Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu

Memeli sinir sisteminde miyelin hızlı sinir iletim ve aksonal bütünlüğü axon lifleri çok katmanlı zar kılıfı ile enwrapping tarafından sağlar. Çok katmanlı yapısı nano ince plazma zarı oluşur filimler alternatif oluşmaktadır (~ 5 nm), sitozol (~ 3 nm) ve hücre dışı alanlarda (~ 7 nm)^1,2. Optik mikroskobu son süper çözünürlük mikroskobu, dahil olmak üzere, nano miyelin dinamikleri nedeniyle optik kırınım^3,4,5onların yetersiz çözünürlük nedeniyle gözlemlemek için uygun değildir. Elektron mikroskobu miyelin nanostructure ince detaylar sağlamasına karşın, kimyasal fiksasyonu ve ultrasectioning^{6,7 içeren son derece invaziv örnek hazırlıkları nedeniyle yaşayan biyolojik sistemler ile uyumlu.} . Yakın zamana kadar ortada hiçbir teknik myelinated akson içinde in situdinamikleri nano gözlemlemek için uygulanabilir.

Schain ve ark. daha önce myelinated akson renkli ışık yansıma⁸sergi bildirdi. Yansıyan ışık spektroskopik analizine benimseyerek, yeni bir görüntüleme yöntemidir myelinated akson, spektral reflectometry (SpeRe)⁹adlı nano görüntüleme için tasarladılar. SpeRe miyelin Kılıf (Şekil 1) çok katmanlı yapısı içinde meydana gelen ince film girişim temel alır. Çeşitli aksonlar üzerinde optik simülasyon tarafından biz-si olmak kâşif yansıma spektrum wavenumber ve onun periyodik olarak periyodik bir fonksiyonudur () akson çapı (d) ters orantılıdır. Bu basit ilişki () akson çapı facile miktar SpeRe verileri sunar. Bu kullanmak, hafif travmatik beyin hasarı bizim önceki rapor altında şişkin yaygın axon ortaya koydu.

SpeRe sistemi confocal mikroskobu dayanmaktadır ve özel Lazer kaynağı oluşur ve filtreler (Şekil 2). Geniş bant spektral çıkış için kızılötesi bölgeleri görünür sağlayan bir beyaz ışık lazer giriş kaynağıdır. Spektral tarama sistemi iki acousto optik cihazlarla donatılmıştır: Seçili yol gösterici yansıyan için seçili bir dalga boyu giriş geniş bant kaynağı ve bir acousto-optik ışın splitter (AOBS) teslim etmek için bir acousto-optik ayarlanabilir filtresi (AOTF) belgili tanımlık bulmak için dalga boyu. Hyperspectral confocal mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek) sırayla çeşitli giriş dalga boylarında, yansıma görüntüleri elde etmek için özelleştirilebilir spektral tarama seçeneği sunar. Buna ek olarak, renk sapmaları eleştirel spektral ölçüm engelleyebilir; Bu nedenle, bir apochromat objektif lens kullanılması tavsiye edilir.

Dikkat, beyaz ışık lazerler düzensiz bir spektral çıktı üretmek ve optik bileşenleri de spektral profil etkiler. Bu nedenle, alınan spectra sonraki kantitatif analiz için ayarlanması gerekir. Korumalı bir gümüş ayna genellikle tam görünür bölge üzerinde hemen hemen sürekli yansıma (> % 97'si) sağlayan bir başvuru olarak kullanılır. Edinsel spectra sonra ayna üzerinden başvuru spectra tarafından ayrılır.

Spektral tarama için spektral adım boyu edinme hızını belirler; Bu nedenle, optimize edilmiş olması gerekir. Bir daha yüksek spektral dönemi büyük bir akson vardır gibi ince spektral örnekleme gerektirir. Örneğin, bir akson 10 µm, en büyük fizyolojik aksonlar biri büyüklüğündeki bir spektral ~ 8 vardır nm. Nyquist örnekleme ölçüt uygulayarak, çalıştırmaya başladık spektral örnekleme aralığı 4 nm fare sinir dokularında fizyolojik aksonlar kapsayacak. Bu yaklaşım genellikle birkaç saniye boyunca tam spektral tarama devre dışı bırakır ve böylece nerede fizyolojik hareket (Örneğin solunum ve kalp atışı) istikrarlı spektral edinme müdahale vivo uygulamaları için uygun değildir. Daha önce bu sorunu bir dizi spektrometre (satın alma hızı ≈ 30 ms her piksel için) kullanarak her noktası için tam spektrum elde etmek için tasarlanmış özelleştirilmiş dik mikroskop, işaretleme tarafından çözüldü.

Bu raporda, biz SpeRe görüntüleme bir ticari hyperspectral mikroskobu gerçekleştirilebilir bir sabit beyin dilim üzerinde detaylı bir protokol tanımlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Böylece, protokol Denemecileri optik Araçları'nda uzmanlık olmadan tarafından tamamlanabilir. Biz de olası sorunları ve satın alma ve SpeRe veri analizi için sorun giderme kapsar.

Tüm cerrahi işlemler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Sungkyunkwan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. numune hazırlama

Not: Otoklav hayvan işleme önce tüm cerrahi aletler. Cerrahi işlemler için özel bir odada tüm cerrahi performans kuralları. Steril Cerrahi Önlük ve eldiven cerrahi odasında tüm personeli tarafından her zaman giyilmelidir.

1. Doku fiksasyon
   1. Her fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve % 4 paraformaldehyde (PFA) PBS ile dolu iki 10 mL şırınga hazırla.
   2. 7-12-hafta-yaşlı fare, (C57BL/6J veya herhangi bir fare çizgi ya cinsiyet ile) zoletil ve xylazine (1:1, 20 mg/kg) veya (Örneğin, 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg karışımı bir alternatif uygun anestezi rejimi karışımı yönetmek anestezi xylazine) mayi iğne ile.
   3. Fare anestezi (ayak çimdik-yanıt yöntemi kullanın) cerrahi uçağa ulaştı sonra kalp makasla keserek cilt ve göğüs kafesi maruz.
   4. Sağ atrium kanı ve bir iğne ile PBS ve İngiltere'de yılın solution'ı sırayla sol ventrikül sıvı küçük makas ile makasla kesme (perfüzyon oranı 4 mL/dk, birim = her çözüm için 10 mL =).
      Not: Fare yordamı başarıyla tamamlanırsa sert olur. Göz merhem veya sterilizasyon yordamı terminal olduğu gibi gerekli değildir. Fiksasyon işlemi atlanabilir. Ancak, bu adımı yapısal deformasyonlar mekanik doku hasarı ve iskemik aksonal şişme gibi en aza indirmek için tavsiye edilir. Doku fiksasyon hakkında daha fazla ayrıntı için Gage, G. J. vd tarafından makaleye başvurun ¹⁰
2. Beyin dilim hazırlanması
   1. Fare aracılığıyla ventral göğüs ve karında cerrahi makas ile başını kesmek.
   2. Kafa derisi ve kafatası tamamen açığa kadar uygun küçük bir makas kullanarak kapaklarini kaldırın.
   3. Frontal kemik kırmak ve kafatası beyin zarar vermemesi için özenle küçük makas kullanarak oksipital kemikten sagittal dikiş boyunca kesti.
   4. Yavaşça kafatası ve dura mater sırayla iyi forseps kullanarak çıkarın.
   5. Beyin doku zarar vermemeye dikkat çekici bir yumuşak plastik kaşık kullanarak ayıklayın.
   6. Durulama ve % 4 İngiltere'de yılın çözüm 4 ° C'de 30 dk için ayıklanan beyinde emmek
   7. Sabit beyin 100 – 150 µm bölüme bir vibratome kullanma dilim.
      Not: doku hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı için makalesine bakın tarafından Segev vd. ¹¹. sonraki işlemler için doku bölümlere spacer kalınlığı ince dilimlenmiş.
3. Beyin dilim montaj
   1. 2 kare kapak gözlük (22 × 22 × 0,17 mm) ve 1 cam slayt her doku dilim için hazır olun.
   2. Bir kare kapak gözlük ikiye ayırmak (iki dikdörtgen parça) bir cam kesici kullanarak.
   3. İki süper yapıştırıcı kullanarak slayt camına yarıya kapak bardak ekleyin.
      Not: İki yarıya gözlük arasındaki boşluk biraz doku dilim boyutundan daha büyük olmalıdır.
   4. Bir fırça veya bir pipet kullanarak beyin dilim hasat ve spacer arasında slayt cam doku yatıyordu. Doku kat değil için dikkat ediniz.
   5. PBS 100 μL doku yüzeyi dağıtmak.
   6. Diğer kare kapak cam doku üstüne yerleştirin. Hava kabarcıkları eklenmesi bu aşamasında kaçının.
   7. PBS buharlaşma ve diğer yabancı maddelerden toz tarafından sonraki görüntüleme oturumu sırasında önlemek için tırnak cilası (veya alternatif olarak uygun yapıştırıcılar) kullanarak kapak cam etrafında mühür.
      Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.

2. Kalibrasyon

1. Mikroskop en az 1 h geçiş ( Tablo malzemelerigörmek) lazer termal stabilizasyon izin vermek için önce görüntüleme kaynak. Sonra spektral tarama ( Tablo malzemelerigörmek) için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve üst kısmında GUI (Şekil 3a). Al düğmesini tıklatın
2. Beyaz ışık lazer (WLL) ve photomultiplier tüp (PMT) (Şekil 3a) için yazılım çekim açın.
3. Aşağı açılan listedeki xyΛ modu içinde Satın alma moduseçin ve sonra lazer giriş modu otomatik olarak Sabit güçiçin sürekli yüzde değiştirilir. Otomatik SPhareketinin onay kutusundaki işareti kaldırın. Ve sonra 470-670 nm ve spektral adım boyu 4 giriş lazer spektral pencere ayarlayın nm ΛTarih-uyarma Lambda tarama ayarları (Şekil 3b).
4. Devresel_ödeme spektral Aralık çift tıklatarak veya spektral Aralık (Şekil 3 c) için ayar çubuğu hareket 450-690 için ayarlayın.
   Not: Bu spektral Aralık tam bant genişliği giriş kaynağı içermelidir.
5. Bir su-daldırma objektif lens, yüksek bir sayısal diyafram ile uygun seçin (NA > 0,7) ve devresel ödeme ve lazer güç için AOBS yapılandırma ve Live tarama düğmesini etkinleştirmek için herhangi bir değer vermek. Optik yol anahtarını belirtmezseniz AOBS yapılandırma (şekil 3d) yansıma kontrol ederek.
6. Bir başvuru ayna monte ( Tablo malzemelerigörmek) mikroskop sahnede. Ayna yüzey objektif lens karşı karşıya. Eğer ayna mikroskop sahneye koymak kolay değil, bir ayna üzerine düz plaka (Örneğin slayt cam) bağ.
7. Denetim odak düzlem ayna yüzeyine hizalamak için mikroskop sahne.
8. Devresel_ödeme kazanç ve dedektör dinamik aralığını dikkate alınarak lazer güç ayarlamak ve sonra sürekli yüzde Sürekli güçiçin lazer giriş modunu değiştirin.
   Not: tipik olarak, bir devresel ödeme kazanmak 500 (V) ve göreceli lazer güç % 0.1 570 kullanılır nm.
9. Dalga boyu aralığı boyunca hiçbir doygunluk olup olmadığını denetlemek için bir sahte renk modunda onaylayın. Doygunluk gözlem yapılırsa, lazer güç (Şekil 3a) indir.
10. Lambda tarama edinme çalıştırın.
11. Sahne Alanı'ndan, yansıtmayı kaldırma ve karanlık başvuru (yani, karanlık sapma) elde etmek için bir örnek olmadan aynı edinme tekrarlayın.
12. Veri Multistacked TIF biçiminde kaydedin.

3. SpeRe resim alma

1. Bağlı doku mikroskop sahnesinde yerini. Kabaca dokusu objektif lens odak düzlemi ile hizalamak için bir göz-parça aracılığıyla geniş alanlı floresans modunu kullanın.
2. Odak düzlemi doku ilgi bölgesine hizalamak için Live inceden inceye gözden geçirmek ile denetim mikroskop sahne üzerinde. Kapak notu arka plan gürültü önlemek için cam doku arabirimden en az 15 μm kalınlığında derinlik hedef bölgeyi seçin.
3. 2.1-2,10 adımlarda açıklandığı gibi aynı yordam kullanılarak hedef bölge için spektral görüntü yığını elde etmek.
4. İçin doku ve karanlık ofset Multistacked TIF biçiminde kaydedin.
   Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.

4. görüntü işleme ve analiz

1. Başvuru ayna ve beyin dokusu için spektral verileri (multistacked TIF) ImageJ içinde açın.
2. ROIs (faiz bölgelerinde) için açılan görüntü yığınları seçin — başvuru ayna ve bir akson elyaf beyin dokusu için segment için merkez alan.
3. Ham spectra seçili ROIs için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.
4. Karanlık mahsup verileri, bir başvuru ayna ve diğer alınan beyin dokusu için alınan açın.
5. Spectra karanlık uzaklıklar için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.
6. Edinsel spectra kopyalama ve yapıştırma seçenekleri kullanarak kaydedin.
   Not: SpeRe görüntüleme için eksen dışı optik anomalileri en aza indirmek için merkezi görüntüleme alanının kullanımı önerilir. Axon lifleri yapısal olarak kendi uzunluğu boyunca heterojen olabilir. Bu nedenle, yatırım getirisi bir küçük axon kesimindeki seçerek, genellikle < 5 µm, kısmi hacimli eserdir en aza indirmek için tavsiye edilir.

5. temel düzeltme ve SpeRe Sinyal Analizi

1. Başvuru ayna ve beyin dokuları spectra dan mahsup spectra çıkarma.
2. Her spektrum yelpazenin en fazla yoğunluk bölerek normalize.
3. Axon normalleştirilmiş spektrum referans ayna normalleştirilmiş spektrum tarafından bölmek ve normalleştirilmiş spektrum DC ofset çıkarın.
4. Wavenumber frekans sinüsoidal bir için edinsel spektrum yaklaştırarak ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) eğri ve sonra alınan wavenumber alarak karşılıklı tarafından periodicity için dönüştürün.
5. Wavenumber periyodik olarak Şekil 4 cdenklemi kullanarak akson çapı dönüştürün.

Protokole göre bir sabit beyin dilim eksojen boyama ile miyelin hedefleme fluorophore hazırlanan ( Tablo malzemelerigörmek). SpeRe görüntüleme (Şekil 4a) görüntüleme confocal floresan ile birlikte ticari hyperspectral confocal mikroskop kullanarak beyin dilim üzerinde gerçekleştirildi. SpeRe için giriş optik yoğunluğu 5 µW/µm2 ~ 1 µs piksel topla temas süresi ile ayarlandı. Bu hafif doz bir-in-büyüklük üzerinde ise geleneksel floresan confocal mikroskobu12' den daha düşük. ~ 17 alır üzerinden spektral tarama için s 4 aralığını nm'de 470-670 nm (51 resimler).

SpeRe sinyal myelinated akson merkezi optik yansıma geometri tarafından beklendiği gibi yerelleştirilmiş. Bir akson kesimini yansıma spektrum daha sonra akson çapı (Şekil 4b, c) dönüştürüldü wavenumber periyodik olarak alındı. SpeRe tarafından ölçülen çap iyi anlaşma ile floresan tabanlı ölçüm (Şekil 4 d) bulundu. Artık küçük hata ya geometrik kırınım-sınırlı çözünürlük floresans tabanlı yöntemi veya eksik kökenli SpeRe için model.

SpeRe görüntüleme optik yansıması dayanır, böylece bir silika tabanlı coverslip bir önemli arka plan paraziti üretebilir. Coverslip üzerinden görüntüleme derinliği az 5 mikron ancak görüntüleme derinliği 15 µm (Şekil 5) büyük olduğunda kaçınılması bizim Optik Kurulum, arka plan gürültü önemli idi.

Resim 1 : SpeRe prensibi. Myelinated akson çok katmanlı bir ince film yapısı vardır. Olay ışık kısmen kapalı arabirimleri Fresnel'ın yasalarca tanımlandığı gibi yansıtılır. Bunlar ışık dalgalarını birbirine karışmasına yansıyan; Bu nedenle, sonuç yansıyan ışık nanostructural bilgi kodlar. Spektral Reflectometry (SpeRe) nanostructural bilgi myelinated akson yansıtılan ışıktan çözerek elde eder. Bu rakam Kwon, J. ve ark. yayımlanmaktadır 9 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : SpeRe sistem yerleşimini. SpeRe sistem confocal yansıma mikroskobunun dayanmaktadır. Spektral tarama için üç ek bileşen uyarma yol boyunca ihtiyaç vardır: (1) bir supercontinuum lazer, (2) acousto-optik ayarlanabilir filtresi (AOTF) ve (3) acousto-optik ışınla splitter (AOBS). Geniş bant Lazer kaynak hayalice dar bant genişliği ile seçilen bir dalga iletimi için AOTF tarafından filtre uygulanır. AOBS bir ışın ayırıcı örnek için uyarma ışık kılavuzu seçilen dalga boyu için işlev görür. O zaman olay örneği Galvanometrik bir tarayıcı ve bir objektif lens aracılığıyla nurudur. Örnekten yansıyan ışık descanned, dağınık şekilde confocal bir iğne deliği tarafından filtre ve photomultiplier tüp (PMT) tarafından toplanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Yazılım kurulumu. (bir) grafik kullanıcı arabirimi (GUI). Ana penceresinde, esas olarak beş alt paneller vardır: düşsel Kur, lazer Kur, optik kurulum, dedektör kurulum ve resim görüntüleyici. (b) görüntüleme modunu seçmek için damla-aşağı yemek listesi. SpeRe için xyλ seçilir. (c) dedektörü için spektral penceresi ayarlamak için belgili tanımlık kapı aynası. (d) acousto-optik ışın Bölümlendiricinin (AOBS) ayarı için panel. 'Yansıma' yansıyan ışık bulmak-e doğru kılavuz için seçilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Bir beyin dokusu üzerinde SpeRe. (bir) A SpeRe görüntüsünü bir fare beyin dokusu ile floresan miyelin (fluoromyelin) counterstaining lekeli. (b) A temsilcisi yansıma spektrum elde edilen beyaz kesikli kutusundan içinde (a). (c) spektral periodicity üzerinden akson çapı tahmin etmek için bir simüle başvuru eğrisi. Mavi yıldız (b) elde edilen veri noktasıdır. (d) Floresan yoğunluk kutulu bölgesinden enine profil içinde (a). Floresans sinyal kullanarak tahmin miyelin dış çapı ~ 760 olduğunu nm, de SpeRe ölçüm ile kabul eder. Artık makul floresans tabanlı ölçüm kırınım hatadan hatadır. Scalebar, 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Bir kapak notu etkisi. (bir, b) Yansıma görüntüleri aynı lateral pozisyonda beyin dokusunun farklı derinliklerde doku-coverslip arabirimi üzerinden satın aldı: 3 µm (a) ve 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar rakip mali çıkarlarının ilan: J. Kwon ve M. Choi mucitler Bu makalede açıklanan patent bekleyen teknoloji vardır.