Yöntem makalesi

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio) insan hastalıkları ile ilişkili olduğu bilinen genlerin % 84 için orthologues sahip. Buna ek olarak, bu hayvanlar bir kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve embriyo içinde DNA'ın mikroenjeksiyon tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Son gelişmeler düzenleme araçları gen mutasyonlar ve zebra balığı transgenes kesin giriş etkinleştirme. Hastalık içinde zebra balığı kez modelleme larva fenotipleri ve genotip bilinmeyen varsa yorumlamak zor olabilir erken ölüme yol açar. Bu erken genotip Ayrıca tanımlamasıdır örnek havuzu gerektiren deneylerde gerekli, gen ifade veya kütle spektrometresi çalışmaları gibi. Ancak, geniş genotypic tarama çoğu labs sadece yetişkin zebra balığı ya da öldükten sonra larva gerçekleştirilen geleneksel yöntemler ile sınırlıdır. Biz bu sorunu bir yöntem gibi erken 72 h sonrası döllenme (hpf) elde edilebilir canlı zebra balığı larva PCR-hazır genomik DNA izolasyonu için adapte tarafından ele. Bu zaman ve maliyet-etkin tekniği, daha önce yayımlanmış Genotipleme Protokolü geliştirilmiş sağlar genotip mikroskobik fin biyopsi üzerinden tanımlaması. Larvalar geliştirdikçe yüzgeçleri hızlı bir şekilde yeniden. Araştırmacılar daha sonra seçin ve istenen genotip yetişkinliğe bu yüksek-den geçerek PCR tabanlı Genotipleme yordamı kullanarak yetiştirmek edebiliyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın preklinik tedavi hipotezler1,2,3test gelince de hastalık soruşturma için bir model olarak kullanılan omurgalı bir organizma. Bu hayvanlar kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve DNA'ın mikroenjeksiyon embriyo4tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Teknolojik öyle aynı derecede çinko-parmak enzimler (ZFN)5, TAL benzeri efektör enzimler (TALENs)6,7ve kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa roman transgenik ve gen artan geliştirilmesi yoluyla düzenleme Palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili 9 (Cas9) sistem8, zebra balığı önemli ölçüde birkaç patolojik koşulları anlayış geliştirmek için hazırlanıyor. Hedeflenen renkleri çakıştırma hem de somatik oluşturmak için kullanılan bu teknolojiler ve verimli bir şekilde genetik olarak duyumsatan zebra balığı, hücrelerde germline hayvanlar8değiştirilebilir. Son literatürde epilepsi ve metabolik bozukluklar genetik modellerini başarılı gelişimi zebra balığı3,9,10,11',12 örnekler .

Zebra balığı genom düzenleme içinde ilerleme ile hızlı ve güvenilir Genotipleme yadsınamaz bir hızı sınırlaması adım haline gelmiştir. Belirli DNA mutasyonları öngörülen genom düzenleme hedef siteye bitişik tanımlaması Protokolü'nün önemli bir aşamadır. Geleneksel olarak, Genotipleme fin kırpma tarafından genellikle sadece içinde gerçekleştirilen çocuk ya da yetişkin zebra balığı tekniklerdir. Ancak, harcanan zaman yetişkinliğe yükselterek zebra balığı (> 2 ay) önemli ölçüde araştırma gelişmeler geciktirir. Birçok durumda, yetişkinlik gerekli genler (Örneğin, hastalık modelleme) veya zararlı fenotipik etkileri için önde gelen işlev kazanç mutasyonlar nakavt nedeniyle elde edilemez. Ayrıca, çeşitli deneyleri larva, RNA veya metaboliti ayıklama gibi havuzu gerektirir ve böylece sadece post hoc Genotipleme teknikleri kullanılabilir olduğunda hangi zor olabilir genotip, önceden tanımlanması dahil. Söz konusu bu örnekler aynı zamanda hassas ve tam kurtarma ve larvalar normal gelişimini olanaklı kılmak larva Genotipleme teknikleri önemini vurgulayın. Erken sahne zebra balığı Genotipleme Şu anda yaygın olarak kullanılan görünmüyor; Bu hastalık modelleri larva genotip Genotipleme çalıştırmadan önce deneme12,13,14yerine öldükten sonra Genotipleme üzerinden tespit edilir son yayınlar yansıtır. Bu yazıda, daha önce kurulan Genotipleme yordamlar geliştirmek amaçlayan bir larva fin küçük strateji sunulur.

Geçmişte, İndinavir K sindirim genotip için istihdam stratejileri larva değişken polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) verimlilik15' e açmıştır zebra balığı yaşamak. Daha son zamanlarda mikroskobik kuyruk biyopsi tekniği daha umut verici sonuçları16sağlanan yayınlanan rağmen biz ve diğer grupları yüksek verimlilik ve yazarlar tarafından bildirilen DNA kurtarma çoğaltmak mümkün değildi. Wilkinson ve ark. tarafından açıklanan Protokolü'nün büyük bir başarısızlık 16 kuyruk doku transferi PCR tüp için olabilir. Mikroskobik onun büyüklüğü nedeniyle, fin düzgün toplanan ve pipetting tarafından reçete emin olmak zordur. Bu bariyer adrese, Genotipleme canlı zebra balığı larvaları yaklaşık % 100 verim9ile çok sayıda için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bir microscalpel kullanarak, fin kuyruk ucu kaldırılır ve bir filtre kağıt parçası yerleştirilir. Filtre kağıt dokusu içeren kolayca görselleştirildiği ve doğru bir PCR tüp içine yerleştirilir. Genomik DNA ekstraksiyon ardından, genotip örnek ilgi bölgesinin PCR güçlendirme tarafından takip gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajları, yüksek bir PCR verim, düşük bir yanlış pozitif oranı ve düşük ölüm oranı içerir. Ayrıca, çok sayıda embriyo Genotipleme bu iletişim kuralını kullanan mümkündür. Burada açıklanan protokol fin-kırpma, larva bu yaklaşım ve genotyped balık ve kuyruk rejenerasyon iki gün içinde doğru kimlik kullanarak 2-3 saat içinde yüzlerce sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maddelerle ilgili hayvan konular onaylanmış olan ve hayvan bakımı kılavuzlarınıza uygun olarak çoğu yordamlar Kanada Konseyi tarafından hayvan bakım ve Ottawa Üniversitesi hayvan bakımı komiteler sağlanan.

1. hazırlık

  1. Diseksiyon yüzey 9 cm Petri kabına kapak Otoklav Bandı ile iç yüzeyi taping tarafından hazırlamak. Stereo mikroskop altında yerleştirin.
  2. Yer 3-5 gün sonrası döllenme (dpf) bir Petri zebra balığı larvaları yemek ve ˜1.5 mm Tricaine 1 x E3 embriyo medya (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7.2) anestezi.
  3. P1000 pipet ucu makas ya da jilet bir çift ile sonu kapalı 3 dpf larva en az stres ile karşılamak için 2 mm çapında yara bere.

2. zebra balığı larva fin kırpma

  1. Değiştirilmiş P1000 micropipette kullanarak bir imzalat larva kadar almak ve zebra balığı larva konumlandırılmış Otoklav Bandı üzerine Petri kabına kapağını yerleştirin.
  2. Bir micropipette kullanarak larva çevreleyen aşırı Tricaine çözüm kaldırın. Alan başarıyla bölüm ve fin kadar almanız mümkün ama hala hayatta kalmasını sağlamak için ıslak kuru olmalıdır.
  3. Mikro neşter, Bölüm mikroskop stereo Wilkinson ve ark16açıklandığı gibi Şekil 1' de gösterildiği gibi altında kaudal fin kullanarak. Belgili tanımlık kesme sırasında kaudal fin, kan dolaşımını (Şekil 1A) sınırlamak için distal pigment boşluğu sitenin içinde sürekli bir aşağı doğru basınç uygulayın. Notochord zarar görmesini önlemek için hafif basınç uygulayın.
  4. Mikroskop altında kesitli fin görselleştirmek ve üstünde tepe-in belgili tanımlık uç parçası microscalpel bıçak (Şekil 2A) konumlandırın. Filtre kağıdı küçük bir parça yüzeyinin fin içeren microscalpel yerleştirin.
    Not: transected doku melanosit varlığı nedeniyle, bu adımı fin görselleştirme bir küçük siyah nokta (Şekil 2B) olarak sağlar.
  5. Makas ve cımbız (Şekil 2C), transfer 50 mm NaOH çözüm iyi (Şekil 2B) başına 25 μL içeren bir 96-şey PCR plakasına fin içeren filtre kağıdı kullanarak.
  6. PCR plaka etiket göre iyi numaralandırma bir düz-alt 96-şey plaka hazırlayın. Taze 1 x E3 embriyo medya 200 µL ile dolu değiştirilmiş P1000 pipet kullanarak, dikkatle hafif basınç kullanarak zebra balığı larva toplamak. 96-iyi doku kültürü plaka aynı PCR plaka (Şekil 2E) iyi numara larva dağıtmak.
  7. Filtre kağıdı de çözüm (2F rakam) sular altında emin olun. Microscapel ve cımbız % 70 alkol çözüm daldırma tarafından çapraz kontaminasyonu önlemek için her kesim arasında bıçak temiz. Bıçak temiz kağıt doku/bezle silin.
  8. Tüm embriyoların kısaltıldı 2.1-2.7 tamamlayana dek.
  9. Genotip belirleyinceye kadar larva 96-şey plaka 28 ° C'de depolayın.
    Not: Embriyo medya iletişim kuralı kolayca az 2 gün içinde tamamlanabilir beri değiştirilmesi gerekmez. Daha fazla zamana ihtiyacım vardı, bir medya değiştir önerilir.

3. genomik DNA ekstraksiyon

  1. 96-şey PCR plaka ve örnekleri için tüm filtre kağıtları emin olmak 1 dk 1000 x g de NaOH çözümünüzde batık santrifüj kapatın.
  2. Doku lizis için 95 ° c 5 min 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip için bir thermocycler örneklerinde ısı.
  3. 500 mm Tris-HCl, her örnek için 8,0 pH 6 μL ekleyin. Girdap.
  4. Kısaca, oda sıcaklığında 5 min için 1.500 x g plaka santrifüj kapasitesi.
  5. Bir DNA süpernatant PCR reaksiyon başına 1,5 μL kullanın.
  6. Genotip için PCR larvalar, Tablo 1-2' de gösterildiği gibi hazırlayın.
    Not: Bu protokol iki uygulamaları için test edildi: multiplex özel jelleri9ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa)17kullanarak genotip ortaya tahlil (HMA) erime heteroduplex kullanarak genotip ortaya PCR reaksiyonları.

4. alternatif genomik ayıklama şelat bir reçine kullanarak

  1. Filtre kağıdı ile bölünerek fin bir 96-şey PCR plakasına ekleyerek tam adım 2.5 reçine (eşli iminodiacetate iyonları içeren stiren-divinylbenzene kopolimer) şelat % 5'lik 30 μL içeren.
    Not: Bu tür reçine bir doku lizis ve PCR-hazır DNA bir hızlı ve verimli bir şekilde18' hazırlanması için yaygın olarak kullanılır.
  2. 2.6-2.8 belirtildiği gibi adımları.
  3. 96-şey PCR plaka mühür ve kısaca tüm filtre kağıdı içinde bağlayıcı reçine sular altında emin olmak için örnekler santrifüj kapasitesi.
  4. Doku lizis için bir thermocycler 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip 15dk için 95 ° C'de örneklerinde ısı.
    Not: Bu adımı DNA ve RNA çözümde kalırken lizis ve kutup reçine boncuk hücresel bileşenleri için sonraki bağlantısını sağlar.
  5. Kısaca reçine boncuk cips ve süspansiyon DNA'da edinmek için örnekler santrifüj kapasitesi.
  6. 3.5-3.6 Genotipleme yordamı tamamlamak için adımları izleyin.

5. uygulama 1: Özel jel analiz tarafından takip Multiplex PCR

  1. Tablo 1, takip homozigoz mutantlar, heterozygotes ve WT larva arasında ayrımcılık sağlamak için çok katmanlı bir PCR reaksiyonu ayarlayın. 96-iyi termal cycler Tablo 3' te açıklanan Bisiklet koşullarını kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanın.
    Not: PCR reaksiyonları da herhangi bir diğer geleneksel PCR termal cycler içinde gerçekleştirilir. Bu örnek Pena, et al. kullanılan PCR strateji açıklar aldh7a1 WT ve 5-bp ekleme mutant gen aynı multiplex tepki olarak tanımlamak için, 9 .
  2. % 1'özel jel 1 ile lekeli sodyum borat arabellekte hazırlamak x GelRed.
    Not: 76 g Borik asit ile 8.5 için ayarlanabilir ve sonra GKD2O. kullanarak 2 L son birim için tamamlandı pH 10 M NaOH, GKD2O, 1800 mL, 40 mL sodyum borat arabellek hisse senedi x 20 yapılan
  3. V 250 15dk için 1 x sodyum borat arabellekte jel çalıştırın. Sürecini kolaylaştırmak için mümkünse, örnekleri yükleme süresi azaltarak daha yüksek üretilen iş yetenekleri etkinleştirmek için çok kanallı pipets ile uyumlu bir jel sistemi kullanın.
  4. Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için ultraviyole (UV) ışık altında görüntü.

6. uygulama 2: Tahlil erime Heteroduplex

  1. SAYFA %12 jelleri 1.5 mm spacer plaka ve 15-örnekleri tarak kullanarak hazırlayın. İki sayfa jelleri 12.21 mL GKD2O, 10 x Tris/bor/EDTA (TBE), 10 mL % 30 akrilamid, 250 μL 2.52 mL % 10 amonyum Persülfat (APS) kullanarak hazırlamak ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. 1 x TBE arabellek kullanın (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M Borik asit ve 0.002 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) arabellek çalışan olarak.
  2. PCR ürünleri 5 min için 94 ° C'de ısı.
  3. Tüpler buz veya thermocycler 4 ° C'de 10 dakika serin
  4. PCR örnek başına 10 μL ve molekül ağırlığı işaretleyicinin 8 μL yük.
  5. 150 V 1 x TBE molekül ağırlığı işaret kadar veya 1 h için neredeyse bir dikey elektroforez sistemi kullanarak ayak hattının cam levha ulaşır. sayfayı çalıştırın.
  6. Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için UV ışık altında görüntü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taht verimliliğini Genotipleme tarafından gösterilmiştir Heterozigoz bir çapraz dölü (aldh7a1+ / ot100, burada aldh7a1+/-gösterilen) ()Şekil 3A- C)9. Aldh7a1ot100mutant Gen 5-baz çifti (bp) ekleme ilk kodlama exon frameshift ve fonksiyon kaybı nedeniyle erken bir stop kodonu9yol açar zebra balığı aldh7a1 gen va...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son mutasyonlar ve zebra balığı transgenes tam olarak tanıtmak istihdam düzenleme araçları Gene yıl5,6,7,8. Zebra balığı içinde modelleme hastalığı gerçekleştirirken, erken larva veya Juvenil fenotipleri9,12,13,14kez gözlenir. Burada sunulan Protokolü PCR-hazır DNA çe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar nadir hastalık modelleri ve mekanizması (RDMM) ağ (in arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) ve genom Kanada tarafından finanse edilir) teşekkür etmek istiyorum. CK UROP burs ödülü (University of Ottawa) tarafından desteklenir. DLJ Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs tarafından desteklenir. IAP, arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) doktora sonrası bursu ödülü tarafından desteklenir. Yazarlar genetik Society of izin verme için America tamamlayıcı Şekil 5 Pena, üzerinden bir uyarlaması kullanılacak ve bu protokol yayımlamak için teşekkür ederiz ve ark.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Petri kabıCorning430167
MikroneşterDünyası Hassas Aletler500249
StereomikroskopNikonSMZ1500
Trikain / Etil 3-aminobenzoat metansülfonatSigma-AldrichE10521
96 oyuklu Doku kültürü plakasıCostar3595
96 oyuklu PCR plakaFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Tris tabanı Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
%5 Chelex 100 sodyum formuSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Borik AsitSigma-AldrichB6768
Alt Hücre Modeli 192 sistemiBio-Rad 
1704508 %30 Akrilamid/Bis Solüsyonu, 37.5: 1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
kağıt mendil (Kimwipes ve reg; tek kullanımlık silecekler)Sigma-AldrichZ188956
1kb artı moleküler ağırlık işaretleyici ve nbsp;Thermo ScientificSM1343
Nükleaz içermeyen su Sigma-AldrichW4502
Alt Hücre Model 192 sistemi (yüksek verimli agaroz jel sistemi)Bio-Rad 
dikey jel elektroforez sistemi Mini-PROTEAN Tetra Cell Biyo-Rad 
161015817045081658004

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Genotipleme ProtokolY ksek Kapasiteli PCRSodyum Hidroksit Lizisielat r Re ine EkstraksiyonuMultiplex PCR AnaliziAgaroz Jel ElektroforeziPoliakrilamid Jel Analizi

İlgili makaleler