Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58027

⸱

5 Eylül 2018

 ,  ,  , 
1RIKEN Brain Science Institute, 2Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Bu makalede

Özet

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Özet

Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.

Giriş

Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo 1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.

Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu10temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks10innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri11.

Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar14 hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar14hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi14 örgü ve fare beyin12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni13alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.14. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.

Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks14konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.

Son zamanlarda, teknikleri kalın doku15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler12ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3-cre/Ai9 fareler17tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi18 antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi19 diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 514doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel yordamlar RIKEN Wako hayvan deneyleri Komitesi ve RIKEN genetik rekombinant deneyi Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan imkanları RIKEN beyin bilim kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen Enstitüsü.

1. hazırlık Chambers'ı görüntüleme

  1. Odası19 görüntüleme
    1. Silikon kauçuk sayfalarını kullanarak, bir oda çeşitli kalınlıklarda yaklaşık 5 mm ve zemin plakaları kalınlığı ile hazırlayın. Ayrıca, Petri yemekler ve cam alt (Şekil 1A) olmadan hazırlayın.
  2. Dilim rondela
    1. Silikon kauçuk yaprak kalınlığı 0,5 mm (Şekil 1 c) kullanarak örnekleri, tutmak için boşluk ekleyiciler hazırlayın.

2. izleme enjeksiyon

Not: enjeksiyonları pons (2.1) veya üstün olacaklar (2.2) içine alın. Görsel bölgede üstün olacaklar etiketleri alt beyin projeksiyon sinirlerde içine enjeksiyon sırasında görsel ve motor alanlar da dahil olmak üzere geniş beyin bölgesi pons etiket alt beyin projeksiyon nöronlarda içine enjeksiyon. Kontrol deneyleri için fluorescently etiketli Kolera toksini alt birim B. yerine serum enjekte Steril koşul bakım için steril ekipmanları ve etanol ile temizlenmiş plastik eldiven kullanın.

  1. Yetişkin fareler pons içine enjeksiyonu yapmak.
    1. Bir fluorescently etiketli Kolera toksini alt birimi B 1 µL çizmek (25 µg/µL PBS içinde) 26 G Hamilton şırınga içine.
    2. Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
    3. Şırınga ve pompa stereotaksik araç üzerinde yerleştirilen bir manipülatör araç sahibinin yerleştirin. Manipülatör 12 ° dikey eksenden özafagusu eğ.
    4. İntraperitoneally sodyum Fentobarbital enjekte edilerek bir erkek veya kadın yetişkin (C57BL/6J veya fare Tlx3-cre/Ai9) anestezi (60 mg/kg vücut ağırlığı) veya isoflurane (2-%3) yönetmek. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
    5. Stereotaksik araç üzerinde fareyi getirin.
    6. Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi, 10 mm bregma ve lambda görünecek şekilde kesilmiş bir jilet kullanarak saç dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir pipet kullanarak %1 lidokain 0.1 mL yönetmek. Böylece bregma ve lambda aynı z düzeyde sahip stereotaksik cihazda ağızlık dikey konumunu ayarlayarak baş açısını ayarlamak.
    7. Manipülatör konumunu kaydetmek ve şırınga ucu bregma yakın olması stereotaksik araç üzerinde kaydırarak manipülatör konumunu ayarlayın. Şırınga manipülatör üzerinde araç tutucu taşıyarak geri çek.
    8. Manipülatör hareket 5.4 mm özafagusu ve 0.4 mm yanal. Böylece kafatası üzerinde giriş noktası ucu yakındır şırınga ilerlemek. Şırıngayı geri çekmek ve giriş noktası işareti.
    9. İşaretli konumda yaklaşık 1 mm çapında bir delik.
    10. Bu bregma ölçülen daha fazla ipucu derinlik 6.9 mm böylece şırınga ucu delikten yerleştirin.
    11. 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 1 µL enjekte.
    12. Şırınga beyinden kaldırın.
    13. Gerekirse, maruz kalan beyin microfibrillar hemostat ve anlık yapışkan küçük parçaları ile kapak.
    14. Bir pipet ile teslim salin enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi dikiş kullanarak maruz beyin durulayın.
    15. Fare stereotaksik araç kaldırın. Fareyi anestezi genellikle için 1 h 30 ˚C adlı bir kuluçka kurtarmak izin verir. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Tam olarak kurtarıldı sonra fare diğer hayvanlar şirkete geri dönün.
    16. Fare 3-7 gün boyunca korumak.
  2. Yetişkin fareler üstün olacaklar içine enjeksiyonu yapmak.
    1. Cam Pipet ucu çapı 30 – 50 µm ile hazırlayın.
    2. Cam Pipet Hamilton şırınga plastik tüp (Şekil 2A) aracılığıyla bağlayın.
    3. Cam Pipet, plastik tüp ve Hamilton şırınga parafin sıvı ile doldurun.
    4. Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
    5. Cam Pipet manipülatör yerleştirin ve manipülatör özafagusu dikey eksen (Şekil 2B) üzerinden 60 ° tilt.
    6. 2.1.4–2.1.9 gerçekleştirin. Manipülatör 1.4 mm arka, 0,5 mm lateral lambda için konumdur.
    7. Kafatasında bir küçük plastik parafin film yeri, sonra yaklaşık 1 µL izleyici çözüm üzerine koydum. Hızlı bir şekilde Cam Pipet ilerlemek ve izleyici çözüm en az 0,5 µL ile doldurun.
    8. İpucu derinliğidir beyin yüzeyinden 3.0 mm Cam Pipet ekleyin.
    9. 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 0.5 µL enjekte.
    10. Cam Pipet beyinden kaldırın.
    11. 2.1.13–2.1.16 gerçekleştirin.

3. fiksasyon ve düzeltme

  1. Sodyum Fentobarbital (60 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneally (C57BL/6J veya Tlx3-cre/Ai9, ya da 2. adımda açıklandığı şekilde tracer enjeksiyon olmasın. bir fare içine enjekte. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
  2. Fare fare transcardially%20 0,9 serum fizyolojik ile ventriküler tarafından insanca ötenazi.
  3. Ventriküler tarafından20 fare saptamak 0.1 M fosfat tampon (pH 7.5) % 4 paraformaldehyde (PFA).
  4. Kafatası açıklanan20olarak ortaya çıkarmak için makas kullanarak kafa derisi kesilmiş.
    1. Makas kullanarak maruz kafatasının orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak kafatasını.
    2. Bregma ve lambda konumunu işaretleme gerekli ise, önce bir yarımküre kafatası kaldırın. Beyin bregma ve beyin üzerinde kalan kafatasındaki lambda pozisyonlarda ince tungsten iğne takın, sonra kalan kafatası kaldırın.
      Not: Beyin 4 ˚C PBS içinde depolanabilir.
  5. İnhibitör nöronlar antikor boyama gerçekleştirmek için beyin örnekleri dilimler halinde kesin.
    1. Beyin örnek bir vibratome yerleştirin.
    2. En fazla 500 µm oda sıcaklığında PBS içinde kalın dilimler kesin ve adım 5 (AbScale yöntemi)'e devam edin.
  6. Antikor boyama gereksizdir, trim beyin örnek (ilâ 3 mm kalınlığında) engeller bir tıraş bıçağı (Şekil 3) kullanarak ve adım 4 (SeeDB yöntemi)'e devam edin.
    Not: Beyin PBS içinde 4 ° C'de kesme veya düzeltme sonra saklanır. AbScale yöntemi daha az zaman gerektirir çünkü antikor boyama gerekmediğinde SeeDB yöntemi tercih edilir.

4. takas antikor boyama (SeeDB yöntemi)

  1. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
  2. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve % 40 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
  3. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %60 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
  4. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
  5. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %100 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
  6. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80.2 (w/w) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 24 h için kuluçkaya.
    Not: örnek dikkatle deformasyonlar olabildiğince küçük tutmak için baş. Örnekleri hızla opak olabilirsiniz gibi örnekleri belirtilenden daha uzun kuluçkaya değil.
  7. Örnek %80.2 fruktoz çözüm (Şekil 1B) ile dolu bir görüntüleme odası katıştırın. Gerekirse, örnek kauçuk yapıştırıcı küçük parçalar koyarak düzeltmek. Odası örnekleri yerleştirmeden önce odasında bir yere plaka koymak çok derin değilse.
  8. Görüntüleme odası cam kapaklı Petri kabına yerleştirin ve çanak ve görüntü confocal veya iki fotonlu mikroskobu uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile kullanarak su koyun. Uyarma dalga boylarında ve emisyon filtreler Tablo 1' de açıklanmıştır. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.

5. (AbScale yöntemi) boyama antikor ile takas

  1. Reaktifler Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
  2. Bir spatula 4 mL ani kalp durması/eS0 çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri aktarın ve onlara nazik 37 ° C'de (Şekil 4B) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
  3. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 36 h için dilimleri kuluçkaya
  4. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eB4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 24 h için dilimleri kuluçkaya
  5. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
  6. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
  7. Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
  8. 1 ml AbScale çözüm 48-72 h 37 ° C'de nazik sallayarak ile (Şekil 4 c) için birincil antikorlar (Tablo 3) ile kuluçkaya.
  9. Bir spatula kullanarak bir 5 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
  10. AbScale çözüm için 2 h 2 kez oda sıcaklığında hafif sallayarak ile 4 ml kuluçkaya.
  11. Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
  12. Fluorescently etiketli ikincil antikorlar (Tablo malzemeler, 1: 100) AbScale çözüm 37 ° C'de nazik sallayarak ile 48 saat için 1 ml ile kuluçkaya.
  13. Dikkatli bir spatula 4 mL AbScale çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri kaldırmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
  14. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve 4 mL AbScale çözeltisi ekleyin ve 2 kez nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 2 h için dilimleri kuluçkaya.
  15. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırın ve 4 mL % 4'lük ekleyin PFA ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
  16. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
  17. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eS4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
  18. Bir cam slayt üzerinde spacer yer ve dilimleri içinde spacer yer ve ani kalp durması/eS4 çözüm dilimlerle batırmayın. Rondela (Şekil 1 d) bir cam ile kapatın.
  19. Su cam ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal veya iki fotonlu mikroskobu kullanarak resim koymak. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.
    Not: örnek derin bölgelerinde önemli bir etiketleme önyargı yokluğu onaylamak için yüzeysel bölümlerine benzer şekilde etiketli olup olmadığını kontrol edin.
    Not: Penetrasyon test antikorların Tablo 3' te tanımlanmıştır.

6. hücre konumu belirleme

  1. Taranan görüntülerde her bir pozisyon için bir üç boyutlu görüntü filtresi14 (Şekil 5A-5D) kullanarak korelasyon değerleri hesaplar.
  2. Correlation değeri (Şekil 5 d) doruklarına konumları belirler.
  3. Görüntüleri hücreleri (Şekil 5E) bulmak için zirveleri etrafına araştırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kortikal projeksiyon nöronlar tdTomato Tlx3-creiçinde ifade tarafından /Ai9 transgenik fareler etiketli ve retrograd izleyici CTB488 pons enjekte edilerek alt beyin projeksiyon nöronlar görüntülenir. Beynin sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile donatılmış iki fotonlu mikroskop kullanarak inceden inceye gözden geçirmek (25 X, N.A. 1.1, çalışma mesafesi 2 mm) ve motorlu bir sahne. 401 görüntü yığınını (512 x 512 pikse...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortical cep kapsamlı analiz izin verebilirsiniz org...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Atsushi Miyawaki ve Hiroshi Hama AbScale deneyler, Charles Yokoyama yazması, düzenleme için onların tavsiye için Eriko Ohshima ve Miyuki Kishino onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Japonya'nın bilimsel araştırma için T.H. RIKEN araştırma fonlarından T.H. ve Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (yenilikçi alanları "Mezoskopik Neurocircuitry"; 22115004) ve S.S. (25890023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Crym-egfp transgenik farelerMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre transgenik farelerMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdDomates fareleriJackson LaboratuvarıJAX # 7909
Silikon kauçuk levhaAS ONE6-611-010,5 mm kalınlık
Silikon kauçuk levhaAS ONE6-611-021.0 mm kalınlık
Silikon kauçuk levhaAS ONE6-611-053.0 mm kalınlık
Petri kaplarıFalcon351008
Kapak camıMatsunamiC022241
Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 488 konjugeInvitrogenC22841
Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 555 konjugeInvitrogenC22843
Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 594 konjugeInvitrogenC22842
Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 647 konjugeInvitrogenC34778
26 G Hamilton şırıngaHamilton701N
Enjektör pompasıKD ScientificKDS 310Pons enjeksiyon
Enjektör pompasıKD ScientificKDS 100Üstün colliculus enjeksiyon
ManipülatörüNarishigeSM-15
Sodyum pentobarbitalKyoritsu SeiyakuSomnopentil
İzofluranPfizer
LidokainAstraZenecaKsilokain enjeksiyonu epinefrin
MatkapToyo AssociatesHP-200
Aviten mikrofibriller kanama durdurucuDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Cerrahi ipekEthiconK881H
İnkübatörUVPHB-1000 Hibridizatör
Cam pipetDrummond Scientific Company2-000-075
Elektrot çektirmesiSutter Instrument CompanyP-97
Parafin Sıvı, hafifNacalai tesque26132-35
SalinOtsuka1326
ParaformaldehitNacalai tesque26126-54
Tungsten iğneInter medical& Phi; 0.1 * L200 mm
VibratomLeicaVT1000S
50 mL plastik tüpFalcon352070
&alfa;-tiyogalirolNacalai tesque33709-62
D(-) FruktozNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
İki fotonlu mikroskopNikonA1RMP
Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleriNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleriNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorlu sahneCOMSPT100C-50XY
FiltreSemrockFF01-492/SP-25
FiltreSemrockFF03-525 / 50-25
FiltreSemrockFF03-575 / 25-25
FiltreSemrockFF01-629 / 56
FiltreChromaD605 / 55m
5 mL plastik tüpBIRVIO-5B
2 mL plastik tüpEppendorf ve nbsp;
ÜreNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D (-) - sorbitolWako191-14735
Metil-β-siklodekstrinTokyo kimya endüstrisiM1356
ve gama; - SiklodekstrinWako037-10643
N-asetil-L-hidroksiprolinCilt Temel Aktifleri33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Sığır Serumu AlbüminSigma-aldrichA7906
Ara-20 (1.1 g / mL)Nacalai tesque35624-15
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Konfokal mikroskopOlympusFV1000
Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleriOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminSınır EnstitüsüPV-Go-AF460
Anti-ParvalbuminSigmaP3088
Anti-ParvalbuminAbcamab11427
Anti-SomatostatinYarımadası LaboratuvarlarıT-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38
ile %10030120094

Kaynaklar

  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462(2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
  5. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
  6. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  7. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  8. Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
  9. Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
  10. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
  11. Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
  12. Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
  13. Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
  14. Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  15. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
  16. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
  17. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  18. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  19. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  21. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  22. Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  23. Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  25. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  26. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  27. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan İşaretlemeDoku ŞeffaflaştırmaKonfokal Mikroskopiİki Fotonlu MikroskopiRetrograd İzleyicilerTransgenik Farelerİmmün İşaretlemeMikrokolon Organizasyonu
Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.