Burada, kantitatif spektrofotometrik yöntemle Synechocystis cyanobacterium phycobiliprotein içeriğini belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Çıkarma yordamı diğer Siyanobakteriler ve yosun suşları için de başarıyla uygulandı; Ancak, pigment soğurma spektrumları farklılığı nedeniyle, tek tek her zorlanma için spektrofotometrik denklemler test gereklidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini
Bu makalede
Özet
Özet
Bu modeli cyanobacterium Synechocystisiçeriğinde phycobiliprotein kantitatif tayini için basit bir protokoldür. Phycobiliproteins phycobilisomes, büyük ışık-hasat anten Siyanobakteriler içinde en önemli bileşenleri ve birkaç yosun özellikleri vardır. Synechocystis phycobilisomes iki phycobiliproteins içerir: phycocyanin ve allophycocyanin. Bu iletişim kuralı, verimli, basit ve güvenilir yöntem phycocyanin ve allophycocyanin bu modeli cyanobacterium yılında niceliksel belirlenmesi için açıklar. Biz phycobiliprotein çıkarma ve spektrofotometrik miktar birkaç yöntem göre. Bu protokol için açıklandığı gibi çıkarma yordamı Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., gibi diğer Siyanobakteriler suşları için de başarıyla uygulandı ve Nostoc sp., de kırmızı alg Porphyridium cruentumolarak. Ancak, çeşitli özellikleri üzerinden belirli phycobiliproteins tükenme katsayıları farklı olabilir ve bu nedenle, tek tek tek her zorlanma için spektrofotometrik miktar yöntemi doğrulamak için tavsiye edilir. Protokol az zaman gerektirir ve yalnızca standart donanım gerektirir beri herhangi bir standart yaşam bilim laboratuarında gerçekleştirilebilir.
Giriş
fPhycobiliproteins prokaryotik Siyanobakteriler (Cyanophyta) ışık-hasat anten ve birçok ökaryotik takson (Glaucophyta, Rhodophyta ana bileşenlerini temsil suda çözünen pigment-protein kompleksleri vardır ve Cryptophyta)1. Bunlar esas supramolecular kompleksleri phycobilisomes denilen ortaya ve fotosentetik membran yüzeyine stromal tarafında, Cryptophytanereye phycobiliproteins lokalize dışında genellikle takıldıkları thylakoid lümen2. Phycobiliproteins dört tür tarihine kadar tespit edilmiştir: çekirdek allophycocyanin ve periferik phycocyanin, phycoerythrin ve phycoerythrocya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Siyanobakteriler ekimi
- Synechocystis hücreleri Erlenmeyer şişe veya < 10 (17 mM HEPES10kullanarakÖrneğin,) pH korumak için arabelleğe alınan BG11 orta20 photobioreactors10,19 yetiştirmek.
Not: Standart yetiştirme koşulları kontrollü bir sıcaklık gereklidir (genellikle, 30 ° C, en uygun sıcaklık 35 ° C olur)21, aydınlatma (tipik olarak, bir ışık bir yoğunluk en fazla 800 µmol [fotonlar] / [m2·s])21ve bir CO 2 kaynağı (400 mL düz panel photobioreactor CO<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlk yöntem sınavlara Erlenmeyer şişe üzerinde bir shaker kültürlerde toplu olarak ekili Synechocystis (17 mM HEPES ile desteklenmiş) BG11 ekimi orta-20 dakika 50 µmol (fotonlar) bir yoğunluk sıcak bir beyaz ışık altında 25 ° C / (m 2·s) ve kodlamayla atmosferde % 1 CO2 . Ekimi sırasında kültür güvenli kilit tüpler için örnek ve (15.000 x g 5 min için laboratuvar sıcaklığında) centrifuged, süpernatant atıldı ve örnekleri ya-80.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı modeli cyanobacterium Synechocystisiçeriğinde phycobiliprotein miktar için basit, hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi açıklar. Hücre homojenizasyon, protein çıkarma ve phycocyanin ve allophycocyanin miktar birkaç yöntem karşılaştırılır ve son iletişim kuralı tek her yordam en iyi adımlardan bir birleşimini temsil eder. Temsilcisi veri phycobiliproteins içeriğini ışık şiddeti artan altında Synechocystis hücrelerdeki sayısal. Labaratuar donanımları daha önce yayımlanmış yöntemleri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Protokol bir önceki yayın11kabul edilmiştir. T. desteklenen Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor ulusal sürdürülebilirlik programı içinde Çek Cumhuriyeti tarafından Z., ö. bölüm ve J. Č. ben (NPU ben), sayı LO1415 verin. J. Č. Ayrıca GA CR, Grant sayı 18-24397S tarafından desteklenmiştir. Erişim cihazları ve diğer özellikler için Çek araştırma altyapı sistemleri biyoloji C4SYS (proje yok LM2015055) tarafından desteklenmiştir. M. A. S. Rus Bilim Vakfı [No 14-14-00904] bir hibe tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, Fransa | 6803 | Siyanobakteri suşu |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya | 9143.1 | Fosfat Tamponlu Salin (PBS) çözeltisi, pH 7.4 |
| Eppendorf güvenli kilitli tüpler ve nbsp; | Eppendorf, Hamburk, Almanya | 30120086 | Kilitli tüpler 1,5 ml |
| VWR 80'li Depolama Sistemi | VWR International, Radnor, Pensilvanya, ABD | 30128-282 | Güvenli kilitli tüpler için tutucu |
| RAININ 100 ve mikro; L -1000 ve mikro; l | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, ABD | 17014382 | Pipet |
| GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, ABD | 30389272 | Pipet uçları |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Almanya | 4701 | 1,5 ml kilitli tüpler ve 15 ml konik santrifüj tüpleri için soğutmalı santrifüj |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, İsviçre | 9005382197172 Buzdolabı ve dondurucu -20 ° C | |
| Revco ExF -86 derece; C Dik Ultra Düşük Sıcaklık Dondurucu | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD | EXF24086V | Dondurucu -80 ° C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerø d, Danimarka | 7.001.000.615 | Dondurarak kurutucu |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japonya | UV-2600 | Spektrofotometre |
| Hellma absorpsiyon küvetleri, yarı Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | Z600288 | VIS/UV-VIS yarı mikro küvetler 0.75-1.5 ml, spektral aralık 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Lihtenştayn | 602286WU | Homojenizatör |
| Masif cam boncuklar | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | Z273627 | Çapı 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Gö ttingen, Almanya | SECURA225D-1OBR | |
| Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | P2172 | Phycocyanin standardı |
| Allofikosiyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | A7472 | Allofikosiyanin standardı |
| Bikinkoninik Asit Kiti ve nbsp; | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | BCA1, B9643 | Toplam protein tayini için komple kit |
| AlgaeTron | Foton Sistem Aletleri Ltd., Drá sov, Çek Cumhuriyeti | AG 130-ECO | Kontrol edilebilir ışık ve atmosfere sahip E. şişeleri için yetiştirme odası |
| Fotobiyoreaktör | Foton Sistemi Aletleri Ltd., Drá sov, Çek Cumhuriyeti | FMT-150 | Tamamen kontrol edilebilir ortam ile siyanobakteriler ve algler için yetiştirme ekipmanları |
| Selometre | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, ABD | Otomatik M10 | Hücre sayacı |
| Corning 15 mL santrifüj tüpleri | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD | CLS430791 | Kuru ağırlık örneklemesi için 15 ml Santrifüj tüpü |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD | 51024579 | Laminer akış başlığı |
Kaynaklar
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
