır. Kadın başına şişe üze...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gradyan tahlil aparatı
PolyScience 9106, Soğutmalı/Isıtmalı 6L Sirkülasyon Banyosu	Thomas Scientific	9106	Bu modelin üretimi durdurulmuştur. Güncellenen yedek modeller şunları içerir: 120 V, 60 Hz veya 1184L08 için 1186R00 ve 1197U04 ve 240 V, 50 Hz için 1197U04.
Alüminyum tahlil plakası (tek yönlü gradyan için)			Dış boyut: 14 x 10.1 x 0.9 cm, iç boyut: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, siyah eloksallı.
Alüminyum levha (çift yönlü gradyan için)			25 x 22 x 0,2 cm, siyah eloksallı.
Alüminyum blok			Dış boyut: 25,5 x 5 x 1,4 cm, iç kanalların parametreleri Şekil 1D'de gösterilmiştir.
Alüminyum bloklar ve borular için konektör	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sıhhi Silikon Boru	Tygon	57296	1/4 "ID x 3/8" OD x 1/16 " duvar
< güçlü > Adı< / güçlü >	< güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar<
>< güçlü > Öğeler ve tahlil için reaktifler
Pestle	USA Scientific	17361	1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri için havaneli
Termometre	Fluke	51II
Termokupl	Fluke	K tipi
Üniversal mikroplaka kapağı	Corning	6980A77
35 mm çanak	Corning	9380D40
Etiketleme bandı (çift yönlü gradyan için)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand etiketleme bandı 2 inç x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	%1 çözelti hazırlayın
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Teste başlamadan hemen önce %18'lik çözelti hazırlayın
Boya fırçası	Fisher Scientific	11860
50 mL santrifüj tüpleri	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL yuvarlak geniş ağızlı şişe	Pyrex	1395-500
Hücre süzgeci (300 mm gözenek)	PluriSelect	43-50300	Larva yıkama için isteğe bağlı ürün
Karton kutu (flakon tepsisi)	Genesee Scientific	FS32-124
Adı	>Company<	strong>Katalog Numarası	Comments
Drosophila food
Damıtılmış su			22.400 mL
Mısır unu, sarı (ekstra ince ağ, floklu) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1.609 g
Bira mayası 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Soya Unu (10 kg/adet)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Tip II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo hafif mısır şurubu	Karo		1.700 mL
Metil 4-hidroksibenzoat (200 geçirmez etanol içinde süspansiyon)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propiyonik asit saflığı. pa,>%99,5 (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Fosforik asit  ACS reaktifi, > H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL'de	8.5