Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

12.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

16 Kasım 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Bu makalede

Özet

Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.

Özet

Büyük sendikasız kemik kırıkları ortopedik cerrahi önemli bir sorun vardır. Auto - ve allojenik kemik grefti böyle lezyonlar iyileşmek için mükemmel olmakla birlikte, onların kullanımı ile potansiyel komplikasyonları vardır. Böylece, maddi bilim adamları bu sorunların üstesinden gelmek için sentetik, biyouyumlu Biyomalzeme geliştiriyoruz. Bu çalışmada, Biyomalzemeler kemik onarımı için değerlendirmek için çok disiplinli bir platform sunuyoruz. Biz uzmanlık kemik biyoloji ve İmmünoloji vitro osteoklast (OC) ve osteoblast (OB) deneyleri ve kemik onarımı, immünojenisite ve alerjenite vivo içinde fare modelleri de dahil olmak üzere bir platform geliştirmek için birlikte. Biz nasıl deneyler yapmak, sonuçları özetlemek ve raporlamak biomaterial biyouyumluluk göstermektedir. Özellikle, test ettik OB canlılığı, farklılaşma ve Qafqaz ve OC canlılığı ve farklılaşma β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) diskleri bağlamında. Ayrıca kemik grefti kemik kritik ölçekli kusur fare modeli tamir için klinik olarak kemik iyileşme erken faz üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılan piyasada bulunan bir malzeme olan bir β-TCP/kollajen (β-TCP/C) köpük test ettik. Paralel deneylerde, bağışıklık ve alerjik tepkiler farelerde değerlendirildi. Yaklaşımımız bir kemik biomaterial kemik iyileşmesi ve hastalarda onarım için kullanılan Biyomalzeme biyouyumluluk tahmin için gerekli parametreleri bir dizi ile bir biyolojik uyumluluk profili oluşturur.

Giriş

Kemik onarımı ile hematom oluşumu, inflamasyon başlar karmaşık bir süreçtir, oluşumu ve1,2remodeling Nasıra. Ancak, kemik rejenerasyon olası kemik kırığı1,3boyut için sınırlıdır. Örneğin, büyük kemik kırıkları nedeni travma, kanser veya osteoporoz değil iyileşmek olmayabilir ve sendikasız kemik kırıkları denir. Bu kemik lezyonlar genellikle sağlıklı fizyolojik kemik onarım ve rejenerasyon teşvik için tedavi gerektirir. Şu anda, otogrefti ve homogreft kemik nakli seçim4 2.2 milyon kemik değiştirme işlemleri ile yaklaşımdır her yıl5. Gerçi bu yordamları yüksek başarı oranı var, komplikasyonlar, kemik, enfeksiyon, donör sitesi morbidite ve ret4Örneğin, sınırlı yer olabilir. Kemik doku mühendisliği için yeni alternatifler bu sorunları ele almak üzere aranan.

Doğal veya sentetik polimerler, biyo seramik veya metaller hücreleri ve biyoaktif molekülleri ile birlikte bağlı Biyomalzeme üzerinde artış6tasarımıdır. Mekanik özellikleri gibi multipl faktörler ve dolaşım ve kırık site7 hücreleri de dahil olmak üzere birden fazla yerel ve sistemik faktörleri geçerli şifa ve biyomalzeme bağlamında şifa fizyolojik kemik anlayışımızı bağlıdır ,8,9. Biyomalzeme kemik rejenerasyon için osteogenicity ve osseointegration10 tanıtmak için amaç ve ideal biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve gözenekli (hücre göç, oksijen ve besin teşvik). Aynı zamanda ağrı gidermek için kırık sitesini desteklemek için yeterince güçlü olması gerek. Ayrıca, inflamatuar faktörlerin iyileşme süreci başlatmak için gereklidir. Ancak, biomaterial aşırı inflamasyon ve alerjik tepkiler neden olmaktadır, bu sınırlamak veya kemik11,12şifa inhibe. Böylece, disiplinler arası bir yaklaşım kemik onarım için geliştirilen Biyomalzeme değerlendirmek gereklidir.

Bu çalışmada, biz önceden klinik değerlendirme 1) Orthovita trikalsiyum fosfat oluşan bir piyasada bulunan Süngerimsi Kemik Grefti İkamesi olan köpük nanometre boyutunda saf β-trikalsiyum oluşan Vitoss temsilcisi malzemelerin mevcut fosfat (β-TCP) parçacıklar ve Type 1 sığır kollajen (C) (β-TCP/C köpük) ve 2) β-TCP diskler. Burada, biz birincil osteoblast (OB) kullanarak bu Biyomalzeme biyouyumluluk test göstermek ve osteoklast (OC) deneyleri, in vivo modeli kemik onarımı, vitro T lenfosit proliferasyonu oluşan immünolojik bir değerlendirme ve sitokin üretim ve in vivo immünojenisite ve alerjenite, daha önce bildirilen13olarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yordamlar bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Avusturya Bakanlığı Eğitim, bilim ve araştırma için tüm yönergeleri izleyerek BALB/c fareler ile yapıldı ve eğitim, bilim Avusturya Bakanlığı Etik Komitesi tarafından kabul edildi ve araştırma.

1. birincil fare OB kültür

  1. Kullanarak tekrar tekrar enzimatik sindirim yenidoğan fare calvaria OB izolasyon
    1. 1-2 gün eski yenidoğan pups (Toplam 60) işten çıkarma tarafından ötenazi ve başkanları ile steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x Petri kabına yerleştirin.
    2. Kafa boynun ense tarafından tutun ve uzak steril makas kullanarak deriyi kesme. Piercing tarafından hasta deşmek (yaklaşık 0,1-0,3 mm) sonra hasta kafatasının dibinde başının arkasında altında takılı ve açık belgili tanımlık ears ve sonra abov yukarıda grefti kenarına yanal arkadan boyunca kesin makas ile e burun Köprüsü (Şekil 1).
    3. 8 mL steril filtre sindirim çözeltisi ile disseke calvaria kuluçkaya (300 adet/mL collagenase tip IV ve 2.14 adet/mL dispase II α-en az gerekli Orta (α-MEM) çözünmüş) 50 mL konik tüp 37 ° c 200 sallar, titreyen bir kuluçka 10 dk içinde /Min.
    4. İlk süpernatant atın ve üç kez 8 mL sindirim çözeltisi ile sindirim yordamı yineleyin. Her sindirim adımdan sonra hücreleri içeren süpernatant toplayabilir ve 50 mL konik tüp ekleyebilir. (Yaklaşık 40 dk) sindirim yordam tamamlanıncaya kadar hücreleri ile 50 mL konik tüp bir buz su banyosu içinde saklayın.
    5. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, (ile bir vakum pompa bağlı Pasteur pipet) süpernatant Aspire edin ve α-MEM ile % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve % 1'i içeren 40 ml kemik büyüme ortamının (BGM) resuspend penisilin-streptomisin çözüm. Sonra hücre süspansiyon 10 mL 4 doku kültürü plakaları (10 cm) ekleyin.
    6. 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri izdiham (2-3 gün) kadar kültür.
    7. İzdiham, eski orta Aspire edin ve doku kültürü plakaları bir kez 1 x PBS (37 ° C) ile yıkayın. Sonra PBS Aspire edin ve 2 mL 1 x tripsin çözeltisi % 0.5 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) her 10 cm doku kültürü plaka içeren ekleyin.
    8. 4 kültür plakaları 37 ° C ve % 5 CO2 5 min için kuluçkaya ve tabakları hücreleri plastik ayrılır emin olmak için bir ters ışık mikroskobu ile kontrol edin. O zaman bir 50 mL konik tüp 10 mL taze BGM içeren tüm hücre süspansiyonlar (Toplam 8 mL) transferi. Her plaka 5 mL taze BGM ve aynı 50 mL konik tüp transfer ile yıkayın.
    9. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 16 mL taze BGM hücrelerde resuspend. BGM 9 mL içeren 16 yeni 10 cm doku kültürü tabak (yarma 1:4) hazırlayın. Hücre süspansiyon 1 mL her plaka için ekleyin.
    10. 1.1.6 adımları yineleyin. 1.1.8 için.
    11. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 10 mL taze BGM resuspend. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu hesaplayın.
      Not: Bu yordam yaklaşık 7.5 – 8,3 x 105 hücreleri/yavru oluşturur.
    12. Santrifüj kapasitesi 300 x g 4 ° C'de 5 min için de, süpernatant Aspire edin ve dondurma orta içeren % 10 dimetil sülfoksit (DMSO), % 40 α-MEM ve % 50 resuspend FBS. Hücre süspansiyon 1,5 mL şişe başına 2 x 106 hücre olmak üzere toplam 2 mL cryovials aktarın.
    13. Flaş bir sıvı azot tank uzun süreli depolama için sıvı azot şişeleri dondur. Hücreleri bir yıl içinde tam işlevselliğinden emin olmak için kullanın. Bu birincil OBs yayılması (adım 1.2), farklılaşma değerlendirmek için kullanın (ALP deneyleri: adım 1.4., 1.5.) ve biyomalzeme huzurunda Qafqaz (adım 1.6.). Bu hücreler kemik iliği türevi OC öncüleri ortak kültür (adım 2.3) olgunlaşma için kullanın.
  2. OB nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri BGM 1 ml 37 ° C ve % 5 CO2 birincil OBs. kullanımı standart doku kültürü plakaları denetimler için eklemeden önce 24 h için bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve süspansiyon kültür plakaları biomaterial örnekleri için önceden kuluçkaya Plastik hücre eki kaçının.
    2. Ön kuluçka orta Aspire edin ve sonra birincil fare OBs BGM içinde resuspend. 4.4 x 104 OBs/cm2 önceden inkübe β-TCP disk üzerine bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve kontrol grubu için bir 24-iyi doku kültürü plaka (1 mL/de) ekleyin. OBs doku kültürü tabak ya da biomaterial eklemek olacaktır.
    3. 37 ° C ve % 5 CO214 gün için kuluçkaya. Kuluçka döneminde Orta 2-3 günde değiştirin ve her şey için 1 mL taze BGM ekleyin.
    4. OB yayılması değerlendirmek için β-TCP diskleri 7 ve 14 gün süspansiyon kültür plaka üzerinde yetiştirilen hücrelerin sinyalleri çıkarılacak yeni kuyu aktarın.
    5. Eski orta Aspire edin, BGM (37 ° C) 0.5 mL ekleyin ve kültür tabaklar CO237 ° C ve %5 30 dk için kuluçkaya. 10 hücre proliferasyonu reaktif x 55 µL ekleyin (1:10 seyreltme) iyi kültür içine doğrudan. İçin boşluklar, BGM 0.5 mL ve 10 x hücre proliferasyonu reaktif 55 µL içeren üç kuyular hazırlayın. 30 dk 37 ° C ve % 5 CO2için tüm plakaları kuluçkaya.
    6. Geri çekilin ve süpernatant ile 150 µL her kuyudan 96-şey siyah bir tabak aktarmak ve floresan 560 nm, uyarma ve emisyon 590, okumak nm. Örnek değerler üzerinden boş değerler çıkarma.
  3. OB farklılaşma ve Qafqaz deneyleri
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri BGM 1 ml 37 ° C ve % 5 CO2 OBs. kullanımı standart doku kültürü plakaları denetimler için eklemeden önce 24 h için bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve süspansiyon kültür plakaları önlemek biomaterial örnek için önceden kuluçkaya Plastik hücre Eki.
    2. Ön kuluçka orta Aspire edin ve sonra birincil fare OBs BGM içinde resuspend. 8,8 x 104 OBs/cm2 önceden inkübe β-TCP disk üzerine bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve kontrol grubu için bir 24-iyi doku kültürü plaka (1 mL/de) ekleyin. OBs doku kültürü tabak ya da biomaterial örnek eklemek olacaktır.
    3. BGM BGM, 50 µg/mL askorbik asit ve 5 mM β-gliserofosfat 24 h OBs eklenmesinden sonra içeren 1 mL osteojenik Qafqaz Orta (MM) ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO214 gün için kuluçkaya. Orta 2-3 günde 1 mL taze hazırlanmış mm ile her şey için değiştirin.
  4. OB farklılaşma hücre lysates aktivitesinden alkalen fosfataz (ALP) tarafından değerlendirildi
    1. Gün 7'den sonra MM ilavesi ALP etkinliğini ölçmek için kuyuları kültür ortamından Aspire edin ve sonra 1 mL steril 1 x PBS (37 ° C) ile yıkayın. Dikkatli bir şekilde bağlı hücre doku kültürü plastik veya biomaterial kalır ve plakaları-80 ° C'de dondurmak izin vermek için PBS Aspire
    2. 24 saat sonra (veya 2 hafta maksimum), denetim doku kültürü plaka ve biomaterial süspansiyon kültür plaka (RT) OB lizis için hazırlamak için oda sıcaklığında erimek. Biomaterial örnekleri için β-TCP diskler için plaka bağlı hücreleri dışlamak için yeni bir süspansiyon kültür plaka içine aktarın. 1 x hücre lizis arabellek kuyu başına 75 µL her iki tabak için ekleyin. Bir shaker 400 sallar/dk üzerinde plakaları 5 min için salla.
    3. Lysate hücre içine 0.5 mL microcentrifuge tüp ve enkaz kaldırmak için RT, 6 min için 300 x g , santrifüj aktarın. 96-şey siyah bir tabağa örnek hücre lysate süpernatant ile 50 µL ekleyin ve sonra 50 µL 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfat (DiFMUP) fluorogenic substrat ALP arabellek iyi (pH 10) x 2 çözünmüş oluşan bir çözüm ekleyin. İki boş wells 1 x hücre lizis tampon ve 2 x ALP arabellek içeren bir 1:1 çözeltinin 100 µL ile ayarlayın.
    4. 8 kullanılan standartlar ile 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) 0,5 1 x hücre lizis tampon ve standart referans eğri oluşturmak için 2 x ALP arabellek içeren 1:1 çözüm içinde çözünmüş 200 mikron arasında değişen 100 μL/kuyu ile hazırlayın.
    5. Siyah plaka 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya ve floresan 358 nm, uyarma ve emisyon, 455 okumak nm. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.
    6. Hücre lysates ALP enzim aktivitesinden kolorimetrik bir tahlil için protein konsantrasyonu kullanarak protein toplam miktarı normalleştirmek. Sığır serum albumin (BSA) protein başvuru standartları 0.05 – 2,5 bir mesafeden hazırlamak µg/µL çözünmüş standart bir eğri oluşturmak için hücre lizis arabellek x 1.
    7. Örnek hücre lysates ve çoğaltmaları BSA proteini standartları hazırlamak. Lysate örnek hücrenin 5 µL veya 5 µL BSA protein standart bir 96-şey plaka ekleyin ve sonra ekleyin reaktif A 25 µL' ve reaktif B. Set iki boş kuyu kadar 200 µL hücre lizis arabellek x 1 5 µL ile. RT, plakalar 15dk için kuluçkaya ve 690 absorbans okuyun nm. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.
  5. OB farklılaşma hücre kültüründe ALP boyama tarafından değerlendirildi
    1. Kültürlü OBs ALP gün 7'den sonra MM ek bir denetim doku kültürü plaka ve biomaterial bir süspansiyon kültür plaka üzerinde leke.
    2. Kuyuları kültür ortamından Aspire edin ve 0.5 mL 1 x PBS (37 ° C) ile değiştirin. PBS Aspire edin ve onları RT, arabelleğe alınan % 10 formalin 1 dk. için 0.5 ml kuluçka hücreleri tamir.
    3. Arabelleğe alınan % 10 formalin tek kullanımlık damlalıklı ile Aspire edin ve yıkama arabellek (%0,05 Tween20 1 x PBS) 0.5 mL ekleyin.
    4. Bir 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat/nitro mavi tetrazolium (BCIP/NBT) substrat tablet Ultrasaf Su ve tamamen eriyene kadar girdap 10 ml geçiyoruz. Çözüm ışıktan korunan ve içinde 2 h kullanılan gerekir.
    5. Yıkama arabellek Aspire edin ve 0.5 mL BCIP/NBT substrat çözeltisi ile değiştirin ve RT plaka 10 dk. aspiratı karanlıkta boyama çözüm kuluçkaya ve yıkama arabellek 0.5 mL ile değiştirin.
    6. Lekeli β-TCP diskleri yeni bir kuyunun içine aktarmak ve ALP lekeli levha kayıt ALP boyama için geleneksel masaüstü tarayıcı tarama'yı.
  6. OB Qafqaz alizarin Red S (ARS) ile boyama tarafından değerlendirildi
    1. Birincil OBs 14 gün sonra MM ek içeren wells kültür ortamından Aspire edin ve iki kez ile 0.5 mL 1 x PBS RT. aspiratı adlı PBS durulayın ve %10 0.5 mL formalin çözüm RT 10 dakikadır arabelleğe ekleyerek hücreleri tamir.
    2. Arabelleğe alınan % 10 formalin tek kullanımlık damlalıklı ile Aspire edin ve iki kez 0.5 mL Ultrasaf Su yıkayın.
    3. Sabit OBs için 0.25 mL 40 mM ARS boyama çözeltisi (pH 4.2) Ultrasaf Su içinde çözünmüş ve RT, plaka üzerinde bir shaker 100 sallar/dk 10 min için kuluçkaya ekleyin.
    4. Tek kullanımlık damlalıklı boyama çözümle Aspire edin ve 1 mL Ultrasaf Su ile durulayın. Belirsiz kaldırmak için tekrarlamak bu adım 5-10 kat boyama.
      Not: Yıkama çözüm olmadan renk olmalıdır.
    5. Ultrasaf Su Aspire edin ve 1 mL soğuk PBS ekleyin. RT, plaka üzerinde bir shaker 100 sallar/dk 10 min için kuluçkaya.
    6. PBS Aspire edin, lekeli β-TCP diskler için yeni bir kuyu aktarmak ve tabakları kayıt Qafqaz için düz yataklı tarayıcı tarama'yı.
    7. 0.25 mL % 10 cetylpyridinium klorür çözeltisi ekleyin ve RT, plaka üzerinde bir shaker ARS boya ayıklamak için 100 sallar/dk 15 dk için kuluçkaya.
    8. Bir 1,5 mL tüp ve RT., 5 min için 17.000 x g , santrifüj supernatants transfer
    9. Özleri ile seyreltme oranı 1:10 – 1:20 in % 10 cetylpyridinium klorür çözüm ekleyin ve örnekleri (300 µL) sadece % 10 cetylpyridinium klorür içeren iki boş wells de dahil olmak üzere bir 96-şey plaka ekleyin.
    10. Standart bir eğri oluşturmak için çözüm (pH 4.2) % 10 cetylpyridinium klorür solüsyonu ile boyama 40 mM ARS sulandrarak 4'ten 400 µM arasında değişen 7 ARS kullanılan standartlar hazırlamak.
    11. Referans standart 300 µL çoğaltmaları için 96-şey plaka ekleyin.
    12. Örnekleri, boşluklar, absorbans okumak ve başvuru standartlarda 520 nm.
    13. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.

2. fare OB-OC ortak kültür olgun OCs türetmek için

  1. Hazırlık ve sterilizasyon sığır kemik dilimleri
    1. Çevreleyen doku kemik parçalarını temiz ve trabeküler kemik ve kemik iliği çıkarmak.
    2. 50 ° c 24 h için kemik kuru.
    3. Kemik daha küçük parçalara ayırır dilim ve dilimler halinde (yaklaşık 300-350 µm kalınlığında) kesin bir düşük hızda kullanarak bir elmas bıçak ile gördüm.
    4. İkinci dereceden disklere (1 cm2) 300-350 µm dilimler kesin.
    5. Kemik diskler (1 cm2) temizlemek için kilitlenebilir cam şişe ve distile su ile doldurun içine koydum. Doldurulmuş cam şişe bir ultrasonik banyo içine aktarmak ve üç kez bu adım 5 dk. tekrarlamak için solüsyon içeren temizleyicide.
    6. Distile su dökün, % 70 etanol ekleyin ve 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
    7. % 70 etanol dökün ve % 100 etanol ile değiştirin.
      Not: kemik dilimleri 4 ° C'de % 100 etanol 4 haftaya kadar saklayın.
    8. UV ışık steril koşullarda her tarafta 15 dakika kemik dilimlerle ışınlatayım. Steril kemik dilimleri RT bir steril kültür plaka kadar daha fazla kullanılmasını saklayın.
  2. İzolasyon-in kemik iliği OC kara filmin tarih öncesi
    1. 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine lik mayi (IP) iğne kullanarak saf 8-12 hafta yaşlı BALB/c fare ötenazi.
    2. Kemik iliği OC öncüleri fare uyluk ve tibiae yalıtmak.
    3. Bacaklar steril makasla en yakın noktadan kalça eklemi, vücuda, bacaklarda diz ve ayak bileği eklemleri kesmek steril neşter ve forseps ile yumuşak doku sökün ve. Epifizleri kesti. Ortaya çıkartmak ve kemik iliği hücre süspansiyon elde etmek için 1 mL şırınga bağlı 27 G iğne kullanarak bir 6 cm steril Petri çanak içine 1 mL BGM ile askıya alma.
    4. Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp ekleyin, 6 cm Petri kabına BGM ve aynı 50 mL konik tüp transfer 5 mL ile yıkayın. Vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj Resuspend OC farklılaşma Orta (DM) BGM, 1 nM 1,25-(OH)2bulunduğu hücreleri-vitamin D3 ve 1 µM prostaglandin E2 (1 mL/de).
      Not: Bir BALB/c fare için bir 24-şey kültür plaka OC öncüleri yeterli sayıda sağlar.
  3. Fare OB-OC ortak kültür biomaterial ile hazırlanması
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri veya sığır kemik dilim (1 cm2) 1 ml BGM bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka 37 ° C ve % 5 CO2 için 24 saat önceden kuluçkaya hücreleri eklemeden önce.
      Not: Sığır kemik dilimler OC farklılaşma Biyomalzeme huzurunda eğitimi için bir fizyolojik substrat kontrol grubu olur.
    2. 8,8 x 104 hücreleri/cm2 birincil OBs Biyomalzeme veya denetim kemik bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka veya 24-iyi doku kültürü plaka üzerine BGM içinde askıya ekleyin. 37 ° C ve 24 saat için % 5 CO2 kuluçkaya.
      Not: OBs plastik ya da biomaterial ya da sığır kemik ekleme.
    3. Taze izole kemik iliği OC öncüleri 24 h birincil OBs ve kültür CO2 37 ° C ve % 5, 5 gün boyunca kültürlü ekleyin. Orta ile taze hazırlanmış OC DM her gün değiştirin. Sonra OCs tartarat dayanıklı asit fosfataz (OC farklılaşma değerlendirmek için tuzak) için leke.
  4. OC farklılaşma tuzak boyama tarafından değerlendirildi
    1. Adım 2.3.3, elde edilen olgun multinucleated OCs karakterize etmek için denetim doku kültürü plaka ve biomaterial süspansiyon kültür plaka kültür ortamından Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (37 ° C) ekleyin. PBS Aspire edin ve onları RT, arabelleğe alınan % 10 formalin üçün 10 dk 1 ml kuluçka hücreleri tamir.
    2. Tek kullanımlık damlalıklı arabelleğe alınan % 10 formalin çözümle Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS RT. tekrarı bu adımı üç kez ekleyin, sonra PBS Aspire edin, tuzak arabelleği (pH 5) ile 1 mL yerine ve plakaları için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. TUZAK arabelleği Aspire edin ve 1 mL 1:1 aseton ve % 100 etanol ekleyin. 30 hızlı bir şekilde tek kullanımlık damlalıklı çözümle aspiratı aseton-etanol s. ve tamamen RT., tabak Makinası RT plaka kuluçkaya
    4. Çözüm boyama tuzak için bir 10 mg/mL 0.6 mg/mL hızlı kırmızı mor tuzak arabellekte tuz ve hızlı kırmızı mor tuz için 10 mL 0.1 mL naftol-AS-MX fosfat stok çözeltisi ekleyin N, N-dimethylformamide, erime naftol-AS-MX fosfat hisse senedi çözümde hazırlamak. TUZAK bir arabellek.
    5. Çözüm boyama tuzak 1 mL ekleyin ve 10 dakika, 37 ° C'de plaka kuluçkaya sonra çözüm boyama tuzak Aspire edin ve 1 mL reaksiyonu durdurmak için ultrasaf su ekleyin.
    6. Aktarım β-TCP diskler ve sığır kemik dilimleri yeni bir kuyuya boyama sonra hafif bir mikroskop kullanarak kırmızı lekeli OCs gözlemlemek (büyütme: 10 X) ve üç veya daha fazla hücre çekirdeği ile tuzak + olgun OCs numaralandırılamıyor.

3. kritik ölçekli fare grefti kusur modeli

  1. 0.1 mg/kg buprenorfin subkutan enjekte (SC) 8 - hafta eski BALB/c fareler analjezi için içine.
  2. 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile fareler anestezi, jel veya merhem onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözler ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  3. Kulaklar arasında baş üstünde kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile yüzey temiz.
  4. Sagittal bir ensizyon kafatası hasta maruz ve neşterle kazıma zarından bağ dokusu sağ parietal kemik kaldırmak için steril neşter kulaklarıyla arasında üst olun.
  5. Sağ parietal kemik çentik ve ectocortex ve bazı endocortex ile kesmek için normal serum fizyolojik solüsyonu ile sabit sulama altında sağ parietal kemik steril bir diş trephine çapı 4 mm (2000 rpm) kullanarak kritik ölçekli bir üründe oluşturun.
  6. Dura mater zarar görmesini önlemek için küçük bir periosteal Asansör kalan endocortex kırmak, dikkatle grefti kemik kaldırın ve forseps ile kaldırmak için kullanın. Elde edilen kusur daire ve yaklaşık 3,5 mm çapında olmalıdır.
  7. Grefti kusur ile önceden sırılsıklam doldurun (RT, steril 1 x PBS) β-TCP/C köpük forseps kullanarak.
  8. Boş bir defekt yaş eşlemeli, sahte negatif denetimleriyle uygun sayıda hazırlayın.
  9. Biomaterial yerde tutmak için iki zıt noktalarında kusur kenarında doku yapıştırıcı 0.5 µL koymak.
  10. Cilt absorbe olmayan dikiş ile kapatın.
  11. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  12. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  13. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte SC 72 h. dönüş için günde iki kez ameliyat sonrası analjezik tedavi için fareler onların kafes için tamamen iyileşti.
  14. Biomaterial etkinliğini belirlemek için 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözüm ile fareler ı.p. ötenazi.
  15. 8-12 hafta sonrası implantasyonu euthanized fare ile keskin makas başını kesmek.
  16. Düzeltme üç fare başından %4,5 30 mL formalin çözüm 1-2 hafta sabitleştirici tam penetrasyon doku içine garanti arabelleğe alınmış.
  17. Kafaları % 70 etanol 4 ° C'de uzun süreli depolama için içine bir yıl için transfer.
  18. Kullanım mikro tomografi (microCT) veya kemik rejenerasyon değerlendirmek için standart undecalcified histolojik teknikler hesaplanır. Yüksek çözünürlükte öldükten sonra örnekleri üzerinde tarama microCT kullanmak mümkündür (90 kV, 4 dk) 2D ve 3D sagittal ve frontal uçaklar.
  19. Undecalcified Histoloji için etanol sınıflarda artan kafaları kurutmak ve Glikol Metil metakrilat embed.
  20. Glikol blok Metil metakrilat gömülü bir elmas testere ile kesme ve bölümlerini yaklaşık 80-100 µm kalınlığa eziyet.
  21. Yeni kemik oluşumu14tanımlamak için Levai Laczko kemik bölümleri lekeli değerlendirin.

4. Vitro bağışıklık yanıtı

  1. Saf 8 - hafta eski BALB/c fare ı.p. 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözümle ötenazi.
  2. Onun sağ tarafında fareyi getirin, sol tarafında kürk tıraş ve sol tarafındaki % 70 etanol ile karın üzerinde deri temiz.
  3. Fareyi üzerinde sol tarafında özafagusu kaburga steril makas kullanırken mide üzerinde aşağıdaki deri bir 10 mm uzunluğunda ve 1 mm derin kesik olun.
  4. Cilt açın ve karın zarını sunarsınız. 10 mm uzun yapmak ve daha az 1 mm derin Karın zarını kullanarak kesi steril koşullarda makas.
  5. Mide proksimale dalak ortaya çıkarmak için itin.
  6. Dalak yavaşça steril forseps ile tutun ve doku ve altında bağlı gemiler keserek çıkarın.
  7. Sağlam dalak soğuk 1 steril PBS x 10 mL içeren bir 50 mL tüp içine koyun.
  8. Bir tek hücre süspansiyon 2 steril forseps veya 2 steril cam slayt kullanarak dalak kıyma tarafından hazırlayın.
  9. Enkaz 1 mL şırınga pistonu kullanarak soğuk 1 x PBS ile steril 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçirerek kaldırın.
  10. Tek hücre süspansiyon vasıl 300 x g 50 mL konik tüp içinde 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi, Aspire edin ve süpernatant atın. Sonra hücre Pelet kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek 5 mL resuspend.
  11. Hücre süspansiyon RT, 14 dk için kuluçkaya ve reaksiyon Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 45 mL ekleyerek durdurmak.
  12. Hücreleri hücre lizis vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika sonra santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  13. Resuspend splenocytes % 10 içeren RPMI orta ısı-FBS, % 1 penisilin-streptomisin çözüm, %0.1 gentamisin, % 0,2 β-mercaptoethanol ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler inaktive olur.
  14. β-TCP/C köpük hücre tohum önce RPMI orta 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 için içeren bir 96-şey steril kültür plaka önceden kuluçkaya.
  15. Splenocytes titre sayılarında e.gekleyin., 1,25 x 105, 2.5 x 105 ve 5 x 105kuyu RPMI orta ve katkı maddeleri, ya da önceden inkübe β-TCP/C köpük olmadan içeren bir 96-iyi doku kültürü plaka için /well.
  16. 10 eklemek bir (Con A) 100 µL/iyi uygun wells için toplam ortamda çözünmüş ve 37 ° C ve % 5 CO2 72 h için kuluçkaya µg/mL concanavalin.
  17. Hücre çoğalması ile bir bromodeoxyuridine (BrdU) tahlil ölçmek. Hücre kültürü 48 h 10 µL/iyi BrdU etiketleme çözüm ekleyin ve sonra ek bir 24 h plaka kuluçkaya.
  18. 72 h, süpernatant toplamak ve -20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
  19. Her şey için 200 µL/iyi fiksasyon çözüm ekleyin ve sonra 30 dk RT. aspiratı az için fiksasyon çözüm kuluçkaya. 100 µL/iyi anti-BrdU antikor çalışma çözüm ekleyin ve 90 dk için kuluçkaya.
  20. Antikor çözüm Aspire edin, wells üç kez ile 200 – 300 µL/iyi, Çözüm yıkama durulama ve yıkama çözüm kaldırın.
  21. 100 µL substrat çözeltisi ekleyin ve 3 – 10 dk RT, kuluçkaya sonra 450 absorbans ölçmek nm.
  22. İnterlökin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interlökin-4 (IL-4) ve interferon-γ (IFN-γ) içinde bir standart ELISA kullanarak toplanan supernatants ölçmek.

5. yüksek işlem hacmi mayi modeli

  1. Kadın 6-8 haftalık eski BALB/c fare 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile anestezi ve onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözlere bir jel veya merhem ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  2. Karın kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile temiz.
  3. Bir 8 mm uzun ensizyon linea boyunca deri yoluyla yapmak alba. Bir neşter kullanarak periton içine küçük bir kesi yapmak.
  4. Yer steril PBS β-TCP/C köpük Greftler (2 x 2 x 2 mm3) periton boşluğuna batırılmış veya olmadan malzeme yaş eşlemeli sham kontrol fareler için eklendi.
  5. Karın zarını dikiş ve sırasıyla absorbe ve absorbe olmayan sütür ile cilt.
  6. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  7. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  8. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. Tam olarak kurtarılan fareler için onların kafes dönmek.
    Not: Bu yordam en az ağrı neden olmaktadır. Ameliyat sonrası analjezik tedavi genellikle gerekli değildir. Eğer işletilen hayvan göstermek işaret-in acı, 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte s.c. veya başka bir uygun analjezik ilaç ağrı için.
  9. Fareler 7 gün sonrası implantasyonu, 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine ı.p. bir çözümle ötenazi
  10. 7 gün sonrası implantasyonu, lavaj 1 mL kullanarak periton boşluğuna fare kafa tutup sol alt karın kadranda iğne ekleme ile soğuk PBS 3 mL olmak üzere toplam 25G iğne şırınga ve proksimale nişan al.
    Not: Periton sıvısı RBCs özgür olmalıdır.
  11. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de periton lavaj sıvı santrifüj kapasitesi ve IL-1β, IL-2 ve Il-4 sitokinler ELISA ölçümleri için-20 ° C'de depolamak için periton sıvısı toplamak.
  12. Süpernatant Aspire edin, hücre pelet 1 mL PBS resuspend ve trypan mavi bir hemasitometre kullanarak periton hücreleri saymak.
  13. Cytocentrifuge üstünde-e doğru cam slaytlar, 5 x 105 hücreleri, hücre süspansiyon izin kuru ve farklı hücre sayısı için leke slaytlar.
  14. Hafif bir mikroskop kullanarak, toplam 300 hücreleri en az say ve makrofajlar, eozinofil, nötrofil ve lenfositler arasında ayırt etmek.

6. Subkronik subkutan modeli

  1. Kadın 6 – 8 hafta eski BALB/c fare 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile anestezi, jel veya merhem onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözler ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  2. Sırtında fareyi getirin, karın kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile tıraş yüzeyi temizleyin.
  3. Bir 8 mm uzun ensizyon yapmak linea boyunca deri yoluyla alba bir neşter ve sonra implant PBS kullanarak karın biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) deri altında batırılmış veya hiçbir malzeme yaş eşlemeli sham kontrol fareler için ekleyin.
  4. Cilt ile absorbe olmayan dikiş dikiş.
  5. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  6. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  7. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. Tam olarak kurtarılan fareler için onların kafes dönmek.
    Not: Bu yordam en az ağrı neden olmaktadır. Ameliyat sonrası analjezik tedavi genellikle gerekli değildir. Eğer işletilen hayvan göstermek işaret-in acı, 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte s.c. veya başka bir uygun ağrı kesici.
  8. İmplantasyon sitesini incelemek hazır olduğunuzda 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözüm ile fareler ı.p. ötenazi.
  9. Sekiz hafta sonrası implantasyonu, doku (1 cm2) çevreleyen ile implantasyon sitesi tüketim.
  10. Doku arabelleğe alınan % 4.5 formalin çözümde gecede düzeltmek, parafin içinde katıştırmak ve 4 µm bölümlere kesti.
  11. 4 µm parafin gömülü doku bölümlerini hematoksilen eozin (H & E) ile inflamasyon veya Masson'ın kollajen birikimi ve fibrozis trichrome için leke.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

β-TCP için kemik tamir için bir biomaterial olarak etkinliğini değerlendirmek için vitro ve in vivo Yöntemler eleme kullanılır. İlk olarak, temel orta yalnız denetimleri ile karşılaştırıldığında β-TCP diskleri OB yanıtlarını şiddetindeydi. Şekil 2 yanıt β-TCP disklere OB canlılığı kültürünün 7 ve 14 gün gösterir. Hücre canlılığı kültür Wells metabolik olarak aktif hücrelerden ölçülen OBs için doku kültürü plastik ortamda yanı sıra bu biomate...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İşte, biyouyumluluk temsilcisi Biyomalzeme kemik rejenerasyon ve onarım için geliştirilmiş için preklinik değerlendirilmesi için çok disiplinli bir yaklaşım göstermektedir. OBs, OCs, yanıt test ettik ve bir kritik kemik defekti içinde vivo şifa yanıtta model fare gibi içinde in vitro ve in vivo bağışıklık yanıtı. Nasıl deneyleri çalışma ve veri ve biyomalzeme muayene elde edilen sonuçları özetlemek göstermek amaçlanmıştır. Biz bizim strateji kemik biomaterial biyouyumluluk değerli bir profil ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma projesi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) fon Hibe Sözleşmesi No 263363 altında aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biyomalzemeler
β-trikalsiyum fosfat diskleri (β-TCP, 14 mm)Diskler, 1150 °C sıcaklıkta bir kül fırınında sinterlendi. Üretimin ayrıntılı bir açıklaması Zimmer ve ark. (doi: 10.1002/jbm.a.34639) içinde bulunabilir. Numuneler, hücre kültürlerinde kullanılmadan önce UV ışınlandı (her iki taraf için 15 dakika).
Orthovita Vitoss köpüğü (β-TCP/C köpüğü)Orthovita2102-1405
Fare osteoblast kültürü
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP tahlil tamponu (2x) pH 10.4200 mM glisin, 2 mM magnezyum klorür, 2 mM çinko klorürü ultra saf suda çözün ve pH 10'a ayarlayın.
Kemik büyüme ortamı (BGM)&alfa;-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin / streptomisin
Hücre lizis tamponu: CyQuant hücre lizis tamponu 20x konsantreThermo ScientificC7027Konsantre hücre lizis tampon stoğunu ultra saf suda 20 kat seyreltin.
Hücre canlılığı reaktifi: Presto Blue hücre canlılığı reaktifiInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Clostridium histolyticum'dan kollajenaz tip IVSigma-AldrichC5138
DC protein tahlil kiti IIBio Rad5000112DC protein tahlil kiti, referans standardı için reaktif A, reaktif B, reaktif S ve BSA içerir. Reaktif A' için 20 &mikro ekleyin; L reaktifi S ila 1000 & mikro; L reaktifi A. 
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418Kullanmadan önce steril filtre DMSO.
Dispas II (nötr proteaz, derece II)Alkalinfosfataz
EnzCheck Fosfataz Test Kiti Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Fosfataz Test Kiti, 6,8-difloro-4-metilumbelliferil fosfat (DiFMUP), N, N-dimetilformamid ve 6,8-difloro-7-hidroksi-4-metilkumarin (DiFMU) içerir.
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalin çözeltisi nötr tamponlu% 10Sigma-AldrichHT501128
GlisinSigma-AldrichG8898
Hekzadesilpyrdinium (setilpiridinyum) klorür monohidratSigma-AldrichC9002
L-Askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidratSigma-AldrichA8960
Magnezyum klorür hekzahidratSigma-AldrichM2670
MEM alfa ortamı (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Osteojenik mineralizasyon ortamı (MM)&alfa;-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin-streptomisin + 50 &mikro; g/mL askorbik asit + 5 mM β-gliserofosfat
Penisilin-streptomisin   Sigma-AldrichP4333
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP / NBTSigma-AldrichB5655
Tripsin-EDTA (% 0.5), fenol kırmızısı yok (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Konsantre stok çözeltisini 1x PBS'de 10 kat seyreltin.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Ultra saf su: Hücre kültürü suyu pirojen içermezVWRL0970-500
Yıkama tamponu1x PBS'ye %0,05 Tween20 ekleyin.
Çinko klorürSigma-Aldrich1.08816
β-Gliserofosfat disodyum tuzu hidratSigma-AldrichG5422
24 oyuklu süspansiyon kültür plakasıGreiner bio-one662102
24 oyuklu doku kültürü plakasıGreiner bio-one662160
50 mL konik tüpGreiner bio-one227261
96 oyuklu siyah plakaGreiner bio-one655076
96 oyuklu şeffaf plakaGreiner bio-one655001
Santrifüj: VWR Mega Star 600RVWR
CO2 İnkübatör: HeraCell 240Thermo Scientific Cryovial
2 mLGreiner bio-one122263
Tek kullanımlık filtre ünitesi FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Yaşam Bilimleri Whatman10462200Enzim çözeltisinin steril filtrasyonu için.
Düz yataklı tarayıcı: Epson Perfection 1200 FotoğrafEpson
Infinite M200 Pro mikroplaka okuyucuTecan
Mikrosantrifüj tüpü: Eppendorf tüpü kasa kilidi 0,5 mLVWR20901-505
Mikrosantrifüj tüpü: Eppendorf tüpü güvenli kilit 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (yörüngesel ve yatay) Edmund Buehler 
Çalkalama inkübatörü GFL3032GFL 3032
Tek kullanımlık pipet: serum pipetiGreiner bio-one612301
Steril aletler (makas, cımbız, kavisli forseps)
Doku kültürü plakası (10 cm)Greiner bio-one664960
Fare osteoblast-osteoklast ko-kültürü
1&alfa;,25- Dihidroksivitamin D3Sigma-Aldrich179361000x konsantre stok (10 & mikro; Etanolde M %100)
AsetonVWR Kimyasalları22065.327
Kemik büyüme ortamı (BGM)&alfa;-MEM + %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS + %1 penisilin-streptomisin
Damıtılmış suCarl Roth3478.4
Etanol (%100 hacim/hacim)VWR Kimyasalları20821.365
Etanol (%70 hacim/hacim)VWR Kimyasalları93003.1006
Hızlı kırmızı menekşe LB tuzuSigma-AldrichF3381
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalin çözeltisi nötr tamponlu% 10Sigma-AldrichHT501128
MEM alfa Orta (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-DimetilformamidSigma-AldrichD4551
Naftol AS-MX fosfatSigma-AldrichN4875
Osteoklast farklılaşma ortamı (DM)&alfa;-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin-streptomisin + 1 nM 1,25- (OH) 2-vitamin D3 + 1 &mikro; M prostaglandin E2 
Penisilin-streptomisin Sigma-AldrichP4333
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandin E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x konsantre stok (etanolde 1 mM %100)
Sodyum asetat trihidratSigma-AldrichS7670
Sodyum tartrat dibazik dihidratSigma-AldrichS8640
Steril aletler (makas, forseps, neşter)
TUZAK tampon pH 5.040 mM sodyum asetat, 10 mM sodyum tartaratı ultra saf suda çözün ve pH 5'e ayarlayın.
Ultra saf su: Hücre kültürü suyu pirojen içermezVWRL0970-500
24 oyuklu süspansiyon kültür plakasıGreiner bio-one662102
24 oyuklu doku kültürü plakasıGreiner bio-one662160
50 mL konik tüpGreiner bio-one227261
Santrifüj: VWR Mega Star 600RVWR
CO2 İnkübatör: HeraCell 240Thermo Scientific
Diamond gofret bıçağı (10,2 cm x 0,3 cm)Buehler
Isomet düşük hızlı testereBuehler
Petri kabı (6 cm)Greiner bio-one628,161
Vidalı kapaklı cam şişe 20 mLCarl RothEXY4.1
Tek kullanımlık steril şırınga 1 mLHenry Schein Hayvan Sağlığı9003016
Tek kullanımlık pipet: serum pipetiGreiner bio-one612301
Steril iğne: Hipodermik iğne RW 27 G x 3/4''Henry Schein Hayvan Sağlığı9003340
Fare calvarial defekt modeli
Analjezi: Buprenorfin (Bupaq)Richter Pharma AG
Anestezi: Ketamin (Ketamidor), Ksilazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Soğuk sterilant: SafeSept MaxHenry Schein Hayvan Sağlığı9882765
Etanol (%70 hacim/hacim)VWR Kimyasalları93003.1006
Göz merhemi: VitA POS 5 gUrsapharm
Normal tuzlu su çözeltisi (%0.9 sodyum klorür çözeltisi)Fresenius Kabi
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidon iyot çözeltisi: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix %4,5 tamponlu formalinCarl Roth2213.6
Doku yapıştırıcısı: Histoakril 5 x 0,5 mL B. Braun Cerrahi1050060
Kişisel koruyucu ekipman: cerrahi eldiven, bone ve maske, önlükHenry Schein Hayvan Sağlığı1045073, 1026614, 9009062, 370406
Steril aletler (neşter, makas, forseps, iğne tutucu)
Steril iğneler: Hipodermik iğneler RW 27 G x 3/4'' ve 30 G x 1/2'' Henry Schein Hayvan Sağlığı9003340, 9003630
Tek kullanımlık steril şırınga 1 mLHenry Schein Hayvan Sağlığı9003016
Isıtma plakası: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Steril gazlı bez çubuklarıHenry Schein Hayvan Sağlığı220192
Steril tek kullanımlık neşter (Figur 20)Henry Schein Hayvan Sağlığı9008957
Cerrahi/diş matkabı: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
El aleti tipi S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trephine, çap 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Sulama boru seti 2,2 mW & H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Periosteal elevatör 2 mm / 3 mmHenry Schein Hayvan Sağlığı472683
Emilemeyen sütür: Polyester yeşili, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Hayvan Sağlığı300715
in vitro< / em> bağışıklık tepkileri< / güçlü >
ötenazi için anestezi: Ketamin (Ketamidor), Ksilazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Hücre Proliferasyonu ELISA, BrdU (kolorimetrik) Test KitiSigma-Aldrich11647229001Kit, BrdU etiketleme solüsyonu, fiksasyon solüsyonu (FixDenat), Anti-BrdU antikor solüsyonu, yıkama tamponu ve substrat solüsyonu içerir.
Concanavalin A (ConA)MP Biyomedikal150710
Kültür ortamı splenositlerRPMI ortamı +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi +% 0.1 gentamisin +% 0.2 & szlig;-merkaptoetanol +% 1 esansiyel olmayan amino asitler
Etanol (% 70 hacim / hacim)VWR Kimyasalları93003.1006
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific & nbsp;
GentamisinGibco, Thermo Fisher Scientific 
Fare IL-1 ve beta; ELISA Hazır-SET-Başla!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Fare IL-2 ELISA MAX StandardıBioLegend431001
Fare IL-4 ELISA MAX StandardıBioLegend431101
Fare INF-&gama; ELISA MAX StandardBioLegend430801
Esansiyel olmayan amino asit çözeltisiGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penisilin-streptomisin Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu: BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 orta, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MerkaptoetanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
50 mL konik tüpGreiner bio-one227261
96 oyuklu doku kültürü plakasıGreiner bio-one655180
Santrifüj: VWR Mega Star 600RVWR
Hücre süzgeci 40 & mikro; mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro mikroplaka okuyucuTecan
Tek kullanımlık steril şırınga 1 mLHenry Schein Hayvan Sağlığı9003016
Steril cerrahi aletler (forseps, cam slaytlar)
< güçlü > Yüksek verimli intraperitoneal model< / güçlü>
Anestezi: Ketamin (Ketamidor), Ksilazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Soğuk sterilan: SafeSept MaxHenry Schein Hayvan Sağlığı9882765
Etanol (%70 hacim/hacim)VWR Kimyasalları93003.1006
Göz merhemi: VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1 & beta; ELISA Hazır-SET-Başla!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Fare IL-2 ELISA MAX StandardıBioLegend431001
Fare IL-4 ELISA MAX StandardıBioLegend431101
Fosfat tamponlu salin 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidone iyot çözeltisi: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Boyama KitiThermo Scientific9990700Diferansiyel hücre sayımı için.
Isıtma plakası: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemositometre: Neubauer odasıCarl RothPC72.1
Emilemeyen sütür: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Emilebilir sütür: PolisorbCovidienSL-5628
Thermo Scientificiçin Shandon santrifüjü
Tek kullanımlık steril şırınga 1 mLHenry Schein Hayvan Sağlığı9003016
Steril gazlı bez çubuklarıHenry Schein Hayvan Sağlığı220192
Steril iğneler: Hipodermik iğneler RW 27 G x 3/4 '' ve 25 GHenry Schein Hayvan Sağlığı9003340, 420939
Steril cerrahi aletler (neşter, makas, forseps, iğne tutucu)
Tripan mavisi çözeltisi% 0.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Subkronik deri altı modeli
Anestezi: Ketamin (Ketamidor), Ksilazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Soğuk sterilan: SafeSept MaxHenry Schein Hayvan Sağlığı9882765
Etanol (%70 hacim/hacim)VWR Kimyasallar93003.1006
Göz merhemi: VitA POS 5 gUrsapharm
Fosfat tamponlu salin 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidon iyot çözeltisi: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix %4.5 tamponlu formalinCarl Roth2213.6
Isıtma plakası: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Emilmeyen sütür: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Kişisel koruyucu ekipman: cerrahi eldiven, bone ve maske, önlükHenry Schein Hayvan Sağlığı1045073, 1026614, 9009062, 370406
Tek kullanımlık steril şırınga 1 mLHenry Schein Hayvan Sağlığı9003016
Steril gazlı bez çubuklarıHenry Schein Hayvan Sağlığı220192
Steril aletler (neşter, makas, forseps, iğne tutucu)
Steril iğne: Hipodermik iğneler RW 27 G x 3/4 '' Henry Schein Hayvan Sağlığı9003340, 420939
aktivitesi için Roche 4942078001 10010023100100231001002310500064157500371114005015140122100100233135001010010023Sitopsin 10010023

Kaynaklar

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

BiyomalzemelerKemik RejenerasyonuOsteoblast Canl lOsteoklast DiferansiyasyonuAlizarin Red S BoyamaKritik Boyutlu Kalvaryal DefektBeta Trikalsiyum Fosfatn Vitro Analizlern Vivo Fare Modellerimm nojenite TestleriAlerjenite De erlendirmesi
Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.