Burada, myelinated aksonlar üzerinde spektral reflectometry dayalı teknik görüntüleme bir etiket ücretsiz Nano kullanarak sabit beyin dilim içinde görüntüleme için adım adım bir iletişim kuralı mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli bir sinir sisteminde miyelin axon lifler çok katmanlı bir sarmal içinde enwrapping tarafından bir elektrikli yalıtım sağlar. Son derece organize hücre altı mimarisi esinlenerek, biz son zamanlarda geliştirilen canlı myelinated akson içinde in situbenzeri görülmemiş etiket ücretsiz Nano görüntüleme sağlayan spektral reflectometry (SpeRe), adlı yeni bir görüntüleme yöntemidir. Temel prensibi çok katmanlı hücre altı yapısı yansıma spektrum analiz ederek nanostructural bilgi elde etmektir. Bu makalede, biz bir temel SpeRe görüntüleme bir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir bir filtre ile donatılmış bir ticari confocal mikroskobik sistemiyle sinir dokuları gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım protokol tanımlamak. Biz numune hazırlama, spektral verileri ve görüntü nanostructural bilgi almak için işleme yordamları kapsar.
Giriş
Memeli sinir sisteminde miyelin hızlı sinir iletim ve aksonal bütünlüğü axon lifleri çok katmanlı zar kılıfı ile enwrapping tarafından sağlar. Çok katmanlı yapısı nano ince plazma zarı oluşur filimler alternatif oluşmaktadır (~ 5 nm), sitozol (~ 3 nm) ve hücre dışı alanlarda (~ 7 nm)1,2. Optik mikroskobu son süper çözünürlük mikroskobu, dahil olmak üzere, nano miyelin dinamikleri nedeniyle optik kırınım3,4,5onların yetersiz çözünürlük nedeniyle gözlemlemek için uygun değildir. Elektron mikroskobu miyelin nanostructure ince detaylar sağlamasına karşın, kimyasal fiksasyonu ve ultrasectioning6,7 içeren son derece invaziv örnek hazırlıkları nedeniyle yaşayan biyolojik sistemler ile uyumlu. . Yakın zamana kadar ortada hiçbir teknik myelinated akson içinde in situdinamikleri nano gözlemlemek için uygulanabilir.
Schain ve ark. daha önce myelinated akson renkli ışık yansıma8sergi bildirdi. Yansıyan ışık spektroskopik analizine benimseyerek, yeni bir görüntüleme yöntemidir myelinated akson, spektral reflectometry (SpeRe)9adlı nano görüntüleme için tasarladılar. SpeRe miyelin Kılıf (Şekil 1) çok katmanlı yapısı içinde meydana gelen ince film girişim temel alır. Çeşitli aksonlar üzerinde optik simülasyon tarafından biz-si olmak kâşif yansıma spektrum wavenumber ve onun periyodik olarak periyodik bir fonksiyonudur (
) akson çapı (d) ters orantılıdır. Bu basit ilişki (
) akson çapı facile miktar SpeRe verileri sunar. Bu kullanmak, hafif travmatik beyin hasarı bizim önceki rapor altında şişkin yaygın axon ortaya koydu.
SpeRe sistemi confocal mikroskobu dayanmaktadır ve özel Lazer kaynağı oluşur ve filtreler (Şekil 2). Geniş bant spektral çıkış için kızılötesi bölgeleri görünür sağlayan bir beyaz ışık lazer giriş kaynağıdır. Spektral tarama sistemi iki acousto optik cihazlarla donatılmıştır: Seçili yol gösterici yansıyan için seçili bir dalga boyu giriş geniş bant kaynağı ve bir acousto-optik ışın splitter (AOBS) teslim etmek için bir acousto-optik ayarlanabilir filtresi (AOTF) belgili tanımlık bulmak için dalga boyu. Hyperspectral confocal mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek) sırayla çeşitli giriş dalga boylarında, yansıma görüntüleri elde etmek için özelleştirilebilir spektral tarama seçeneği sunar. Buna ek olarak, renk sapmaları eleştirel spektral ölçüm engelleyebilir; Bu nedenle, bir apochromat objektif lens kullanılması tavsiye edilir.
Dikkat, beyaz ışık lazerler düzensiz bir spektral çıktı üretmek ve optik bileşenleri de spektral profil etkiler. Bu nedenle, alınan spectra sonraki kantitatif analiz için ayarlanması gerekir. Korumalı bir gümüş ayna genellikle tam görünür bölge üzerinde hemen hemen sürekli yansıma (> % 97'si) sağlayan bir başvuru olarak kullanılır. Edinsel spectra sonra ayna üzerinden başvuru spectra tarafından ayrılır.
Spektral tarama için spektral adım boyu edinme hızını belirler; Bu nedenle, optimize edilmiş olması gerekir. Bir daha yüksek spektral dönemi büyük bir akson vardır gibi ince spektral örnekleme gerektirir. Örneğin, bir akson 10 µm, en büyük fizyolojik aksonlar biri büyüklüğündeki bir spektral ~ 8 vardır nm. Nyquist örnekleme ölçüt uygulayarak, çalıştırmaya başladık spektral örnekleme aralığı 4 nm fare sinir dokularında fizyolojik aksonlar kapsayacak. Bu yaklaşım genellikle birkaç saniye boyunca tam spektral tarama devre dışı bırakır ve böylece nerede fizyolojik hareket (Örneğin solunum ve kalp atışı) istikrarlı spektral edinme müdahale vivo uygulamaları için uygun değildir. Daha önce bu sorunu bir dizi spektrometre (satın alma hızı ≈ 30 ms her piksel için) kullanarak her noktası için tam spektrum elde etmek için tasarlanmış özelleştirilmiş dik mikroskop, işaretleme tarafından çözüldü.
Bu raporda, biz SpeRe görüntüleme bir ticari hyperspectral mikroskobu gerçekleştirilebilir bir sabit beyin dilim üzerinde detaylı bir protokol tanımlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Böylece, protokol Denemecileri optik Araçları'nda uzmanlık olmadan tarafından tamamlanabilir. Biz de olası sorunları ve satın alma ve SpeRe veri analizi için sorun giderme kapsar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm cerrahi işlemler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Sungkyunkwan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. numune hazırlama
Not: Otoklav hayvan işleme önce tüm cerrahi aletler. Cerrahi işlemler için özel bir odada tüm cerrahi performans kuralları. Steril Cerrahi Önlük ve eldiven cerrahi odasında tüm personeli tarafından her zaman giyilmelidir.
-
Doku fiksasyon
- Her fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve % 4 paraformaldehyde (PFA) PBS ile dolu iki 10 mL şırınga hazırla.
- 7-12-hafta-yaşlı fare, (C57BL/6J veya herhangi bir fare çizgi ya cinsiyet ile) zoletil ve xylazine (1:1, 20 mg/kg) veya (Örneğin, 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg karışımı bir alternatif uygun anestezi rejimi karışımı yönetmek anestezi xylazine) mayi iğne ile.
- Fare anestezi (ayak çimdik-yanıt yöntemi kullanın) cerrahi uçağa ulaştı sonra kalp makasla keserek cilt ve göğüs kafesi maruz.
- Sağ atrium kanı ve bir iğne ile PBS ve İngiltere'de yılın solution'ı sırayla sol ventrikül sıvı küçük makas ile makasla kesme (perfüzyon oranı 4 mL/dk, birim = her çözüm için 10 mL =).
Not: Fare yordamı başarıyla tamamlanırsa sert olur. Göz merhem veya sterilizasyon yordamı terminal olduğu gibi gerekli değildir. Fiksasyon işlemi atlanabilir. Ancak, bu adımı yapısal deformasyonlar mekanik doku hasarı ve iskemik aksonal şişme gibi en aza indirmek için tavsiye edilir. Doku fiksasyon hakkında daha fazla ayrıntı için Gage, G. J. vd tarafından makaleye başvurun 10
-
Beyin dilim hazırlanması
- Fare aracılığıyla ventral göğüs ve karında cerrahi makas ile başını kesmek.
- Kafa derisi ve kafatası tamamen açığa kadar uygun küçük bir makas kullanarak kapaklarini kaldırın.
- Frontal kemik kırmak ve kafatası beyin zarar vermemesi için özenle küçük makas kullanarak oksipital kemikten sagittal dikiş boyunca kesti.
- Yavaşça kafatası ve dura mater sırayla iyi forseps kullanarak çıkarın.
- Beyin doku zarar vermemeye dikkat çekici bir yumuşak plastik kaşık kullanarak ayıklayın.
- Durulama ve % 4 İngiltere'de yılın çözüm 4 ° C'de 30 dk için ayıklanan beyinde emmek
- Sabit beyin 100 – 150 µm bölüme bir vibratome kullanma dilim.
Not: doku hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı için makalesine bakın tarafından Segev vd. 11. sonraki işlemler için doku bölümlere spacer kalınlığı ince dilimlenmiş.
-
Beyin dilim montaj
- 2 kare kapak gözlük (22 × 22 × 0,17 mm) ve 1 cam slayt her doku dilim için hazır olun.
- Bir kare kapak gözlük ikiye ayırmak (iki dikdörtgen parça) bir cam kesici kullanarak.
- İki süper yapıştırıcı kullanarak slayt camına yarıya kapak bardak ekleyin.
Not: İki yarıya gözlük arasındaki boşluk biraz doku dilim boyutundan daha büyük olmalıdır. - Bir fırça veya bir pipet kullanarak beyin dilim hasat ve spacer arasında slayt cam doku yatıyordu. Doku kat değil için dikkat ediniz.
- PBS 100 μL doku yüzeyi dağıtmak.
- Diğer kare kapak cam doku üstüne yerleştirin. Hava kabarcıkları eklenmesi bu aşamasında kaçının.
- PBS buharlaşma ve diğer yabancı maddelerden toz tarafından sonraki görüntüleme oturumu sırasında önlemek için tırnak cilası (veya alternatif olarak uygun yapıştırıcılar) kullanarak kapak cam etrafında mühür.
Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.
2. Kalibrasyon
- Mikroskop en az 1 h geçiş ( Tablo malzemelerigörmek) lazer termal stabilizasyon izin vermek için önce görüntüleme kaynak. Sonra spektral tarama ( Tablo malzemelerigörmek) için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve üst kısmında GUI (Şekil 3a). Al düğmesini tıklatın
- Beyaz ışık lazer (WLL) ve photomultiplier tüp (PMT) (Şekil 3a) için yazılım çekim açın.
- Aşağı açılan listedeki xyΛ modu içinde Satın alma moduseçin ve sonra lazer giriş modu otomatik olarak Sabit güçiçin sürekli yüzde değiştirilir. Otomatik SPhareketinin onay kutusundaki işareti kaldırın. Ve sonra 470-670 nm ve spektral adım boyu 4 giriş lazer spektral pencere ayarlayın nm ΛTarih-uyarma Lambda tarama ayarları (Şekil 3b).
- Devresel_ödeme spektral Aralık çift tıklatarak veya spektral Aralık (Şekil 3 c) için ayar çubuğu hareket 450-690 için ayarlayın.
Not: Bu spektral Aralık tam bant genişliği giriş kaynağı içermelidir. - Bir su-daldırma objektif lens, yüksek bir sayısal diyafram ile uygun seçin (NA > 0,7) ve devresel ödeme ve lazer güç için AOBS yapılandırma ve Live tarama düğmesini etkinleştirmek için herhangi bir değer vermek. Optik yol anahtarını belirtmezseniz AOBS yapılandırma (şekil 3d) yansıma kontrol ederek.
- Bir başvuru ayna monte ( Tablo malzemelerigörmek) mikroskop sahnede. Ayna yüzey objektif lens karşı karşıya. Eğer ayna mikroskop sahneye koymak kolay değil, bir ayna üzerine düz plaka (Örneğin slayt cam) bağ.
- Denetim odak düzlem ayna yüzeyine hizalamak için mikroskop sahne.
- Devresel_ödeme kazanç ve dedektör dinamik aralığını dikkate alınarak lazer güç ayarlamak ve sonra sürekli yüzde Sürekli güçiçin lazer giriş modunu değiştirin.
Not: tipik olarak, bir devresel ödeme kazanmak 500 (V) ve göreceli lazer güç % 0.1 570 kullanılır nm. - Dalga boyu aralığı boyunca hiçbir doygunluk olup olmadığını denetlemek için bir sahte renk modunda onaylayın. Doygunluk gözlem yapılırsa, lazer güç (Şekil 3a) indir.
- Lambda tarama edinme çalıştırın.
- Sahne Alanı'ndan, yansıtmayı kaldırma ve karanlık başvuru (yani, karanlık sapma) elde etmek için bir örnek olmadan aynı edinme tekrarlayın.
- Veri Multistacked TIF biçiminde kaydedin.
3. SpeRe resim alma
- Bağlı doku mikroskop sahnesinde yerini. Kabaca dokusu objektif lens odak düzlemi ile hizalamak için bir göz-parça aracılığıyla geniş alanlı floresans modunu kullanın.
- Odak düzlemi doku ilgi bölgesine hizalamak için Live inceden inceye gözden geçirmek ile denetim mikroskop sahne üzerinde. Kapak notu arka plan gürültü önlemek için cam doku arabirimden en az 15 μm kalınlığında derinlik hedef bölgeyi seçin.
- 2.1-2,10 adımlarda açıklandığı gibi aynı yordam kullanılarak hedef bölge için spektral görüntü yığını elde etmek.
- İçin doku ve karanlık ofset Multistacked TIF biçiminde kaydedin.
Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.
4. görüntü işleme ve analiz
- Başvuru ayna ve beyin dokusu için spektral verileri (multistacked TIF) ImageJ içinde açın.
- ROIs (faiz bölgelerinde) için açılan görüntü yığınları seçin — başvuru ayna ve bir akson elyaf beyin dokusu için segment için merkez alan.
- Ham spectra seçili ROIs için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.
- Karanlık mahsup verileri, bir başvuru ayna ve diğer alınan beyin dokusu için alınan açın.
- Spectra karanlık uzaklıklar için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.
- Edinsel spectra kopyalama ve yapıştırma seçenekleri kullanarak kaydedin.
Not: SpeRe görüntüleme için eksen dışı optik anomalileri en aza indirmek için merkezi görüntüleme alanının kullanımı önerilir. Axon lifleri yapısal olarak kendi uzunluğu boyunca heterojen olabilir. Bu nedenle, yatırım getirisi bir küçük axon kesimindeki seçerek, genellikle < 5 µm, kısmi hacimli eserdir en aza indirmek için tavsiye edilir.
5. temel düzeltme ve SpeRe Sinyal Analizi
- Başvuru ayna ve beyin dokuları spectra dan mahsup spectra çıkarma.
- Her spektrum yelpazenin en fazla yoğunluk bölerek normalize.
- Axon normalleştirilmiş spektrum referans ayna normalleştirilmiş spektrum tarafından bölmek ve normalleştirilmiş spektrum DC ofset çıkarın.
- Wavenumber frekans sinüsoidal bir için edinsel spektrum yaklaştırarak ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) eğri ve sonra alınan wavenumber alarak karşılıklı tarafından periodicity için dönüştürün.
- Wavenumber periyodik olarak Şekil 4 cdenklemi kullanarak akson çapı dönüştürün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokole göre bir sabit beyin dilim eksojen boyama ile miyelin hedefleme fluorophore hazırlanan ( Tablo malzemelerigörmek). SpeRe görüntüleme (Şekil 4a) görüntüleme confocal floresan ile birlikte ticari hyperspectral confocal mikroskop kullanarak beyin dilim üzerinde gerçekleştirildi. SpeRe için giriş optik yoğunluğu 5 µW/µm2 ~ 1 µs piksel topla temas süresi ile ayarlandı. Bu hafif doz bir-in-büyüklük üzerinde ise geleneksel flore...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
SpeRe canlı myelinated akson nano bilgileri sunan ilk kez spektral Interferometry dayalı bir yeni etiket içermeyen görüntüleme yöntemi var. Geçerli edinme protokolünde, akson çapı için uzamsal çözünürlük 10 sipariş olduğunu nm. Ayrıca, SpeRe diğer süper çözünürlük microscopies göre büyüklüğü Siparişler alt hafif doz kullanır; Böylece, fototoksisite ve photobleaching ücretsizdir. SpeRe myelinated akson dinamikleri nano eğitimi için yeni bir cadde sağlayacaktır.
Burada açıklanan protokolü acoust...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip mali çıkarlarının ilan: J. Kwon ve M. Choi mucitler Bu makalede açıklanan patent bekleyen teknoloji vardır.
Teşekkürler
Bu eser tarafından temel bilim Enstitüsü (IBS-R015-D1) ve temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı (2017R1A6A1A03015642) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cam kesici | - | Yerel bir marketten veya çevrimiçi mağazalardan satın alınabilir. | |
| Oje | - | Yerel bir marketten veya çevrimiçi mağazalardan satın alınabilir. | |
| Apokromat objektif 40 kez;, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Suya daldırma tipi |
| Floromyelin Yeşili | Thermo Fisher | F34651 | Alternatif olarak, Floromyelin Kırmızısı (F34652) kullanılabilir. |
| Leica SP8 TCS mikroskobu | Leica Microsystems | SP8 | Ayrıntılar için Giriş Bölümündeki "Mikroskop konfigürasyonu"na bakın. |
| Görüntüleme yazılımı | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | ||
| Ayna | Thorlabs | PF10-03-P01 | Korumalı gümüş ile kaplanmıştır. |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | Yaşam teknolojileri | 14190-136-Paraformaldehit | |
| Biyoçözelti | BP031a | PBS'de %4 v/v | |
| Kapak kaymalı | Thermo Fisher | 3306 | Kalınlık: #1 (0,13 ila 0,17 mm) |
| Sürgülü cam | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Kalınlık: ~1 mm |
| Süper yapıştırıcı | Henkel | Loctite 406 | Cilt veya göz temasını önlemek için bir dağıtım ekipmanı kullanın. |
| Şırınga pompası | Brainetree Scientific | BS-8000 | DUAL-Vibratom |
| Leica Biosystems | VT1200S-Beyaz | ||
| ışık lazer | NKT fotonik | EXB-6 | EXB-6 durduruldu ve EXU-6 ile değiştirildi. |
Kaynaklar
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832(2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024(2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
