Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

29 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Özet

Dinamik değişiklikleri protein çeviri çalışmaları özel yöntemler gerektirir. Burada biz yeni sentezlenmiş protein iskemi ve polysome profil oluşturma ile birleştiğinde izole periosteum fare kalp kullanarak reperfüzyon karşısında değişiklikler incelenmiştir. Daha fazla protein çeviri dinamik değişiklikleri anlamak için biz sitozolik ribozomlara (polyribosomes veya polizomlar) ile doluydu ve aynı zamanda mitokondrial polizomlar kurtarıldı ve mRNA ve protein dağıtım karşılaştırıldığında mRNA'ların karakterize yüksek verimli kesirler (çok sayıda ribozom mRNA için bağlı), düşük-verimlilik (daha az ribozom bağlı) mitokondriyal polizomlar ve tercüme kesirler de dahil. miRNAs Ayrıca, böylece çeviri verimliliğini azaltmak tercüme ediliyor mRNA ile ilişkilendirebilirsiniz, arasında kesirler miRNAs dağılımı incelenmiştir. MRNA'ların, miRNAs ve proteinler dağıtım 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve reperfüzyon 30 dk sonra sonunda periosteum bazal koşullar altında incelenmiştir. Burada bu çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan yöntemleri mevcut — özellikle protein çekme--dan sükroz degrade, bu duruma getirilmesi için yaklaşım önce tarif edilmiştir değil — ve temsilcisi bazı sonuçlar sağlar.

Giriş

Kalp hasar iskemi (ı) ve reperfüzyon (R) dinamik bir şekilde yanıt verir. Ancak, tepki sırasında protein sentezi akut değişiklikler içine küçük fikir yoktur. Bu sorunu çözmek için biz yansıtmaktadır ribozomlar ve polizomlar, sitozol translasyonel düzenleyici faktörler yeniden dağıtılması protein bolca değişiklikleri tanımlamak için1 profil oluşturma polysome köklü yöntemi kullandı ve Yeni sentezlenmiş protein (NSP) artırın. Ben ortamda / R, yeni protein sentezi artış oluşur bir süre içinde yeni mRNA'ların2; transkripsiyon ile tutarsız Ayrıca, uyumsuzluk mRNA ifade düzeyleri ile protein bereket bildirilen3olmuştur. Bu nedenlerden dolayı biz protein çeviri tarafından yansıtıldığı gibi dinamik Proteom değişiklikleri analiz etmek seçti. Bunu yapmak için mRNA polysome kesirler ölçmek ve polysome kesirler protein bileşiminde analiz. Çünkü mikroRNA (miRs) mRNA'ların çeviri için kullanılabilirliğini düzenleyen ve protein çeviri4,5verimliliği ile engelleyebilir, son olarak, biz miRs polysome kesirler dağıtımını odaklanan muayene Ben Yanıt / R.

Sürekli perfüzyon, sonra 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve iskemi reperfüzyon 30 min tarafından takip 30 dk sonra bazal koşullar altında hasat doku ve izole fare Langendorff perfüzyon model kullanmayı seçtiniz. Daha sonra kalp doku çözündürüldükten ve polizomlar sükroz degrade üzerinde ayrılmış proteomik analizi ve seçmeli olarak algılanması mRNA'ların ve miRNAs PCR ve Mikroarray, sırasıyla izledi. Bu yöntemlerin bileşimini eşzamanlı olarak algılanması mRNA, miRNA ve NSP'ler yanı sıra, düzenleyici proteinler, miRNA ve mRNA dağıtılması arasında nontranslating kesirler Etkinleştirme dinamik Proteom anlamak için güçlü bir yaklaşım temsil eder, düşük verimli polizomlar ve yüksek verimli polizomlar (bkz. Şekil 1). Dinamik yönetmelik bu sürecin içine anlayışlar daha fazla çözümleme eIF2α veya mTOR gibi anahtar düzenleyici faktörler fosforilasyon tarafından uzatılacak. Şimdi tek tek adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından onaylanmış.

1. Langendorff perfüzyon fare kalp

  1. Langendorff perfüzyon fare kalp iskemi reperfüzyon ile
    1. Mayi Fentobarbital sodyum yönetmek 70 mg/kg yetişkin fare (8-hafta-yaşlı, Erkek, C57BL6/j). Derin anestezi çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliğinden onaylayın.
    2. Anticoagulate mayi heparin 500 ile U/kg.
    3. Göğüs sternal kesi ile açın. Diyafram açın ve anterior aksiler eksen için nodern sınırı boyunca kesilmiş. Sonra anterior aksiler eksen tamamen göğüs kafesi açmak için forelimb kadar kesti. Sonra kalbin görüntülenmesi, artan aort forseps ile kelepçe ve hızla kalp tüketim. Kan kaybı nedeniyle ölümdür. Kalp soğuk Krebs yerleştirin (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/M, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, glikoz 2 g/M ve CaCl2 0.373 g/L).
    4. Bir künt uçlu iğne ile aort cannulate ve kalp retrogradely Krebs çözüm sürekli baskı modunda ile sıvı.
    5. 15 dk sonra bir istikrar süre 30 dk 30 dakika reperfüzyon takip için küresel bir akış olmayan iskemi kalp tabi.
    6. Kalpler 15 dk temel perfüzyon sonra sonra 30 dk iskemi veya 30 dk reperfüzyon sonra hasat. Kulakçık trim ve ek-doku sıvı azot kıpırdama.
    7. -80 ° C'de kullanmak kadar saklamak

2. doku homojenizasyon, Solubilization ve sukroz yoğunluk Gradient sedimantasyon

  1. Degrade hazırlık
    1. 100 mL sukroz, 4 mL NaCl 2, 5 M karıştırma 2 çözümleri (% 15 ve % 50) hazırlamak;
      0.8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g veya sukroz 50 g (% 15 ve % 50, anılan sıraya göre); Ultrasaf Su 100 mL ulaşmak için; ve Ksilen cyanol % 15 çözüm renk (0,02 mg/mL)
    2. Her çözüm (0,22 µm filtreleri) filtre
    3. Degrade kullanılmak üzere gün 40 mL her sükroz çözeltisi hazırlamak ve sikloheksimit son 100 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için her çözüm
      1. % 15 ve % 50 sükroz çözüm arasında bir karışım hazırlamak için bir degrade makinesi kullanın
      2. % 15 sükroz degrade sol bölmesinin 5 mL ile doldurmak
      3. Sağ bölmenin % 50 sükroz gradyan ile doldurmak
      4. Musluğu açın ve iki küçük bölmeler manyetik karıştırıcı ile karıştırın pompa geçiş
      5. Kullanım bir tüp karışık sükroz çözüm ince duvarlı bir ultra-Santrifüjü tüp akışı için izin vermek için ikinci dokunun bağlı. Son hacim yaklaşık 10 mL olacak.
    4. Degradeler 4 ° C'de tutmak (gerekirse bir gecede, ama uzun olmayan)
  2. Homojenizasyon kalp doku
    1. Taze veya dondurulmuş kalp ile filtre uygulanmış lizis arabelleği (sukroz degrade ayırma için değiştirilmiş) bir polytron homojenize 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, %0,4 içeren NP-40. Sikloheksimit 100 µg/polysome yapısı, 0.1 U RNase inhibitörü ve proteaz inhibitörü kokteyl (50 mL için 1 tablet) korumak için mL içerir.
    2. Lysate kuluçkaya üzerinde buz 15dk.
    3. 18.000 x g 4 ° C'de çözünmez malzeme çıkarmak ve süpernatant toplamak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.
    4. (Bkz: Şekil 2) protein tayini, RNA izolasyon ve RNA bütünlük analizi için 50 µL saklıdır.
    5. Süpernatant (500-100 µL) degradeler üzerine katman ve lizis arabellek tüplerini denge.
  3. Sedimantasyon ve kesirler toplanması
    1. Ultrasantrifüj sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 37.000 devirde 120 min için gerçekleştirin. Üreticiye göre bu 228,000 x g maksimal RADIUS de karşılık gelir.
    2. Her degrade 254 absorbans sürekli izlenmesi ile microcentrifuge tüpler 17 kesir (yaklaşık 600 µL Kesir) olarak toplamak nm (OD254).
    3. Kesir Toplayıcı aşağıdaki gibi programı:
      1. Toplama (tüp geçişin daha önce bulunan sıvı karşılık gelen) ilk 3 dk atmak
      2. 4-19 dk 17 kesirler 1 mL/dk hızında kesirler toplamak.
    4. En kısa zamanda her toplanır kesirler buza koyun. Eğer onlar hemen işlenmeyen örnekleri-80 ° C'de dondurmak. Bu toplanır gibi tipik bir UV densitometric izleme geçişin Şekil 1' de gösterilmiştir.

3. yalıtım ve mRNA'ların Polysome ve Nontranslating kesirler Analizi

  1. MRNA çıkarımı
    1. Toplandıktan sonra flaş donmuş olsaydı on Ice, kesirler tezcan
    2. Her kesir 200 µL için taze bir tüp transferi
      Not: Bu adımda iki veya daha fazla ardışık kesirler birlikte havuza alınmış. Dikkatli bir şekilde polysome ve polysome kesirler karışmak yok böylece OD254 grafik analiz sonra yapılmalıdır.
    3. 10 ekleyin luciferase RNA normalleştirme amaç için her örnek için iç kontrol olarak ng.
      Not: Luciferase astar bir iç kontrol sonuçları normalleştirmek için kullanılmalıdır.
    4. RNA ayıklama reaktif (fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic çözüm; bkz: Malzemeler tablo) 700 µL her tüp için ekleyin. Mix iyi ve RT (Oda sıcaklığında), 5 min için tüpler kuluçkaya.
    5. 140 µL kloroform ve girdap 15 s. Incubate 2-3 dk RT. az için add ögesi
    6. Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
    7. Dikkatle üst sulu faz için yeni bir tüp aktarın.
    8. Kesirler RNA içeriği yüksek olmadığından, glikojen 10 µg her tüp için taşıyıcı olarak ekleyin.
    9. 350 µL isopropanol her tüp için ekleyin. Mix iyi ve verimi artırmak 1 h için-20 ° C'de kuluçkaya.
    10. Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika
    11. Süpernatant atmak ve RNA Pelet yıkamak için %75 700 µL etanol ekleyin.
    12. Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için
    13. Etanol kaldırmak ve 10-15 dk için kuru Pelet hava girsin.
      Not: aşırı RNA Pelet kurutma suda tam onun solubilization engeller.
    14. RNA Pelet RNase free ultrasaf H2o 50 μL içinde resuspend
    15. Örnekleri 55 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
    16. Her örneğinin 2 μL ayıklanan RNA miktarı ve kalitesini ölçmek ve kalan-80 ° C'de depolamak için kullanın.
  2. Ters transkripsiyon ve qPCR
    1. Ters transkripsiyon cDNA sentezi 4 μL kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 20 μL tepki için kit. Supermix örnek sayısına göre hazırlayın. Her tüp için gerekli ses aktarım ve giriş RNA 5 μL her tüp için ekleyin. Bu birimin Taq polimeraz çalışma koşulları aralığı için alakalı olacak şekilde düzeltilebilir.
    2. Üretici tarafından önerilen aşağıdaki programı ile termal cycler tüplerde kuluçkaya: 5 dk 25 ° c, 20 dk 46 ° C'de 20 dk için Ters transkripsiyon ve transkriptaz inactivation 95 ° C'de 1 dk
    3. QPCR astar her çift için en iyi duruma getirilmiş programı çalıştırın.
      Not: kesirler içinde belirli mRNA'ların olup olmadığını belirlemek için her kısmını (izole RNA) eşit birimden Ters transkripsiyon için kullanılmalıdır.
  3. Analiz sonuçları
    1. Delta Ct değerleri hesaplamak için baktılar gen ve luciferase Ct değerini kullanın
    2. Her kesir delta Ct değeri farklı fraksiyonları (Tablo 1) arasında mRNA dağılımını görselleştirmenizi bütün fraksiyonları bulunan mRNA toplamının yüzdesi olarak ifade

4. yalıtım ve Analizi miRNAs Polysome kesirler ve Nontranslating kesirler

  1. MRNA ve miRNA çıkarma
    Not: Bu protokol birkaç değişiklikle üreticisinin yönergelerini takip eder.
    1. Glikojen ve spike denetimi çözülme. Buz üstünde tutun.
    2. MiRNA ayıklama reaktif 700 µL havuza alınan örnek 200 µL için ekleyin.
    3. 1 µg/µL glikojen ekleyin ve pipet kullanarak lunaparkçı. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    4. 3.5 µL 1.6 x 108 spike içinde denetimi ekleyin ve karıştırın.
    5. Kloroform ve girdap 200 µL eklemek için en az 15 sn.
    6. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. 4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g , santrifüj
    8. Bir pipet kullanarak, süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Orta ve alt aşamaları atmak.
    9. 1.5 x hacmi % 100 etanol süpernatant için ekleyin ve karıştırın.
    10. Bu karışımdan 700 µL miRNA ayıklama sütuna aktarmak ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi s RT ve atma akışı-aracılığıyla; kalan herhangi bir örnek ile bu işlemi tekrarlayın.
    11. Arabellek 1 700 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.
    12. Arabellek 2 500 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.
    13. 500 µL % 80 etanol sütununu ekleyin ve RT 2 min için tam hızda santrifüj kapasitesi; akışı aracılığıyla atın.
    14. Yeni 2 kapağını mL Tüp, kapağı açın ve bu RT tam hızda 5 dk santrifüj kapasitesi sütun transfer; akışı aracılığıyla atın.
    15. O tam eluate buz üzerinde hız 1 dk az dik tutmak için ya da ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolamak sütun ve santrifüj 16 µL RNAse free su ekleyin.
      Not: Her örneğinin iki microliters OD analizi için kullanılabilir.
  2. Ters transkripsiyon
    1. Buzda hazırlayın. Her 20 µL RT-PCR reaksiyon için 4 µL miRNA RT arabelleği, nükleik asitlerin 2 µL, toplam RNA, enzim 2 µL ve su RNAse free 3 µL 9 µL ekleyin; Bunu karıştırıp kısaca aşağı sıralayacağız.
    2. Termal Cycler aşağıdaki gibi ayarlayın:
      60 dk 37 ° C;
      95 ° C 5 min için;
      4 ° C tutun.
    3. Termal cycler tüpler kaldırın ve 200 µL RNAse free su ekleyin. -20 ° C'de depolayın veya gerçek zamanlı PCR için devam edin.
  3. Gerçek zamanlı PCR
    Not: Bu protokol 96 iyi plaka biçimi izler. Buz reaksiyon karışımına hazır olun.
    1. PCR reaksiyon karışım hazırlamak ve cDNA (dan miRNAs yukarıdaki) iletişim kuralı tarafından kabul aralığı göre ekleyin. Toplu iş iş işlemde birden çok tepkiler hazırlanabilir.
    2. Toplam 25 µL PCR karışımı + cDNA her kuyuya ekleyin.
    3. Bir optik plaka mühür kullanarak plaka mühür.
    4. 1 dk 1000 x g oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
    5. Gerçek zamanlı cycler programı aşağıdaki gibi:
      İlk harekete geçirmek adım 15dk için 95 ° c;
      3-adım Bisiklete binme: 15 94 ° C'de denatürasyon s; 30 55 ° C'de tavlama s; uzantısı için 30 70 ° C'de s (floresan veri toplama gerçekleştirmek); 40 döngüleri eklemek;
      Erime-eğri cycler varsayılan göre.
  4. Karşılaştırmalı Analizi
    1. Normalleştirme örneği (bkz. Tablo 2):
      1. SCM en küçük değerini bulmak.
      2. Bu en az tüm SCM değerleri normalize.
      3. Bu değer miRNAs faiz (MOI) ve referans gen (REF) Ct değerlerinden çıkarma.
      4. 2-ΔCt formülü kullanarak verileri analiz.

5. proteomik analizi

  1. Proteinlerin çıkarma polysome kesirler
    1. Toplanan sükroz kesirler üç final kesirler birleştirin. Kesirler ağır (yüksek verimlilik polizomlar havuza alınan kesirler 4, 5, 6 ve 7 sükroz en yüksek konsantrasyon ile; Degrade tüp alt), mark ışık (düşük verimlilik polizomlar havuza alınan kesir 8, 9, 10 ve 11; ortasına Degrade tüp) ve (sukroz 12, 13, 14 ve 15 En düşük konsantrasyon ile havuza alınan kesirler; Degrade tüp üst) sigara çeviri . Protein tahlil havuza alınan kesirler gerçekleştirin.
    2. Trichloroacetic asit (TCA) stokunun % 100 hazırlamak ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Örnek 0.5 mL %100 60 µL ile karıştırın TCA ve gece karanlıkta-20 ° C'de kuluçkaya.
      Not: 1,5 mL düşük protein saklama tüpler ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.
    3. Gecede kuluçka sonra buz ve santrifüj 15.000 x g, 30 dk. atma süpernatant için 4 ° C, örnek çözülme.
      Not: Toplam protein örnek 100 µg tüp alt kısmında görünür protein Pelet verir.
    4. Önceden aseton-20 ° C-dondurucu soğuk. Protein Pelet ve santrifüj 15.000 x g, 15 dk. atma süpernatant için 4 ° C de soğuk aseton 0.5 mL ekleyin. Bu iki kez tekrarlayın.
    5. Hava kuru Pelet. Pelet 50 mM Tris-HCl tampon (pH 8) 360 µL içinde resuspend.
      Not: gerekirse, Pelet resuspend için bir darbe sonicator kullanın.
    6. 0.1 M dithiothreitol 40 µL ekleyin (son konsantrasyonu 10 mM) ve 55 ° c için 45 dk. Ekle 50 µL 0.15 M iodoacetamide, shaker üzerinde kuluçkaya (son konsantrasyonu 17 mM) ve shaker için 30 dk içinde karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Tripsin çözüm hazırlamak: tripsin 20 µg 50 mM Amonyum Bikarbonat 100 µL içinde resuspend. Tripsin çözüm ilgili birim için örnek 1:50 at (w/w) eklemek tripsin: protein oranı, bu pH 8 olduğundan emin olun ve shaker 37 ° c üzerinde kuluçkaya gecede.
      Not: 1 M Amonyum Bikarbonat pH 8'e getirmek için ekleyin.
    8. Tripsin sindirim sonra serin örnek, tezgah santrifüj, kısaca santrifüje eklemek %10 formik asit tripsin etkinlik gidermek ve örnek desalting ile devam etmek için pH 2-3.
      Not: μ-elüsyon plaka örnek desalting için kullanın.
    9. Durumda jelleştirici kuyuları ile üç kez Klima tarafından %0,1 formik asit 200 µL tarafından üç kez takip vakum kullanma metanol 200 µL 96 iyi plaka. Örnek yüklemek ve üç kez 200 µL %0,1 formik asit kullanarak bir örnek yıkama gerçekleştirin. Örnek 100 µL % 50 acetonitrile/0.1% formik asit ile iki kez düşük protein saklama 0.5 mL tüp içine elute.
      Not: örnek Elute yavaş yavaş ilk başta yerçekimi kullanarak düşük vakum tarafından izledi.
    10. Dar kurutma başlığını kullanarak kuruluk için örnek eluate buharlaşır ve ya doğrudan kütle spektrometresi analiz veya mağaza taşımak-80 ° c kadar kullan.
  2. Kütle spektrometresi Analizi
    1. Her Pelet (tryptic peptidler oluşan) 50-100 µL sulandırmak ve 1 µL kütle spektrometre enjekte.
      Not: Sulandırma ve enjeksiyon birimleri LC/MS/MS sinyal maksimum yoğunluk elde etmek için en iyi duruma getirme. Bizim durumumuzda, yüksek sinyal (Toplam iyon geçerli; İçinde TIC) aralığındaki 1E8 2E9 için kalp taraması yapıldı.
    2. Bir tuzak sütun C18 kullanın (300 µm kimlik x 5 mm, 5 µm, 100Å) tarafından takip peptid ayrılık C18 sütun (75 µm kimlik x 250 mm, 2 µm, 100Å) kullanarak bir akış hızı ayarı, 300 nL/dak Set nano-kaynak kapiller sıcaklık ile 275 ° C ve sprey voltajı 2 kV.
    3. 5-%35 B 90 dk, 3 dk için 35-%95 B %95 B 7 dk. ve %5 B 25 dk (A: %0,1 formik asit/su ve B: %0,1 formik asit Asetonitril) için denge holding doğrusal degrade uygulayın. MS2 spectra CID modunu kullanarak her MS1 inceden inceye gözden geçirmek--dan 15 en yüksek yoğunluk iyonları için kazanmak. 3 kütle spektrometresi çoğaltır analiz her örnek için kullanın.
      Not: En iyi duruma getirme ve deneysel koşullar ve örneklerinizi belirli kütle spektrometresi cihazda için uygun olan parametreleri kullanın. Koşulları/5.2 bölümünde açıklanan parametreleri. kullanılan ve bizim laboratuvar olarak en iyi duruma getirilmiş.
  3. Protein tanımlama/Nefelometri
    1. Kütle spektrometresi analiz sonra ham spectra dosyaları MSConvert yazılım (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) kullanarak uyumlu mzXML dosyalarına dönüştürün.
    2. Sun dönüştürülen dosyaları SEQUEST arama motoruna arama ölçütleri ile Örneğin, UniProtKB/İsviçre-Prot fare veritabanı (en kanonik gözden güncel); tripsin kullanarak yarı enzim Özet (KR sonra /-); 2 nefrette özledim; öncü Kütle aralığı: 400-4.500 amu; statik değiştirme: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid kitle tolerans: 50 ppm; parçası kitle türü: monoisotopic.
      Not: Diğer protein veritabanı arama motorları ve veri boru hatları kullanılabilir. Bir veritabanı veritabanları fare ve insan için daha az tam olan Örneğin fare için kullanıyorsanız fare (ve/veya insan karşı) aramanız gerekebilir Proteom kapsama artırmak için veritabanları. Bu durumda, fazlalık protein adlarındaki kaldırılması gerekir.
    3. Bir sonrası arama çözümlemesi gerçekleştirin. Verileri görüntülemek için filtreleri ayarlayın. Örneğin, bir minimum protein olasılık (protein eşik) %95 veya % 99, sadece kendisi için bir istatistiksel analiz örnek mevcut olan %95 veya % 99 olasılık anlamına gelir proteinler-ecek var olmak göstermek Yani, olarak ayarlayın. Peptid eşik (örn., %95), için filtre ayarlamak Yani, bir spektrum bir peptid tanımlar olup olmadığını belirlemede kullanılacak en düşük bir olasılık. Bir protein mevcut olup olmadığını belirlemek peptitleri en az sayısını seçin (2 peptidler olarak en az protein tanımlama için önerilir).
    4. Kalite/miktar için saptanan proteinler değerlendirin. Proteotypic peptidler miktar için kullanıldığından emin olun. İzoformu tanımlanmazsa üsleri belirli izoformu benzersiz bir amino asit dizisi oluşan bir tryptic peptid gözlenmesi üzerinde olduğundan emin olun. Herhangi bir "benzer" veya varsayımsal proteinler karşılaştırma görmek için geçmesi gözlenen peptidler karşılık gelen için bilinen bir protein.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

mRNA Analizi
mRNA sonuçları bir dağıtım her kesir (Şekil 3A); belirli bir mRNA olarak ifade miktar için polyribosomal çeviri kesirler birleştirmek ve mRNA bereket nontranslating kesirler çeviri içinde oranında sunulması sigara çevirme kesir (Şekil 3B), karşılaştırın. Ek bilgi yüksek verim polysome kesirler ayrı olarak düşük verimli polysome kesirler (ve ayrı nontranslating kesirler) inceleyerek elde edilir. (Nereye on...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Polysome profil analiz protein çeviri çalışması için belirli bir mRNA veya tüm transcriptome6,7translasyonel durumu analiz ederek sağlar. Yerel synaptosomes8gibi okudu gerektiğinde de çok yardımcı olur. Geleneksel olarak, bu yöntem mono - ve polyribosomes ve ilişkili mRNA'ların hangi ile genomik birleştiğinde olabilir sükroz degrade veya istediğiniz sonuçları6,9elde etmek için prot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

NIH P01 HL112730 (bez, JVE), NIH R01 HL132075 (bez, JVE), Barbra Streisand kadın kalp Merkezi (bez, JVE), Dorothy ve E. Phillip Lyon sandalye moleküler Kardiyoloji (bez), Erika Glazer donatılmış sandalye kadın kalp sağlığı (JVE) ve Çek bilim Kurumsal Destek RVO: 68081715 (MS).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ötenazi içinPentobarbitalVortech Phamaceuticals9373
Langendorff hazırlık
forsepslerindeGüzel Bilim Araçları91110-10asmak için kullanılır
Langendorff sistemiRadnoti + ev yapımın/aÖzel üfleme cam, boru ve su banyolarından oluşan bir 'dört kalp' sistemi
NaClSigmaS7653-5KGKrebs tamponu ve Sükroz gradyanı
KClSigmaP5405Krebs tamponu ve Lizis tamponu
KH2< / sub>PO 42< / sub>SigmaP-5504Krebs tamponu
MgSO4SigmaM7774-500GKrebs tamponu
GlikozSigmaG5767Krebs tamponu
CaCl2SigmaC1016-500GKrebs tamponu
Sükroz tozuSigmaS0389-1KGSükroz gradyanı
MgCl2Sigma208337Sükroz gradyanı ve Lizis tamponu
Tris-baseSigmaT1503-1KGSükroz gradyanı ve Lizis tamponu
Ksilen SiyanoleSigmaX-4126Sükroz gradyanı
SikloheksimidSigma-aldrich239763Sükroz gradyanı ve Lizis tamponu
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Lizis tamponu için RNAse inhibitörü
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Lizis tamponu
Proteaz İnhibitörü Kokteyl tabletleri, EDTA içermeyenRoche5056489001
Tüp, İnce Duvar, Ultra Berrak, 13,2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltrasantrifüjBeckmanLE-80KGradyanların Ultrasantrifüjlenmesi
RotorBeckmanSW41Degradelerin Ultrasantrifüjlenmesi
Biologic LP (pompa)Biorad731-8300Gradyanların fraksiyonlanması
BioFrac Biorad741-0002Gradyanların fraksiyonlanması
Eppendorf RNA/DNA LoBind mikrosantrifüj tüpleri, 2 mL tüpSigmaZ666513-100EAGradyan fraksiyonu ve RNA ekstraksiyonu
TRIzol ReaktifiYaşam teknolojileriAM9738RNA ekstraksiyonu
Lusiferaz Kontrolü RNAPromegaL4561RNA ekstraksiyonu
KloroformFisher ScientificC606-4RNA ekstraksiyon
Glikojen, RNA sınıfıThermo Fisher ScientificR0551RNA ekstraksiyonu
İzopropanolSigmaI9516RNA ekstraksiyonu
EtanolSigmaE7023-1LRNA ekstraksiyonu
iScript cDNA Sentez KitiBioRad170-8891Ters transkripsiyon
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Kantitatif PCR
miRNeasy Mikro Kiti (50)Toplam RNA izolasyonu içinQiagen217084
miScript II RT Kiti (50)MiRNA ters transkripsiyonu içinQiagen218161
miScript Sybr Green PCR Kiti (200)MiRNA'ların gerçek zamanlı PCR ekspresyon analizi içinQiagen218073
Santrifüj 5424REppendorf1.5 mL veya 2.0 mL'lik tüplerin farklı sıcaklıklarda santrifüjlenmesi için. Maksimum hız - 21130 x g
Santrifüj 5810REppendorfFarklı sıcaklıklarda gerçek zamanlı PCR plaka santrifüjlemesi için. Maksimum hız - 2039 x g
Ters transkripsiyon içinMy Cycler Thermal CyclerBio-Rad
CFX96 Gerçek Zamanlı Sistem/C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciBio-RadGerçek zamanlı PCR analizi için
miRNeasy Serum/Plazma Spike-in KontrolüQiagen219610RNA izolasyonunun kalite kontrolü için
Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları, düşük profilli, ince duvarlı, etekli, yeşil/şeffafBio-RadHSP9641Gerçek zamanlı PCR analizi için
Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapışkan, optikBio-RadMSB1001Gerçek zamanlı PCR plaka sızdırmazlığı için
Araştırma artı Tek Kanallı Pipet, Gri; 0.5-10 ve mikro; LEppendorfUX-24505-02Pipetleme için
PIPETMAN Klasik Pipetler, P20GilsonF123600GPipetleme için
PIPETMAN Klasik Pipetler, P200GilsonF144565Pipetleme için
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipet 100-1000 &mikro; LGilson17011782
Glikojen, RNA sınıfıpipetleme için Thermo Fisher ScientificR0551Toplam RNA izolasyon verimliliğini artırır
Posi-Click 1.7 mL Tüpler, doğal renkDenvilleC2170RNA izolasyonu ve depolaması; reaktif karışımı
Termal Döngü Tüpleri -0.2 mL Bireysel Kapaklar, optik olarakDenvilleC18098-4 (1000910)ile standart 0.2 mL tüplerTers transkripsiyon reaksiyonu
Sharp 10 Hassas bariyer UçlarıDenvilleP1096-FRPipetleme için
Sharp 20 Hassas bariyer UçlarıDenvilleP1121Pipetleme için
Sharp 200 Hassas bariyer UçlarıDenvilleP1122Pipetleme için
LTS 1 mL FiltreRaininRT-L1000FPipetleme için
miScript Primer Testi ( 200)Qiagen(miRNA'ya göre değişir)Gerçek zamanlı PCR analizi için
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp CihazlarıSükroz gradyanlarının hazırlanması için
trikloroasetik asitSigma AldrichT6399
asetonSigma Aldrich650501
Tris hidroklorürAmrescoM108
ditiyotreitolFisher ScientificBP172
iyodoasetamidGbiosciencesRC-150
sıralama sınıfı modifiye tripsin, domuzPromegaV5111
amonyum bikarbonatBDHBDH9206
formik asit, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
metanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
asetonitril, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Protein LoBind tüpleri 0,5 mLEppendorf AG22431064
Protein LoBind tüpleri 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB ve mikro; Elüsyon plakası 30 ve mikro; mOasis186001828BA
SpeedVac yoğunlaştırıcıThermo ScientificSavant SPD2010
sonikatörQsonicaOasis180
santrifüjThermo ScientificSorvall Legend mikro 21R
LC tuzak sütunu PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC ayırma sütunu PepMap RSLC C18Thermo Scientific164536
kütle spektrometresiThermo ScientificOrbitrap Elite iyon tuzağı kütle spektrometresi
MSConvert yazılımıProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST yazılımıSage-N Research, Inc.
kullanılan 103424 kalbi Kiti Kiti KitiUçlar

Kaynaklar

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303(2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Polizom ProfillemeProtein EkstraksiyonuTCA PresipitasyonuS kroz GradyanUltrasantrif gasyonmRNA Analiziskemi Reperf zyon
Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.