Yöntem makalesi

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

DOI:

10.3791/58034

⸱

16 Ağustos 2018

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan beyni çalışmak için ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Bu soruna yönelik bir gelişen teknoloji 'organoids' veya 'pulcuklarının', hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere hücre adezyon molekülleri uzun vadeli korunması için ifade edilen üç boyutlu (3D) sinir hücre kültürleri, kullanmaktır. Ancak, bu kültür zaman alıcı ve sistematik olarak oluşturulan sistemlerdir. Burada, biz hızla ve sürekli nöronların 3D cocultures üretmek için bir yöntem detay ve astrocytes gelen insan pluripotent kök hücre. İlk, önceden farklılaşmış astrocytes ve nöronal ataları ayrışmış ve sayılır. Küre-oluşturan hücreler daha sonra birleştirilir yemekleri ile bir Rho-kinaz inhibitörü ve küreler tekrarlanabilir boyutta üretmek için belirli oranları. Kültür kayan küreler olarak birkaç hafta sonra cocultures ('asteroitler') son olarak immunostaining için kesitli veya sinaptik yoğunluğu ve gücü ölçmek için multielectrode diziler kaplama. Genel olarak, bu protokol olgun hücre türü kısıtlanmış işaretleyicileri görüntülemek, fonksiyonel sinapslarda formu ve spontan sinaptik ağ veri bloğu aktivite sergilemek 3D sinirsel küreler verecektir bekleniyor. Birlikte, bu sistem uyuşturucu tarama ve mekanizmaları soruşturmalar hastalığının monolayer kültürlere göre daha uygun bir model izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocytes pek çok yapısal destek ötesinde fonksiyonel sorumlulukları ile merkezi sinir sistemi (MSS) içinde son derece bol gliyal hücre tipi vardır. Salgılanması çözünür synaptogenic faktörler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinin kurulması ve geliştirme1sırasında olgun sinapslarda kümeleme astrocytes yardım. Ayrıca sağlık ve plastisite sinapslarda ile hücre dışı sinyal2,3,4,5kritik bir rol oynamaktadır ve homeostatik için uzun vadeli istikrar katkıda hücre dışı potasyum ve glutamat yanı sıra enerji yüzeylerde ve ATP6,7,8salgılanmasını düzenleyerek ortamlar. Son olarak, onlar için neurotransmission extrasynaptic akımları9etkileyen tarafından katkıda bulunabilir ve etkinlik myelination10teşvik gibi diğer hücre türleri aracılığıyla dolaylı olarak etkileyebilir. Önemlisi, anormallik veya astrocytes disfonksiyon birçok nörogelişimsel sendromları ve yetişkin nevropatoloji yol açabilir çünkü sırayla için geliştirilmiş bir astrocytes nöronlar mühendislik sinir ağları içinde yanında dahil etmek için bir açık gerek yoktur endojen beyin çevre modeli. Astrocytes ayrılmaz bir özelliği ile nöronal sinapslarda1,11,12formu dinamik etkileşimler için onların yeteneğidir. Glia yokluğunda, genel de fonksiyonel olgunluk13eksikliği sinapslarda sınırlı sayıda neurons oluşturur.

İnsan astrocytes, transkripsiyon, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri görüntülemek — artan büyüklüğü ve karmaşıklığı dallanma, hem de species-specific gen gibi — kemirgenler12,14', değil recapitulated 15. Sonuç olarak, çalışmalar insan pluripotent kök hücre (hPSC) kullanan-türetilmiş sinir hücreleri haline yaygın olarak kabul yeni tedaviler, yaralanma modelleri ve kültür paradigmalar16 geliştirirken CNS bağlı hastalıklar vitro incelenmesi aracı olarak ,17. Ayrıca, hPSCs insan synapse oluşumu ve işlev birincil doku18,19gerek kalmadan çalışma izni.

İnsan beyninin ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik ile onun sinaptik ağları özetlemek uygun bir platform için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, faiz 3D kültür sistemleri üretiminde ortaya çıkmıştır (genel olarak 'organoids' bilinen 'pulcuklarının' veya 'mini beyin') karmaşık üç boyutlu (3D) modelleme20 yapıları cep ve makro düzeyde. 3D kültür sistemleri tipik 2D coculture paradigmalar21,22sırasında normalde bulunmadığından veya sınırlı ECM ve hücre-hücre etkileşimleri korur. Teknikleri bir bolluk var 3D sinirsel pulcuklarının23,24,25kültür için; Ancak, birçok uzun kültür dönemleri gerektirir (ay-yıl) spontan gelişimi ve katman korunması için Kullanıcı ile çok az çıktı üzerinde denetime sergilenmesi.

Burada, biz hızlı bir şekilde sistematik bir yönteme göstermek ve sürekli genetiğinin sinirsel etkileşim arasında birden çok hücre tipleri (önceden farklı nöronlar ve astrocytes) hPSCs küre cocultures ('asteroitler')26 hücreleri birleştirerek elde edilen 3D insan özgü morfolojik karmaşıklığı özetlemek. Bu yüksek yoğunluklu sinir sistemi zamanla olgun özellikleri almak ve ekranlı veya bir yüksek-den geçerek şekilde denetlesinler eşit dağınık sinirsel alt türlerini oluşturur. Biz insan astrocytes sinaptik ağ veri bloğu etkinliğinde bu 3D cocultures neden ilk kez göstermek. Ayrıca, bu iletişim kuralını küreler farklı boyutlarda, farklı bölgesel MSS kimliklere belirtilen hücreleri kullanmak ve istediğiniz gibi birden çok hücre tiplerinin etkileşimleri çalışmaya oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültür ve reaktif hazırlık

Not: Bu bölümde Protokoller'de farklılaşma Protokolü (Bölüm 2) göründükleri sırayla yazılır. Malzeme ve Katalog numaraları Tablo reçetesi görmek.

  1. Kaplamalı plakalar hücre kültürü için hazırlayın.
    1. Hücre dışı matriks (ECM) kaplama çözüm 1 mg/mL stok çözüm hazırlamak için DMEM/F12 medya ile sulandırmak. Aliquot seyreltilmiş ECM çözümü 3 mL 30 konik tüpler içine stok ve hemen saklamak-20 ° c ' Çalışan bir çözüm için ECM stokunun 3 mL 33 mL 80 µg/mL bir konsantrasyon için 36 mL toplam hacim getirmek önceden soğutulmuş DMEM/F12 medyanın içine resuspend.
    2. 6-şey hücre kültür plaka ECM çalışma çözüm ile kuyu başına 1 mL kat. Bir ek 1 mL DMEM/F12 iyi ücret ekleyin (gerekliyse) kuyu yüzeyi tamamen kaplıdır emin olmak için. Kaplamalı 6-şey hücre kültür plakaları oda sıcaklığında en az 1 h kullanmadan önce oturmak izin.
      Not: Kaplamalı plakalar kuluçka veya 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
  2. Medya formülasyonları, büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlayın.
    1. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) orta27500 mL hazırlamak 20 x ve üreticilerin talimatlarına göre 500 x takviyeleri ekleyin.
    2. Sinirsel Orta (NM) 500 mL hazırlamak için heparin 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon, antibiyotik/antimycotic çözüm, özel sayı: 1 x B27 veya DMEM/F12 500 mL şişe 1 x N2 ek L-glutamin takviyesi ile 1 x daha önce ayrıntılı28ekleyin.
    3. 10 mM hazırlamak için (1, 000 x) stok çözüm Rho-kinaz inhibitörü Y27632 (Y), tozu 10 mg 3 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Filtre, aliquot, sterilize ve mağaza-20 ° C'de 10 µM çalışma konsantrasyonu medya kullanır.
    4. 20 mM hazırlamak için (10, 000 x) stok SB431542 çözüm, dimetil sülfoksit (DMSO) 1.3 mL 10 mg tozu ekleyin. 2 mM hazırlamak için (1, 000 x) stok DMH1 çözüm, DMSO 13.1 mL 10 mg tozu ekleyin. Filtre, aliquot, sterilize ve her çözüm-20 ° C'de depolayın Her biri 2 µM çalışma konsantrasyonu medya (NM + SB431542 + DMH1) kullanın.
      Not: Bu protokol 2 µM çalışma her iki SB431542 konsantrasyonları önerir ve bu konsantrasyon etkili hPSCs gelen sinir indüksiyon teşvik belirten29 bizim gözlem ve raporları diğerlerinden DMH1 dayalı. Daha yüksek konsantrasyonlarda de bildirilen30olmuştur. Buna ek olarak, alternatif medya ile bu da küçük moleküller yüksek sinirsel dönüşüm31için gerekli değildir gösterilmiştir. Böylece, çalışma konsantrasyonları alternatif hücre kültür ortamları bağlı olarak değişir ve en uygun konsantrasyonlarda bireysel araştırmacılar tarafından test edilmelidir.
    5. Bireysel 100 µg/mL hazırlamak için (10, 000 x) epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF2), hisse senedi çözümleri 1 mg her PBS + %0,1 BSA 10 mL içine ekleyin. Aliquot EGF ve FGF2 çözümler 50 µL aliquots stok ve-80 ° C'de depolayın Her biri 10 ng/mL çalışma konsantrasyonu medya kullanın; Örneğin, 5 µL EGF ekleyip 5 µL Nm (NM + EGF + FGF2) 50 ml FGF2.
    6. Doksisiklin hidroklorür (Dox) stok çözeltisi hazırlamak için ilk 100 mg/mL DMSO içinde toz geçiyoruz ve -20 ° C'de depolayın 2 mg/mL yapmak için daha fazla seyreltik (1, 000 x) stok PBS ve mağaza-20 ° C'de çözümde 2 µg/mL çalışma konsantrasyonu medya kullanır; Örneğin, 50 µL eklemek Dox Nm (NM + Dox) 50 ml.
      Not: çözümleri çözdürme sonra yeniden dondurma değil.

2. nesil insan indüklenen Pluripotent hücreler (hPSCs) üzerinden sinirsel türlerinden

Not: Tüm hücre kültürlerinde bir kuluçka %5 CO2 37 ° C'de muhafaza edilmelidir Alt düzeyleri kullanıldığında rağmen bu kültürler Oda oksijen düzeyleri sürdürülür.

  1. Oluşturmak ve korumak astrocyte ataları (hAstros)--dan hPSCs.
    Not: Bu bölüm kısa ve Basitleştirilmiş farklılaşması Protokolü sağlar. (Embryoid vücut oluşumu, rozet seçimi ve bölgesel desenlendirme adımları ile) ayrıntılı bir açıklama için daha önce açıklanan protokol28 için (Şekil 1A,) yeşil kutu noktalı bakın.
    1. HPSCs (Şekil 1B) (bkz. Adım 1.1) ECM kaplı 6-şey plakalar üzerine tohum kümeleri hPSC Orta + Y 2 mL iyi ücret ile. Kök hücreler her gün yaklaşık %50 konfluent ve split gerektiği gibi onlar kadar yem.
      1. HPSCs bölmek için 1 mL passaging reaktif wells için ekleyin ve 1 dk. Incubate hücreleri 5 min için oda sıcaklığında hPSC orta 1 mL ekleyin ve toplamları 1:10 yeni ECM kaplı wells hPSC Orta + Y 2 mL başına iyi üzerine split sonra Aspire edin.
    2. Kadar yaklaşık %50 birleşmesi, daha sonra değişiklik medya NM + SB431542 + DMH1 sinirsel farklılaşma (0 gün) ikna etmek için kök hücreleri korumak. Ne zaman yaklaşık % 95 hücrelerdir birleşmesi, aynı ortamda yeni ECM kaplı kuyu içine 1:6 Böl.
    3. 14 günde dekolmanı çözüm ve toplamları oluşumu tanıtmak için Y ile bir sigara kaplı şişesi aktarmak hücrelerle ayırmak.
      Not: Y ek hücre hayatta kalma ve küre oluşumu tanıtmak için kullanılan ancak her besleme sırasında dahil değildir.
    4. Nöronal ataları ve nöronlar (hNeurons) nesil için bu gün-14 hücreler aşağıda açıklandığı gibi kullanın. Alternatif olarak, bu hücreler monolayer veya küre kültürlerden daha sonraki zaman noktalarda nöronal olgunlaşma oluşur veya gliogenesis başlamadan önce kullanmaktadır.
      Not: varsayılan olarak, bu iletişim kuralını dorsal-kortikal astrocytes üretir. Ancak, astrocyte alt türlerinden bölgesel morfojenlerdeki28,32,33istenirse biçimlenme ek belirtilebilir. Retinoik asit (RA) hücre omurilik caudalize için süre sonic kirpi (SHH), fenotipleri agonist (SAG) smoothened veya purmorphamine ventral fenotipleri üretecek eklenebilir.
    5. Astrocyte ataları ve 3D toplamları (hAstrospheres) kendiliğinden oluşan astrocytes nesil, NM + EGF + FGF2 için geçiş ve haftalık (veya sabit pH emin olmak için gerektiği gibi) daha önce ayrıntılı34yem.
      1. Zaman karanlık merkezleri ve görünür kendiliğinden eklemek küreler kaldırmak yavaşça hAstro toplamları dekolmanı çözüm ile ayırmak. Küreler yavaşça küre sağlığını korumak için ve nekrotik çekirdek önlemek için haftada bir kez sonu.
        Not: dekolmanı çözüm ile tedavinin 5 dk fazla olamaz.
      2. Genişleme, 4-6 ay onayladıktan sonra hücre kimliğini ve ya dondurma Orta (göre üretici yönergelerine) veya alternatif depolama koşulları uzun vadeli korunması için sıvı azot veya kullanım için hemen donma deneme.
    6. HAstrospheres donmuş bir hazır yaz için hızlı bir şekilde bir şişe, oda sıcaklığında, bir boş 15 mL konik tüp ve 1 dk. 300 x g , santrifüj içindekilere dikkatle süpernatant Aspire DMEM/F12 ile yıkama ve iki yıkama toplam için tekrar transfer tezcan adımları. T25 şişesi NM, EGF + FGF2 + Y 6 mL toplam hacmi ile eklemek (veya gerektiği gibi büyütmek).
  2. Oluşturmak ve korumak indüklenebilir neurons (iNeurons) hPSCs.
    1. ECM kaplı 6-şey plakaları hPSC Orta + Y 2 mL (yukarıda transgenik olmayan satırları için açıklandığı gibi) iyi ücret ile tohum transgenik hPSCs (ile bir istikrarlı doksisiklin indüklenebilir neurogenin 2 transgene35). Besleme 2 mL % 70 confluency kaldırmaya hazır olana iyi başına medya ile her gün. 2.1.2. adımda açıklandığı gibi hücreleri bölün.
    2. Ne zaman % 35 hücrelerdir konfluent, eklemek NM + Dox farklılaşma iNeurons içine ikna etmek için. NM + Dox monolayer kültür olarak 3,2 adıma geçmeden önce 2 gün boyunca korumak.
      Not: Hücre nöronal ataları geçiş ama değil olacak henüz neurites (Şekil 1 c) genişletir.

3. hazırlık ve 3D küre Cocultures bakım

  1. HAstros (2.1.5.1 adımda anlatıldığı gibi) süspansiyon 3D toplamları üzerinden ayırmak.
  2. HNeurons veya iNeurons üzerinden 2D monolayer ayırmak.
    1. 6-şey tabaktan medyayı çıkarın ve dekolmanı çözeltinin 500 µL her şey monolayer kültürleri içeren ekleyin. 5 dk. yavaşça eklemek için 2-3 mL iliştirilmiş hücrelerdeki kaldırmak için DMEM/F12 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Hücreleri ve 15 mL konik tüp ve santrifüj vasıl 300 x g 1 dk. aspiratı süpernatant, medya toplamak 1 mL taze medya ekleyin ve yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon ulaşmak için hafifçe bir 1000 µL micropipette ile pipet.
  3. Microwell kültür plakaları kullanarak form 3D küre.
    1. Plaka microwell plaka her şey için 0.5 mL Anti-bağlılık yıkama çözeltisi ekleyerek hazırlayın. 2.000 x g 5 dk. aspiratı durulama çözüm için plaka santrifüj kapasitesi, 1 mL DMEM/F12 yıkamak ve tekrar Aspire edin her şey ekleyin.
      Not: Her zaman santrifüj kullanım sırasında dengeli olun.
    2. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak her hücre türü say. Disosiye hAstros ve hNeurons veya iNeurons istenen oranını 2 mL NM + Y (iNeurons kullanılmaktadır Dox içerir) toplam hacmi her kuyuya ekleyin. Plaka 100 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve kuluçka makinesi için dönün.
      Not: 24 de microwell plakaları ( Tablo reçetesigörmek) iyi başına 300 microwells içerir. 6 x 105 hücreleri (2 x 103 hücre her küre için) en az ve en fazla 6 x 106 hücreler (için 2 x 104 hücre her küre) medya iyi başına 2 mL ekleyin. Bu Aralık içindeki belirli bir yoğunluk uygun alanlarda, tanımlanmış bir miktar hücre kullanın ve küre başına hücre sayısını hesaplamak için 300 bölün. Alternatif küre şekillendirme yöntemleri ve araçları da isterseniz yararlı. Hücre yoğunluğu kabul edilebilir aralıkları üreticisinin yönergelerini izleyin.
    3. Hücre içine microwell tabak içinde yoğun paketlenmiş küreler önümüzdeki 2 gün (Şekil 2A) kendi kendine bir araya sağlar. Kültür sararma Eğer % 50 ortamı değiştirin.
      Not: sadece yarısı ortam değişimi ve yavaşça çıkarırken ve ortam küreler rahatsız değil sırayla ekleme pipet. Küre microwells kaldır ve daha yüksek güç ile birlikte sigorta.
    4. 2 gün sonra microwells bir 1000 µL micropipette (Şekil 1 d) ile küreler yavaşça kaldırın. Hafifçe microwells ile herhangi bir ek yapıştırılır küreler kaldırmak için kitle iletişim araçları altına kuvvet uygulamak. Bir 15 mL konik tüp içinde yerleş, eski medya Aspire edin, taze medya ekleyin küreler izin.
  4. 3D küreler şekillendirme için spinner şişesi biyoreaktör sistem kurmak.
    1. % 70 etanol ile manyetik heyecan plaka yüzeyi temizlemek, hücre kültürü kuluçka makinesi yerleştirin. Otoklav bireysel spinner şişe sterilize etmek için.
    2. Her değer değişimi şişesi küreler en az 50-60 mL medya ekleyin (Şekil 1 d, iç metin). 60 rpm'de ayarla manyetik heyecan plaka üzerinde şişeye koyun. Kültür alanlarında kadar veri toplama için hazır değer değişimi şişeler.
      Not: En az 3 hafta kültür synapse oluşumu için gereklidir. Spinner şişesi biyoreaktör sistem istenmiyorsa, küreler hücre kültür şişeler veya yemekleri sabit koşullarında kültürlü. Küreler de ECM veya hidrojel gömülü.

4. Multielectrode diziler (ölçü) ile canlı sinaptik Fizyoloji ölçümü

  1. Bana hücre kültürü için hazırlayın.
    1. Her MEA temiz yüzey 1 mL steril deiyonize (DI) su ile 1 h. durulama için deterjan ile sterilize etmek için % 70 etanol ile durulayın ve biyogüvenlik UV ışık altında dolap kuru hava.
      Not: Bana DI su steril koşullarda 4 ° C'de kullanımı kadar saklanabilir.
    2. Poli-ornitin (PLO) 0,5 mg/mL çözümünün PLO 50 mg 100 mL Borik asit arabelleği içine çözülerek hazırlayın. Her MEA yüzeyle 1 mL yüzey hidrofilik işlemek ve 4 h kaldır FKÖ'ün en az 37 ° C'de kuluçkaya, yüzey DI su ile yıkayın, ECM 1 mL eklemek Devleti'nin kat (bkz. Adım 1.1.1) ve en az 4 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. ECM kaldırmak ve yerine küreler ortam küreler elektrot dizi üzerine konumlandırılmış sağlamak bir MEA yüzeyde 1.5 ml (rakamlar 3A, 3A'). 2 gün boyunca bağlı kalmak için izin verir. 2-3 günde bir (veya daha fazla kez gerekirse), küre değil rahatsız sağlanması medya yarısı değiştirin.
      Not: Ek büyüme faktörlerinin kültür yaşatma ve olgunlaşma artırabilir.
  2. Sinirsel küreler elektriksel aktivitesinin ölçmek.
    1. Isı kontrollü headstage bir multielectrode dizi (MEA) sistemi kurma. Bir yazılım programı 5 Hz yüksek geçiren filtre ve 200 Hz alçak geçiren filtre ve 5 x standart sapma (SD) bir spike eşiği ile oluşturun.
    2. MEA headstage ve kayıt spontan elektriksel aktivite üzerinde (Şekil 3BB') koyun. Spike frekans ve genlik istatistiksel analiz için de dahil olmak üzere ham verileri kaydetmek.
      Not: Bir perfüzyon sistemi ile MEA farmakolojik eklemek veya uzun süreli kayıt için taze medya akışını artırmak için yararlı. Ek Post-Processing sivri istenen36,37gerçekleştirilebilir.

5. Immunocytochemistry ile sinaptik yoğunluğu ölçümü

  1. Reaktifleri hazırlayın.
    1. 500 mL stok çözeltisi % 4 paraformaldehyde (PFA) yapmak için 400 mL 1 x PBS bir cam kabı veya heyecan plaka havalandırılmış başlıklı ekleyin. 60 ° c karıştırma sırasında heyecan bar ve ısı ekleyin; kaynatın değil. 20 g PFA tozu ısıtmalı PBS ekleyin ve yavaş yavaş dropwise 1 N NaOH ekleyerek pH 6,9 için yükseltmek.
      Not: bölünmemeli ve 4 ° C'de depolanmış bir ay için % 4 İngiltere'de yılın çözüm olabilir.
    2. 20 g veya sukroz 30 g sükroz, % 20 ve % 30 çözümler sırasıyla yapmak için PBS için 100 mL ekleyin.
    3. Deterjan 1 mL % 10 hisse senedi çözüm hazırlamak için PBS için 10 mL ekleyin. Homojenize için birkaç kez tersine çevirin.
    4. 250 µL % 10 deterjan hisse senedi çözüm (son konsantrasyonu % 0.25) ve 500 µL her keçi ve eşek serumlar (%5 her son konsantrasyonu) 10 birincil engelleme arabellek hazırlamak için mL için PBS ekleyin.
    5. 100 µL her keçi ve eşek serumlar (Son %1 konsantrasyon) 10 mL ikincil engelleme arabellek hazırlamak için PBS ekleyin.
  2. Numuneleri hazırla.
    1. Küreler 15 mL konik tüp içine transfer tüp alt kısmında yerleşmek izin ve eski medya Aspire edin. Küreler PBS, yerleşmek ve PBS Aspire izin 500 µL ile yıkayın. 4 500 µL Ekle % PFA (veya küreler örtecek kadar) ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya.
    2. PFA Aspire edin ve yavaşça iki kez PBS ile yıkayın. % 20 sükroz çözüm ekleyin ve birkaç saat için 4 ° C'de kuluçkaya veya bir gece. Dikkatle Aspire edin, % 30 sükroz çözüm, ekleyin ve birkaç saat için 4 ° C'de kuluçkaya veya bir gece.
      Not: Örnekleri PBS veya sukroz 4 ° C'de için sonraki adıma devam etmeden önce 1 hafta kadar depolanabilir. Değilse dilimleme, 3D küre (Şekil 4A-C) bir 1,5 mL tüp olarak korumak ve 5.3 adıma geçin.
    3. Dikkatle küreler dilimleme, küreler bir gömme kriyojenik kalıp Kuru buz üzerine aktarın. % 30 sükroz çözüm Aspire edin ve yavaş yavaş kadar tamamen hava kabarcıkları kaçınarak örnek kapsar çözüm kalıp içine gömme doku dökün. Çözüm donuyor ve-80 ° C'de cryostat Dilimleme kadar saklamak kadar bekleyin.
    4. -20 ° C, dilim katıştırılmış blokları 30 µm bölümlere (veya istediğiniz gibi) ve cam slaytlara transferi bir cryostat kullanarak. -80 ° C'de leke için hazır kadar saklayın.
  3. Immunostain küre.
    1. Slaytların kenarlarını sıvı dökülmesi önlemek için bir hidrofobik PAP kalemle anahat. Birincil ve ikincil engelleme çözümleri ( Tablo reçetesigörmek) antikorları ile hazırlayın. Her slayta veya tüp birincil engelleme arabelleği 500 µL eklemek ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Sıvı kaldırmak, taze birincil engelleme arabelleği seyreltilmiş birincil antikorlar ile 500 µL her slayta veya tüp eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Birincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
    3. Her slayt veya tüp 500 µL seyreltilmiş ikincil antikorlar ile ikincil engelleme arabelleği ekler ve 1 h. ikincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ile 3 x 10 min için yıkama için 4 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Tablo reçetesiönerilen antikorlar listesi sağlanır. Diğer antikorlar veya boyalar kullanılıyor olabilir istediğiniz gibi. Floresan örnekleri (ileriye adım 5.3.3) gün ışığına maruz bırakmayın.
    4. Çözüm dropwise ve bir coverslip kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde dikkatle yer yüzey kapağı montaj 50 µL ekleyin. Slaytlar için 24 saat oda sıcaklığında kuru ve 4 ° C'de depolamak izin
  4. Slaytları görüntü.
    1. 63 X yağı daldırma amaç görüntü öncesi ve sonrası sinaptik protein bereket ve colocalization içinde küre dilimleri (Şekil 4 d) ile confocal veya iki fotonlu floresan mikroskop kullanın. X 20 veya 40 X amaç hAstros morfolojik özellikleri görselleştirmek için kullanın.
    2. ImageJ yazılımı ile açık floresan görüntü dosyaları. Kullanarak el ile hücre tarafsız bir sayım yöntemi daha önce ayrıntılı38olarak veya alternatif yöntemler kullanarak sayaç eklentisi, öncesi ve sonrası sinaptik puncta saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzgün gerçekleştirildiğinde bu protokolü hPSCs (Şekil 1A-1C), oluşturulan astrocytes28,33,34 ve neurons35 işlevsel cocultures tanımlanmış nüfus olarak üretecek daha önce26 detaylı ve burada açıklanan adımları 2.1-2.2. Microwell levha, kullanımı ile kademeli bu yordamı tutarlı boyutu ve şekli (adım 3.3;...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için sinirsel cocultures 3D küre imalatı için sistematik bir yöntem açıklanmaktadır. Küre astrocytes ve bağımsız olarak hPSCs elde edilen neurons oluşur. Odağı değil bu protokol rağmen saf astrocytes hPSCs28 üzerinden olasılığını nesil kritik bir adımdır ve deneyiminiz gerçekleştirdiyseniz Teknik olarak zor olabilir. Bu ilk adım bu sinaptik Mikri şemalar nesil titiz zamanlama ve detaylara dikkat ile yapılmalıdır. HPSC elde edilen astrocytes kullanımı uzun Farklılaşma süreci kısıtlamadı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Erik Ullianlıların (UCSF) tasarımı iNeuron farklılaşması üzerine teknik danışmanlık için Dr Michael Ward (NIH) ve Saba Barlas ön görüntü analizi için bu yordamları, entelektüel girişi için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyulu plakaFisher Scientific08-772-1B
15 mL konik tüplerOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLAyırma çözümü
AggreWell plakaKök Hücre Teknolojileri34850
Yapışma Önleyici DurulamaÇözeltisi Kök Hücre Teknolojileri7010Hücreyi önleyin Mikrokuyu plakalarına yapışma
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Ortam Takviyesi
BrainPhys nöronal ortamKök Hücre Teknolojileri5790Nörofizyolojik bazal ortam alternatifi
Dairesel cam lamellerNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Kök Hücre Teknolojiler7930%10 DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042GlutaMAX takviyeli
DMH-1Kök Hücre Teknolojileri73634TEHLİKE: Yutulması halinde toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 μ M Eşek
serumuLampire Biyolojik Laboratuvarları7332100Çalışma konsantrasyonu: Birincil engelleme tamponunda %5, ikincil engelleme tamponunda %1
Doksisiklin Hidroklorür (Dox)SigmaD3072-1mlTEHLİKE: Hamile kadınlar için toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 μ g/mL
Epidermal büyüme faktörü (EGF)PeprotechAF-100-15Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL
Fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF)Peprotech100-18BÇalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL
Fluoromount-G montaj solüsyonuSouthern Biotech0100-01
Cam kaydıraklarFisherbrand22-037-246
Keçi serumuLampire Biyolojik Laboratuvarları7332500Çalışma konsantrasyonu: Birincil blokaj tamponunda %5, ikincil blokaj tamponunda %1
Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı
Yaşam Teknolojileri Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL
Manyetik plakaDLAB8030170200
Matrigel membran matrisiCorning354230ECM kaplama çözümü. Çalışma konsantrasyonu: 80 μ g/ml'dir. Buz üzerinde hazırlayın ve pipetlerin, tüplerin ve ortamın önceden soğutulduğundan emin olun.
MEA 2100 SistemÇok Kanallı SistemlerMEA2100
Montaj çözümü
N2Thermofisher17502048Ortam Takviyesi
OCTTissue-Tek4583Kriyoseksiyon için doku gömme çözümü
Pap Pen (Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
Paraformaldehit ( PFA)Acros Organics169650025TEHLİKE: Solunması halinde toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: PBS'de %4
Fosfat tamponlu salin (PBS)Kök Hücre TeknolojileriCA008-300
Poli-l-ornitin (PLO)SigmaP3655-100MGÇalışma konsantrasyonu: 0.5 mg / mL
Dikdörtgen cam kapak kaymalarıFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRKök Hücre Teknolojileri5872Ayrılma ve pasaj reaktif
Rho-Kinaz İnhibitörü Y27632- (Y)Tocris1254Çalışma konsantrasyonu: 10 uM
SB431542Kök Hücre Teknolojileri72234Çalışma konsantrasyonu: 2 μ M
Döner şişelerFisher Scientific4500-125
SükrozFisher KimyasalS5-3Çalışma konsantrasyonu: PBS T25 Kültür Şişesinde %20 veya %30
Olympus Plastics25-207Havalandırmalı kapaklar
T75 Kültür ŞişesiOlympus Plastics25-209Havalandırmalı kapaklar
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADeterjan. Çalışma konsantrasyonu:% 1
TeSR-E8 bazal ortamKök Hücre Teknolojileri5940İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) ortamı
TeSR-E8 takviyeleriKök Hücre Teknolojileri5940İnsan pluripotent kök hücre ortamı için takviyeler
TritonX-100SigmaX100-500MLHücre geçirgenliği için deterjan. Çalışma konsantrasyonu: Blokaj tamponunda% 0.25
Tripan mavisiInvitrogenT10282
Antikorlar< / güçlü >
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029İkincil antikor
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037İkincil antikor
EzrinThermofisherMA5-13862Birincil antikor; astrositler perisinaptik
GFAPChemiconMAB360Birincil antikor; astrositler
GFPAvesGFP-1020Birincil antikor; astrositler
. Jeffrey Rothstein'danGlt1n/aBirincil antikor; astrositler
HomerSinaptik Sistemler160 011Birincil antikor; nöronlar, post-sinaptik
MAP2Sinaptik Sistemler188 004Birincil antikor; nöronlar
PSD95Abcamab2723Birincil antikor; nöronlar, post-sinaptik
S100Abcamab868Birincil antikor; astrositler
Sinapsin 1Sinaptik Sistemler106 103Birincil antikor; nöronlar, pre-sinaptik
TuJ1/β 3-tübülin (TUBB3)CovanceMMS-435PBirincil antikor; nöronlar
içeren kriyoprezervasyon ortamı Heparin Sigma H3149-50KU AMQAX1000 Dr Hediyesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106(2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474(2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626(2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286(2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181(2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423(2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B N ral Kok lt rlerAstrosit N ron Kok lt rSinaptik Devre Olu umuok Elektrotlu Dizi AnaliziN ral nd ksiyon ProtokolH cre Disosiyasyon Tekni iSfer Olu turma Y ntemimmunboyama AnaliziSpontan A Patlamalar

İlgili makaleler