Yöntem makalesi

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

DOI:

10.3791/58056

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada kollarındaki kullandığımız, x-ışını nasıl inhibe mTOR etkinlik çalışmaya ve pozitron emisyon tomografi/bilgisayarlı tomografi Imaging etkileri myeloma kemik iliği engrafted tümörler bir xenograft modeli. Bu myeloma kemik iliği engrafted tümör vivo içindehedefleme terapiler Anti-miyelom etkisini fizyolojik ilgili, non-invaziv ve multimodal analizleri için sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipl Miyelom (MM) tümörler kemik iliği (BM) engraft ve onların hayatta kalma ve ilerleme içinde bu microenvironment var karmaşık moleküler ve hücresel etkileşimlerin üzerine bağlıdır. Henüz BM microenvironment potansiyel olarak birçok vitro ve ex vivo deneysel model fizyolojik alaka sınırlayan kolayca çoğaltılmış vitro, olamaz. Hangi luciferase (LUC) xenograft modelinde kullanarak bu sorunları üstesinden gelebilir-transfected 8226 MM hücreleri özellikle fare iskeleti engraft. Bu fareler uygun substrat verildiğinde, D-biyoluminesans, tümör büyüme ve hayatta kalma tedavisinin etkileri tümörleri içinde vivotarafından üretilen kollarındaki görüntüleri (BLI) değişiklikleri ölçerek analiz edilebilir. Bu BLI veri metabolik işaretçisi 2 kullanarak pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi (PET/CT) analizi ile kombine-deoksi - 2-(18F) fluoro-D-glukoz (18F-FDG) tümör metabolizma zaman içinde değişiklikleri izlemek için kullanılır. Tümör/BM microenvironment içinde birden çok invaziv olmayan ölçümler için görüntüleme bu platformlar sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM malign plazma B-hücreleri BM sızmak ve kemik yıkımı, anemi, böbrek bozukluğu ve enfeksiyon neden oluşur tedavisi olmayan bir hastalıktır. MM ve iskelet2dahil etmek için en sık kanser % 10 - % 15'tüm hematolojik maligniteler1 yapar. Oncogenic dönüşümün lenfoid doku germinal merkezleri sonunda BM3' e homing önce kurulan uzun ömürlü plazma hücrelerinin MM gelişimi kaynaklanmaktadır. BM tarafından son derece heterojen nişler karakterizedir; farklı ve kritik hücresel bileşenleri, düşük pO2 (hipoksi), geniş vaskülarizasyon, karmaşık ekstraselüler matrisler ve tüm bunlar MM tumorgenesis4' e katkıda bulunur, sitokin ve büyüme faktörü ağları da dahil olmak üzere. Böylece, kesinlikle BM engrafted tümörler ile karakterize Dissemine bir MM xenograft model geliştirilmesi MM patoloji vivo içinde5,6eğitim için çok güçlü ve klinik bir araç olacaktır. Ancak, çok sayıda teknik engellerin en xenograft modelleri, yapım onları uygulamak zor ve pahalı etkinliğini sınırlayabilirsiniz. Bu yetenek doğrudan gözlemlemek ve gerek kalmadan değişiklikleri tümör büyüme/hayatta kalma ölçmek için tutarlı ve tekrarlanabilir tümör engraftment tümör gelişimi ve sınırlamalar uzun bir zaman içinde BM niş ile ilgili sorunları içerir Fareler deney7,8ders sırasında kurban.

Bu iletişim kuralı başlangıçta Miyakawa vd tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş xenograft modeli kullanır 9içinde bir intravenöz (IV) meydan okuma miyelom hücreleri ile sonuçlanır, "yaygın" tutarlı ve tekrarlanarak NOD/SCID/IL-2γ(null) BM (takoz) fareler10' engraft tümörler. Situ görselleştirme bu tümörlerin 8226 insan MM hücre kültürünü istikrarlı transfection LUC alleli ile elde edilir ve bu engrafted tümör hücreleri6tarafından üretilen seri olarak BLI değişimler ölçme. Önemlisi, bu model çeşitli diğer LUC ifade insan MM hücre satırları (Örneğin, U266 ve OPM2) yararlanmak için özellikle NOG fareler iskeleti engraft için benzer bir eğilimi ile genişletilebilir. Tümör yanında farelerin kollarındaki düşsel tanımlaması (örneğin 18F-FDG) proton probları PET/CT birlikte tarafından alımını ölçerek takip edilir, bu biyokimyasal ek karakterizasyonu kritik için sağlar yolları (yani, metabolizma, hipoksi değişimler ve Apoptozis indüksiyon) tümör/BM microenvironment içinde. Bu model büyük gücü radiolabeled, kollarındaki ve floresan problar ve MM ilerleme ve patoloji içinde vivoeğitim için kullanılan işaretleri geniş kullanılabilirlik tarafından vurgulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda açıklanan tüm hayvan yordamlar kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) büyük Los Angeles VA sağlık sisteminin tarafından kabul edildi ve patojen ücretsiz ve steril koşullarda gerçekleştirilmiştir.

1. hazırlanması 8226 hücrelerinin (8226-LUC) Luciferase ifade

  1. İnsan MM hücre kültürünü 8226, % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin % 95 hava ve %5 karbondioksit (CO2) içeren bir oksijen atmosferde 37 ° C'de ile takıma RPMI-1640 ortamda korumak.
  2. İstikrarlı LUC ifade muhabir 8226 hücreler üretmek transfecting 1 x 10 tarafından açıklanan6 8226 hücrelerinin bir seçim hygromycin (100-350 mg/mL) ile daha önce takip luciferase muhabir vektör ile6.
  3. Koşullarda orta kadar stabil transfected 8226 hücre kültürünü kurulması oluşturulan her geçen gün değişen standart steril kodlamayla için 2-3 hafta, hücreleri korumak.
  4. Transfected 1 x 106 hücreler/100 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) in vitro luciferase faaliyette luciferase substrat, D-biyoluminesans ekleyerek onaylamak (150 µg/mL çalışma çözüm prewarmed kültür ortamında) ve ölçme bir tüp veya luminometer6kullanarak 96-şey plaka hücrelerde biyolüminesans.

2. Orthotopic Xenograft modeli

  1. NOG fareler (4-6 hafta yaşlı, erkek veya kadın) bir uygun hayvan bakımı tesiste steril/patojen-Alerjik koşullarda korumak.
  2. 8226 LUC transfected hücreleri denemenin gün NOG fareler (~ 5 x 106 hücreler/fare) içine IV enjeksiyon için hazır olun. 3 hücreleri yıkama x buz gibi PBS, onları saymak ve onları buz gibi PBS (eksi antibiyotik ve FBS) içinde 5 x 106 hücreler/200 µL PBS, son bir konsantrasyon resuspend) steril bir test tüpü içinde. Hücreler buz tutmak ve en kısa zamanda (içinde 30-120 dk) fareler zor.
  3. Fare (ile isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve hayvan uzakta karşı karşıya kafa ile bir Isıtma yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anesthetization ayak parmak pinching tarafından kontrol. Oftalmik merhem gözler için geçerlidir.
  4. 1 mL insülin şırınga ve 26-G iğne kullanarak 8226-LUC hücrelere fare kuyruğu ven (200 µL/enjeksiyon) yoluyla enjekte.
    Not: A ısı lamba böylece damar genişletici ve enjeksiyonları etkinliği artan kuyruk ısıtmak için kullanılabilir.
  5. Hayvan ev onların kafes dönmek ve onlar tamamen iyileşti kadar hayvanları izlemek.
  6. Engraftment fare iskelet 8226-LUC hücrelerinin (aşağıda açıklanan ve Şekil 1Aile gösterilen) imzalat farelerde BLI ölçerek onaylayın.
    Not: BM exudates da insan CD45 ifade akış sitometresi (Şekil 1B) kullanarak veya hasat kemik (Şekil 1 c) immünhistokimya boyanabilen.

3. BLI Vivo içinde ölçümü

Not: Genellikle, ölçülebilir BLI farelerde engrafted tümör gelen ilk 10-20 gün postchallenge arasında görülebilir ancak bu deneysel olarak belirlenecek gerekebilir.

  1. Fare (ile isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve ayak parmak pinching tarafından anesthetization düzeyini kontrol edin. Oftalmik merhem gözleri için geçerlidir.
  2. Hayvan bir IP (200 µL/enjeksiyon), iğne "in vivo-sınıf" D-biyoluminesans substrat (30 mg/mL steril serum fizyolojik içinde seyreltilmiş).
  3. (BLI etkinlik observable için 45-60 dakikaya kadar farelerde olmasına rağmen) biyoluminesans substrat enjeksiyon takip BLI 5-10 dakika içinde ölçmek, küçük hayvan görüntüleme sistemi (Şekil 2 sırtüstü pozisyonda imzalat hayvan yerleştirerek ). Işıksaçan ve x-ışını analiz seçin ve görüntüleri (Şekil 3).
    1. Faiz (ROIs) düşsel bilgisayar yazılımı (Şekil 4) kullanarak seçili bölgelerinde ortalama parlaklık (fotonlar/s/cm2/steradian) ölçmek.
    2. Hayvan ev onun kafes dönmek ve tam olarak (yaklaşık 15-20 dk) kurtarıldı kadar izlemek.

4. fare hedefe yönelik tedavi ile tedavi

  1. Temel BLI ölçmek ve hayvanları tedavi gruplara (4-8 fareler/grup) rastgele.
  2. Fareyi kullanarak beş günlük IP enjeksiyonları dinlenme ve ek beş günlük enjeksiyonları11tarafından 2 gün takip ettim bir rejimi temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg fare) bir IP enjeksiyon (200 µL/enjeksiyon) ile tedavi.
  3. Luciferase aktivite (fotonlar/s/cm2/steradian) ölçmek Bölüm 3 ve arsa BLI değişim zaman içinde açıklandığı gibi haftada 2 x. Tümör değişimler BLI fareler (Şekil 5B) seri görüntü olarak sunulabilir.
    Not: Aşağıdaki belirtilerle (genellikle 45-60 gün içinde ilk Challenge) mevcut kadar günlük hayvanların izleme gerçekleştirilmesi önerilir: kilo kaybı (ağırlık implantasyon öncesinde göre % 10'den fazla kayıp) ve/veya hind Kol felci, hangi zamanda servikal çıkığı tarafından takip CO2 odası kullanarak onlar euthanized.

5. PET/BT Analizi 18F-FDG ölçmek tümör metabolizmasında değiştirir.

  1. Ev onların kafes hayvanlarda onların yiyecek için 24 saat önce 18F-FDG aşırı non-spesifik alımını önlemek için deney kaldırarak hızlı.
  2. 18FDG PET F radiolabeled sondalar (50-100 steril serum fizyolojik içinde µCi/enjeksiyon) deneme günü hazır olun. Saat ve 18F-FDG soruşturma faaliyetleri ile bir doz Kalibratör kaydedin.
    Not: 18F nispeten kısa yarılanma (~ 2 h) olduğundan, dikkatli bir hazırlık ve planlama Bu sondalar kullanım için oluşturulmalıdır.
  3. Hayvanla (isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve uzağa bakan kafa ile bir Isıtma yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anesthetization ayak parmak pinching tarafından kontrol. Oftalmik merhem gözleri için geçerlidir.
  4. Sonda ile korumalı 1 mL insülin şırınga ve 26-G iğne kullanarak kuyruk ven (100 µL/enjeksiyon) enjekte.
    Not: A ısı lamba böylece damar genişletici ve enjeksiyonları etkinliği artan kuyruk ısıtmak için kullanılabilir.
  5. İğne/şırıngada bir doz Kalibratör kalan radyoaktivite ölçmek ve etkinlik ve zamanı not edin.
    Not: Fare kuluçka, doz ve zamanlama standardizasyon veri tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir sağlamak için önemlidir.
  6. Anestezi altında ve sonda alımı (~ 45-90 dk) bütün döneminde bir ısıtma yastığını kullanarak 37 ° C'de fareler korumak.
    Not: Fareler durgun ve 37 ° C de sonda non-spesifik alımını önlemek için kalır önemlidir.
  7. Aralıklarla benzer etiketleme kez farelerde sağlamak için yaklaşık 20 - 30 dk 18F-FDG sonda enjeksiyonlari bocalama.
    Not: Uygun iş akışı ve sonda enjeksiyonları zamanlaması en uygun ve tekrarlanabilir görüntüleme koşullarında neden olur.
  8. 18F-FDG etkinliği bir PET/CT küçük hayvan görüntüleme sistemi seçilen bölgelerde ilgi engrafted tümörler (Şekil 6) karşılık gelen ölçü birimi.
    Not: Başlangıçta, 10dk statik evde beslenen hayvan poz ve 2-min CT pozlama tavsiye edilir, ancak tam pozlama süreleri deneysel olarak belirlenecek gerekebilir.
  9. Hayvanlar için ev onların kafes dönmek ve onları tamamen iyileşti kadar izlemek. Arka plan seviyelere sonda bozunmaları ise 24 h için özel bir dönüş Oda farelerde ev.
    Not: 18F kısa yarılanma nedeniyle, taze bir sonda kullanarak birden çok ölçüleri haftada 2 x olarak sık sık yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuamöz MM tümörler kolayca edildi (% 100 başarı oranı) oluşan, ancak ilk pilot çalışmalarda 8226-LUC hücreleri IV enjeksiyonu NOD/SCID fareler içine BM-engrafted MM, geliştirmek tümörler değil. Buna ek olarak, IV zorluklar NOG fareler içine 8226 hücrelerle (15-25 gün içinde) tümör iskelet (ve karaciğer ve dalak gibi sigara-İskelet dokusunda tek nadiren oluşan tümörler) oluşturulur. Tümör iskelet içinde görsel olarak fiziksel olarak hayvanlar inceleyerek onaylanamadı beri başarılı tümör e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preklinik xenograft modelleri MM6,9,11,12,13çeşitli rağmen BM microenvironment içinde tümör/BM etkileşimleri çalışma yeteneği zor kalır 14. iskelet NOG farelerin 8226-LUC tümör hücrelerinin hızlı ve tekrarlanabilir engraftment için burada açıklanan teknikler sağlar.

Bu iletişim kuralı kritik adımlarda lucifer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Kevin Francis Perkin-Elmer bir çalışandır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser VA hak grant1I01BX001532 gelen Amerika Birleşik Devletleri Bakanlığı gazileri işleri Biyomedikal Laboratuvarı araştırma tarafından desteklenen ve geliştirme hizmeti (uymuyor) PF ve ak VA klinik bilim R & D hizmet (destek kabul eder. Liyakat Ödülü I01CX001388) ve VA rehabilitasyon R & D hizmet (Merit Ödülü I01RX002604). Daha fazla destek bir UCLA öğretim tohum hibe JK için geldi. Bu içeriği mutlaka bize Department of Veterans Affairs veya ABD hükümeti görüşlerini temsil etmemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
8226 insan miyelom hücre hattıATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Fareler (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Luciferin substratıPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPL HP1-100
PE-CD45 (klon H130)BD Biosciences555483insan CD45+ tümör hücrelerini tanımlamak için akış sitometrisi için kullanılır
Teknoloji70527Eksize edilmiş kemiğin İmmünohistokimyası için kullanılan birincil antikor
Keçi Anti-tavşan IgG (HRP konjuge)ABCAMab205718Eksize edilen kemiğin İmmünohistokimyası için kullanılan İkincil antikor
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1910
pGL4.5 Lusiferaz Raportör VektörPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In Vivo Görüntüleme SistemiPerkin Elmer
Sofie G8 PET/CT Görüntüleme SistemiPerkin Elmer
BM eksüda tavşan anti-insan CD45 (klon D3F8Q) içindeki .

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
  2. Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135(2012).
  3. Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
  4. Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
  5. Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).
  6. Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
  7. Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
  8. Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
  9. Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
  10. Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  11. Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
  12. Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
  13. Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
  14. Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641(2013).
  15. Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
  16. Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
  17. Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
  18. Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyol minesans G r nt lemePET BT G r nt lemeXenograft ModeliTemsirolimus TedavisiD Lusiferin Substrat18F FDG ProbuK k Hayvan G r nt leme

İlgili makaleler