Yöntem makalesi

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

DOI:

10.3791/58088

⸱

7 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptosis phosphorylates ve karışık soy kinaz benzeri etki alanı pseudokinase, MLKL rüptürü veya plazma zarı permeabilize, aktive protein kinaz 3 (RIPK3), etkileşim reseptör etkinleştirme tarafından tetiklenen bir programlı hücre ölümü yoludur . Necroptosis otoimmünite, bulaşıcı ve kalp-damar hastalıkları, felç, ateş ve kanser de dahil olmak üzere birden çok patolojileri ile ilişkili inflamatuvar bir yoludur. Burada, MLKL necroptosis plazma zarı kopma cellat olarak karakterize etmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz necroptosis confocal ve konvansiyonel floresans mikroskobu ile canlı hücre Imaging'i kullanma hücreleri ve sabit hücrelerin elektron mikroskobu, birlikte plazma için sitozol üzerinden MLKL dağıtılması ortaya kullanarak işlem görselleştirmek membran plazma zarı büyük delikler indüksiyon öncesinde. Biz MLKL-aracılı necroptosis sözde modülatörler tanımlamak için lipidler kullanarak vitro nükleer manyetik rezonans (NMR) analiz mevcut. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, biz nicel lipid-bağlama tercihleri ve phosphatidyl inositol fosfatlar (pip) MLKL, plazma zarı hedefleme ve necroptosis permeabilization için gerekli olan kritik bağlayıcı olarak tespit edilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptosis genetik bileşenleri tanımlayan necroptosis dolaylı fizyolojisi ve hastalığı1,2,3,4,5' te test etmek için hayvan modellerinin kullanımı kolaylaştırdı. RIPK3 veya MLKL nakavt farelerde en az dolaylı geliştirme ve yetişkin homeostazı o necroptosis için hayat3,6şart değil ima vardı. Ayrıca, bazı türler ya RIPK3 ya da MLKL genler, necroptosis olmayan temel rolü hayvanların7,8' destek içermez. Öte yandan, çeşitli patolojileri laboratuvarda indüklenen ile nakavt hayvan modelleri zorlu necroptosis inflamasyon, doğuştan gelen bağışıklık ve viral enfeksiyon9,10, önemli bir rol ortaya koymuştur 11 , 12.

Necroptosis etkinleştirilmesi birkaç şekilde farklı doğuştan gelen bağışıklık sensörler sinyal tarafından tüm belgili tanımlık harekete geçirmek RIPK31,13,14hangi sonucu. Active RIPK3 sırayla phosphorylates ve MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 etkinleştirir ,11,12,13,14,15,16,17,18. En iyi okudu ve belki de RIPK3 aktivasyonu için önde gelen en karmaşık yolu da apoptozis ya da necroptosis1ikna etmek için sinyal kompleksleri aşağı akım kompozisyona göre hangi bifurcates ölüm reseptör ligasyonu, geçiyor. RIPK1 sinyal tercih edilir ve nişan RIPK319,20sonuç Necroptosis ensues. Bu sonuç kolayca farmakolojik inhibisyon veya caspase 8, bir sözde endojen inhibitörü olan necroptosis koyunda tutar necroptosis genetik silinmesi üzerine tercih edilir. RIPK1 bağlar ve RIPK3'ı etkinleştirir. Necroptosis etkinleştirmek için başka bir yol TLR3/TLR4 Toll benzeri reseptörler sinyal aracılığıyla yürütmektedir ve RIPK3 tır etki alanını içeren bağdaştırıcı indükleyici interferon-β (TRIF)21aktive olduğu. Henüz doğrudan yürütmektedir ve RIPK322etkinleştirir DNA sensör DAI, etkinleştirme tarafından necroptosis tarafından ölmek için başka bir yol olduğunu.

MLKL bir N-terminal helix paket (NB) ve bir düzenleyici küme ayracı bölge3ile bağlantılı bir C-terminal pseudokinase etki alanı (psKD) oluşan sitozolik bir proteindir. Normal hücrelerde, MLKL nereye RIPK314ile etkin olmayan bir karmaşık olduğu düşünülen sitozol bulunur. Harekete geçirmek-in necroptosis MLKL RIPK3 fosforilasyon harekete geçirmek ilmik psKD ve NF ve kaşlı ayraç3,15,23yılında potansiyel olarak ek siteler içinde tetikler. Fosforilasyon ayrılma RIPK314sonuç MLKL konformasyon bir değişiklik neden olmaktadır. Kötü anlaşılır konformasyon değişiklikleri küme ayracı psKD24yayın. 2 sarmal içeren küme ayracı, MLKL Oligomerizasyonda sözde trimer ile C-terminal helix25içine aracılık eder. Brace N-terminal helix membran permeabilization24,26için gerekli olan NB etki alanı engeller. Tecrit NB etki alanı plazma zarı permeabilization ve necroptosis16,24,27ikna etmek yeterlidir. NB pro-necroptotic etkinliği içinde fare embriyonik fibroblastlar MLKL (mlkl- / - MEFs) eksik öldürüldüğüne tanıklık etmişlerdir. NB tercihen fosfolipid phosphatidylinositol 4,5 nükleotittir (PIP2) yürütmektedir bir lipid bağlayıcı etki alanıdır. Biz MLKL, onda MLKL alımı için plazma zarı NB zayıf etkileşimler PIP2 kutup baş grup24ile üzerinden küme ayracı Oligomerizasyonda kolaylaştırır aktivasyon kademeli bir mekanizma önerdi. Membran NB PIP2etkin olmayan MLKL brace tarafından maskeli için bir ek yüksek afinite bağlama sitesinin düzenlenmiş pozlama uğrar. Genel olarak, her ne kadar bu olayların moleküler mekanizması-değil var aydınlatılmamıştır NB birden çok etkileşimler PIP2 ile onun kopmalara önde gelen plazma zarı istikrarsızlaştırmak.

Burada MLKL işlevini necroptosis24cellat tanımlamak için kullanılan belirli yöntemleri gösterilmektedir. Özellikle, biz odaklanmak en az etki alanı MLKL, NB ve küme ayracı (NBB), hangi küme ayracı inhibisyon tarafından düzenlenir ve plazma membran rüptürü ve necroptosis ikna etmek için zorunlu dimerization ile aktif hale getirebilirsiniz. Biz zorunlu uyuşturucu kaynaklı FKBP-aracılı dimerization canlı hücre görüntüleme ve necroptosis geçiren hücrelerin elektron mikroskobu ile birlikte bizim indüklenebilir ifade sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim vitro NMR Analizi NBB etkileşimleri ile phosphatidylinositols (pip) göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. klonlama ve hücre satırı üretimi

  1. PCR yükseltmek NBB bölge çerçeve standart Restriksiyon enzimi tabanlı Oligomerizasyonda etki alanı 2 x FK506 bağlayıcı protein (2xFKBP veya 2xFV) ve Venüs floresan ile klonlama olarak amino asit kalıntıları eklenmesi 1-140 (NBB140), insan MLKL cDNA sayfasından için karşılık gelen protein doksisiklin (Dox) - indüklenebilir retroviral vektör pRetroX-NBB140elde etmek için TRE3G - 2xFV-Venüs (Tablo 1, rakamlar 1A-B).
  2. Ölümsüzleştirmek SV40 büyük antijen ile geçici transfection tarafından ilgili fareler yeşil laboratuarda elde edilen birincil mlkl- / - veya ripk3- / - mlkl- / - fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) Plazmid ifade ediyorum. ~ 1 – 2 ile ölümsüzleştirdi hücreleri seçin hafta ve % 10 fetal Sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate ve 37 ° C ve % 5 CO2 standart doku'de gerekli olmayan amino asitler ile takıma DMEM korumak Kültür İnkübatörler.
  3. Transduce SV40 ölümsüzleştirilmiş mlkl- / - MEFs ile ters tetrasiklin kontrol transactivator (rtTA)-retrovirüsü blasticidin direnç gen (bizim değiştirilmiş plazmid) içeren bir plazmid ifade içeren ve 1 için tedavi hafta ile 5 μg/mL blasticidin stabil rtTA28ifade hücrelerini seçer.
  4. RtTA ifade MEFs ile Dox indüklenebilir retroviral vektör chimeric MLKL içeren transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-Venüs-puro) ve bir hafta, 2 gün sonra iletim için 4 μg/mL puromisindir kullanarak seçin.

2. canlı cep mikroskobu görüntüleme Necroptosis MLKL-aracılı

  1. Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-24 (1 mL/de) kuyuya başına 50.000 hücre yoğunluğu, Venüs de tabak ve gecede kuluçkaya (Şekil 2A). (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik hücre sayımı için canlı hücre boyama kullanın.
  2. Hücreler Dox ile 12 h için tedavi (0.5 μg/NBB140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs.
  3. Necroptosis 25 nM FKBP dimerizer (Dim) ile 25 nM membran geçirimsiz yeşil floresan yanı sıra teşvik ( Tablo malzemelerigörmek) standart DMEM boya (1.2 bakın). Necroptosis geçiren hücreleri birikir boya NBB140tarafından onların plazma membran bütünlüğü tehlikeye gibi-aracılı yırtılması. Deneyleri nüsha veya quadruplicate yerine getirmek.
  4. Tek veya çift renkli görüntüleme sistemleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak necroptosis izlemek için bir memeli doku kültürü kuluçka makinesine yer alan ilgili görüntüleme birimi damarları yerleştirin.
  5. Açık bilgisayar yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek) ve zamanlama yaklaşan tarar görevler listesinin altında sekmesini seçin.
    Not: bu iletişim kuralı tek renkli sistemleri kullanarak görüntüleme için ama benzer bir yazılım çift renkli sistemlerinde kullanılabilir.
  6. "Tepsi, gemi, tarama türleri" ve "Tarama deseni" "Fiziksel düzeni" sekmesini ve "Hızlı floresan" Özellikler sekmesini seçin.
  7. "İnceden inceye gözden geçirmek yanında tıkırtı zaman" "Zaman çizelgesi" pencere ve toplam zaman puan ve frekans Alım (genellikle 1 edinme her 0,5 h 6 12 h s veya fast-kinetik necroptosis için her 5 dk 1 h) ekleyin ve resim alma "App seçerek başlayın ly"(kırmızı düğme).
  8. Görüntü analiz yazılımı kullanarak necroptosis ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) seçerek "görev bölmesinden", "Nesne sayma yeni analizi ile sabit segmentasyon eşik arka plan seviyesinden", hangi tespit üzerine gelerek fare imlecini birkaç görüntü analizinde kullanılan bölgelerde arka plan üzerinde.
  9. Geçerli görüntü kullanarak önizlemesini görüntülemek seçerek floresan nesneleri inceleyin ve gerektiği gibi eşit düzeylerine rafine.
  10. Yeşil floresans sayar "Denize indirmek yeni analiz" sekmesini açarak entegre, "Zaman aralığı" seçmek, çözümlenmesi, "Analiz iş adı" girin ve "Tamam" tuşuna basarak için kuyu seçin.
  11. Erişim ilgili işin adına çift tıklatıp ek çözümleme harici grafik yazılım grafik/verme penceresinden verme "Analiz işleri" sekmesinden veri analiz ( Tablo malzemelerigörmek).
  12. Veri yeşil floresans pozitif (+ ve) olarak sayar/mm2 quantitate veya sayıları izdiham tarafından normale ve verileri hızlı yeşil floresans + ve sayıları/izdiham olarak.
  13. İsteğe bağlı olarak, deneysel uç noktada 100 hücrelerle leke membran-permeant yeşil floresan nM boya ( Tablo malzemelerigörmek). Yeşil floresans/yeşil floresans uç noktada oranı % necroptotic hücrelere veri normalleştirmek.

3. canlı hücre Confocal mikroskobu görüntüleme plazma zarı işe alım ve Permeabilization MLKL tarafından

  1. Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir cam (0.5 mL/de) kuyuya başına 20.000 hücre yoğunluğu, alt için 30 dk 37 ° C'de PBS içinde 50 µg/mL fibronektin ile ön işleme 4-şey mikroskobu odası ve ~ 12 h ( için kuluçkaya Şekil 2B).
  2. Dox hücrelerle tedavi (0.5 μg/mL) ~ 12 h NBB140ifade ikna etmek için-2xFV-Venüs.
  3. Necroptosis taze orta ile 25 (1 mL/de) kuluçka tarafından teşvik nM NBB140ikna etmek için Dim-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve plazma zarı için translocation.
  4. Çevre denetimi ve bir 63 ile donatılmış bir ters stand üzerinde inşa confocal mikroskobu tarama dönen disk lazer odası yerleştirin 1.4 NA amaç ve yazılım kullanarak edinme Imaging başlar ( Tablo malzemelerigörmek).
  5. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak, YFP filtre yapılandırma (uyarma dalga boyu 515 nm) ve "Focus" simgesini seçin.
  6. Görüş alanı ve odak düzlemi bulun ve "Kesin Focus" sekmesini kullanarak odak bakım sistem meşgul.
  7. Satın alma başlamak için filtre yapılandırma, uygun EMCCD fotoğraf makinesi pozlama zaman ve yoğunlaştırılması kazanç ve hızlandırılmış edinme parametrelerini aralığı ve edinme uzunluğu gibi atama tarafından takip "Yakalama" sekmesini seçin.
  8. İzlemek floresan NBB140hücresel yeniden dağıtım-2xFV-Venüs protein elde tarafından necroptosis sırasında görüntüleri her 10 515 nm lazer (Film 1) kullanarak bir EMCCD kamera tarafından s.
    Not: Photobleaching floresan protein görüntüleme ile bir husustur. Venüs daha dayanıklı floresan proteinler photobleaching29biridir. Photobleaching için daha duyarlı floresan proteinler kullandıysanız, her 30 resim s veya kurtarma görüntüleme zaman puan arasında sinyal sağlamak için daha uzun.
  9. NBB140Derneği plazma zarı izlemek için-2xFV-Venus necroptosis sırasında görüntü her 10 s örnek hazırlanan 3.3 içinde toplam iç yansıma floresans tarafından bir otomatik TIRF slider ile donatılmış bir mikroskop kullanarak (TIRF) mikroskopi ve bir 100 x 1.4 NA objektif ve bir EMCCD kamera (Movie 2). 3.5-3.7, adımları izleyin ama TIRF odak sekme mikroskobu odası örnek ve alt cam kalınlığı göre içindeki TIRF açısını ayarlamak.
    Not: plazma zarı işaretleyicileri LCK-C-RFP gibi denetimleri plazma zarı yerelleştirme TIRF analizi için kullanılabilir.
  10. Görüntü kalitesi Gauss işlev (Marr algoritması) negatif normalleştirilmiş ikinci türev ile evrişim tarafından geliştirmek için işleme gerçekleştirin.

4. elektron mikroskobu

  1. Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir yoğunluk plazma kaplı 150 mm 5 milyon hücre, hücre kültür çanak ve kuluçkaya 12 h (Şekil 3).
  2. Doksisiklin hücrelerle tedavi (0.5 μg/NB1-140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs 12 h için.
  3. NBB140ikna etmek-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve 25 ile plazma zarı translocation homodimerizer 5 min için nM. Bu sefer canlı hücre görüntülemede gözlenen necroptosis kinetik üzerinden kurulur.
  4. Medyayı çıkarın ve 10 mL % 2.5 oxazolidin, 37 ° C'de önceden ısınmış % 2 paraformaldehyde 0.1 M sodyum cacodylate tampon pH 7.4 içinde (cacodylate arabellek) kullanarak hücreleri tamir
  5. Kazıma örnek toplamak ve örnekleri 500 x g, 10 min için spin. Süpernatant atmak.
  6. Örnek % 1.5 potasyum ferrocyanide 0.1 M sodyum cacodylate tampon ile 1,5 saat içinde indirimli % 2 osmiyum tetroxide için postfix. Osmiyum tetroxide TEM içinde kontrast sağlamak için yaygın olarak kullanılan boyama bir ajandır. TEM necroptosis geçiren hücre SEM önce ön analiz olarak kullanılır.
  7. Örnek 5 kere 5 min için ultrasaf su vasıl 500 x gdurular arabelleği ardından, durulama (bkz: 4.6), su ve etanol otomatik bir işlemci. Süpernatant atmak.
  8. SEM için % 1 uranyl asetat ve kurşun aspartat heavy metalci leke31ile daha önce sabit örnekleri leke.
  9. Alkol ve propilen oksit çözümleri kademeli bir dizi örnekleri kurutmak.
  10. Örnek bir reçine blok elde etmek için sert reçine32 içinde embed.
  11. Analiz doğru alan belirlemek için 0.5 mikron kalınlığında bölümlerini kes.
  12. Elektriksel olarak iletken metal (Iridium) ultra ince bir film örnekleriyle kat.
  13. Görüntü ve örneklerini (Şekil 3). Miktar için reçine blok yüzey maruz kalan hücrelerle düşük-büyütme resim 5'te taranır bir elektron mikroskop kullanarak keV.
  14. Hücrelerin SEM tarafından yakalanan bireysel görüntüleri karşısında görselleştirmek veya görüntüleme yazılımı birden çok alan görünümü bir bitişik resim30birleştirmek için kullanılan. Kabaca 100 hücreler hücreleri necroptosis bu şekilde seçim yazılımında yüksek çözünürlüklü resim dizisi oluşturarak geçiren kısmını değerlendirmek için kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: SEM tarafından nekrotik morfoloji Puanlama normal hücre özellikleri önceden nekrotik veya nekrotik fenotipleri ilerleme ile karşılaştırır. Bu özellikler microvilli ortadan kalkması da dahil olmak üzere, düzleştirme, yırtığı 10 arasında değişen hücrelerdeki plazma zarı değişiklikler içerir nm 1 µm boyutu veya organel yapısı sitozolik hücre alan en az % 30-40 arasında kaybı için.

5. lipid bağlama, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından MLKL

  1. 15N etiketli NBB1-156 standart protein ifade ve arıtma yukarıda açıklanan24olarak hazırlayın.
  2. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol amonyum tuz (18:0 PI) ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) amonyum tuzu (18:1 PI) buz gibi CHCl3 her için son 1 mg/mL konsantrasyonda 500 µL 500 µg geçiyoruz.
  3. 1 mg/mL 18:0 ve sonication su banyosu oda sıcaklığında 1 dk 18:1 PI solüsyon içeren temizleyicide veya en fazla 5 dakika içinde bir buz-su karışımı.
  4. Aliquot 1 mg/mL 18:0 ve 18:1 PI içine temiz cam şişeler için bireysel NMR titrasyon serisi (Şekil 4). Transfer lipidler organik çözücüler hava geçirmez cam şırınga kullanarak içinde.
    1. 1 mg/mL 18:1 PI aliquot 132 µL (molar kütlesi = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µM konsantrasyon, 1200 µL son resuspension hacmi için.
      Not: 5 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 1000 µL ve son NMR örnek hacimleri > 500 µL. 3 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 300 µL ve son NMR örnek hacimleri > 150 µL.
  5. Aliquot 1 mg/mL domuz beyin 20 L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate amonyum tuzu: 9:1 CHCl3/MeOH/H2O (beyin PI (4,5) P2) temiz cam şişe içine.
  6. Şişeleri argon (Ar) veya azot (N2) karşı cam şişe duvarları sıçramasına olmadan organik çözücü buharlaşır için orta akış ile gaz akışı altına yerleştirin. Otuz beş dk 10-200 µL organik çözücü birimler için genellikle yeterli olur.
  7. Cam vial(s) Büchner veya vakum büyük Cımbız kullanarak flask altındaki bir kauçuk tıpa ile mühür ve bir vakum hattına bağlı plastik boru eklemek düzenlemek. Şişesi altında kalan organik kaldırmak için hafif vakum gecede tahliye edin.
  8. Lipid film aliquots inert gaz ile yerleşimi, hava geçirmez bir kapak ile mühür ve daha uzun vadeli depolama için kullanmak bir ay içinde veya-80 ° C-20 ° C'de depolayın.
  9. NMR örnek arabellek deterjan olmadan hazırlamak (-Det) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, %10 D2içeren O ve deterjan (+ Det ile) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, içeren %10 D2O, 0,34 mM n-Lauryl-β-D-maltopyranoside (demir).
  10. Ekle + cam şişe istenen toplama ulaşmak için ve su banyosu ilâ 30 dk sonication için 10 dk alternatif için solüsyon içeren temizleyicide lipid film ile Det arabelleğe görsel denetim tarafından takip.
    Not: Örnek Sonication sıcak. Oda sıcaklığında son protein örnek sulandırma önce 15 dakika soğumasını bekleyin.
  11. Lipid-deterjan micelles + 1:1 karışımları sonication için istenen konsantrasyon serisi kullanarak Det arabellek seri seyreltme gerçekleştirin. 125 µM lipid konsantrasyonu başlayarak, üç tekrarlama 62.5 µM, 31.3 µM ve 15,6 µM lipid 0,34 mm DDM ortaya çıkarır.
  12. Denetim hazırlayın ve protein ve katkı - Det NMR örnekleri başvuru ve + Det arabellekleri, anılan sıraya göre. Protein ve lipit içinde her seyreltme için katkı + Det arabellek ekleyin.
    Not: 15N NBB156için protein 40 µM son bir konsantrasyon için eklendi ve azaltılmış Cys artıkları tutmak için 2 mM deuterated dithiothreitol ile desteklenmiştir.
  13. Örnekler uygun hacmi (bkz: Not Adım 5,4) 5 mm veya 3 mm NMR tüpler aktarın.
  14. El ile yükleme örnekleri NMR alet veya bir Otomasyon platform SampleCase yükleyici gibi düzenleyin.
  15. Kalite kontrol en iyi duruma getirilmiş enine gevşeme spektroskopisi (TROSY) olarak 2D 1H -15N korelasyon spectra tarafından takip olarak 1H proton spectra için standart darbe programları kullanarak bileşik NMR spectra elde etmek veya heteronuclear birden fazla kuantum tutarlılık (SOFAST-HMQC)33.
    Not: 3 mm NMR tüpler kullanımı 1 H -15N TROSY (~ 3 h) veya 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 dk) 64 inceden inceye gözden geçirmek ister. Tarama numaraları 5 mm NMR tüpler için yarıya iner.
  16. İşlenmiş 2D NMR spectra çözümleme veya kullanıcıya diğer yazılım CARA depo34 eklenebilir.
  17. Yazılım 2D NMR rezonanslar her protein durumu için üç iyi dağınık ve çözümlenen tepeler için ek açıklama ekleme tarafından analiz. Her NBB156 (Şekil 5A) içeren her arabellek koşul için altı zirvesinin en yüksek genlikleri kaydedin.
    1. Bir toplu iş-entegrasyon liste hazırlamak için Cara'yı kullanın (tıklatın ana menü başlığı "spektrum | Kurulum toplu iş listesi"...) Tüm spectra toplanan ve bir tek en yüksek atama dosyasını kullanarak analiz (tıklatın ana menü başlığı "tepeler | Peaklist alma"..... .ve 6 Toplam tepeler, 3 içinde tanımlanan her protein durum için bir .peaks Kullanıcı tanımlı dosya seçin).
    2. Uygulamasının ayarlarını ("ıntegrator | En yüksek Model tune"...) X-genişlikte 0.06 ppm ve Y-genişlik 0.30 ppm (tıklatın ana menü başlığı "ıntegrator | En yüksek Model tune"...) Son çıktı iki menü seçimlerini (1. kaydetmeden önce Ana menü başlığını tıklatın "ıntegrator | «««Entegre"toplu liste) (2. Ana menü başlığını tıklatın "tepeler | Entegrasyon tablosunu verin") (Şekil 5B).
      Not: Kalıntıları M21, V53 ve L105 omurga Amid rezonanslar NBB156 kapalı küme ayracı devlet için atanmıştır. Açık küme ayracı devlet omurga Amid rezonanslar kalıntılarının G130 ve A141 ve 3D NMR deneyler24kullanarak epsilon proton yan zinciri rezonans W133 atandı.
  18. Örnekleri farklı mıknatıslar veya örnek koşullar doğrudan karşılaştırma için üç açık küme ayracı genlikleri başvuru örneklerinin ortalama ve iki başvuru ile ilgili bir normalleştirme faktörünün hesaplanması normalleştirmek. NBB156 rezonanslar normalleştirme faktörü ve ayar negatif genlikleri (Tablo 2) sıfır olarak kullanarak için ölçekli genlikleri hesaplayın.
    Örnekler: 1) farklı mıknatıslar örnekleri karşılaştırma: mıknatıs A, NBB156+ DDM ve mıknatıs B, NBB156+ DDM. 2) deterjan karşılaştırma: 0,34 mM DDM ve 1.7 mM DDM.
  19. Ölçekli kesir, kapalı - veya açık-tüm spectra ürününün için maksimum minimum genlik yelpazesi ile bölünerek küme ayracı içeren uygun başvuruları ücretsiz NBB156 ve tamamen açık ayraç NBB156 içinde toplanan her rezonans için hesaplamak deterjan.
  20. Normalleştirilmiş NMR genlikleri lipid konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak arsa ve açık küme ayracı NBB156 farklı koşullarda (şekil. 5 C) kısmını karşılaştırın.
    Not: Alternatif olarak, kapalı küme ayracı conformation lipid konsantrasyon karşı kısmını analizini NBB156lipid bağlama karşılaştırmak için gerçekleştirilebilir. Çünkü bu daha hızlı ve lipidler tarafından daha iyi kesir raporlarda tam-nişanlı eski analiz tercih ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş necroptosis yürütme canlı hücrelerdeki görselleştirme en az bir kesilmiş yapı, NBB140MLKL indüklenebilir ifade yoluyla mümkün olmuştur-2xFV-Venüs. Bu yapıyı plazma zarı permeabilization ikna yeteneği korur ve Dim kaynaklı Oligomerizasyonda FKBP kaset (2xFV) etkinleştirilir. Biz gözlemlemek ve necroptosis tarafından Imaging, kinetically (her 5 dk) bir hücre geçirimsiz yeşil floresans DNA bağlama boya (Şekil 6A) alımını i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MLKL plazma zarı yırtılması24sözde cellat karıştığı için kombine teknikleri için iletişim kuralları sağlar. Necroptosis MLKL-aracılı düzenleyen yasal ağ deşifre ek olarak, bu tekniklerin uygun diğer biyolojik sistemleri tanımlamak için bağımsız olarak kullanılabilir. Pratik olarak konuşursak, bu teknikleri orta-düşük verimi keşif araçları vardır.

Biz düzenli olarak canlı hücre görüntüleme NBB140kullandık-2xFV-Venüs-aracılık necroptosis ve mechanistically necr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Klonlama ve hücre hattı oluşturma
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transaktivatör plazmidiLlambi et al., 2016
Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF'ler) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HidroklorürThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS # 3513-03-9
< güçlü > Hücre ölümü miktar tayini ve canlı hücre mikroskobu< / güçlü >
DoksisiklinClontech631311 CAS # 24390-14-5
B / B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS # 195514-80-8
SYTOX YeşilThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Amonyum KlorürCambridge İzotop LaboratuvarlarıNLM-467-10 CAS # 12125-02-9
Döteryumlu DTTCambridge İzotop LaboratuvarlarıDLM-2622-1
Döteryum OksitSigma Aldrich617385-1 CAS # 7789-20-0
n-Dodesil-β-D-MaltopiranosidAnatraceD310 CAS # 69227-93-6
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat (Beyin, Domuz) (amonyum tuzu)Avanti Polar Lipidler840046X CAS # 383907-42-4
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoinositol (amonyum tuzu) (18:0 PI)Avanti Polar Lipidler850143 CAS # 849412-67-5
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-miyo-inositol) (amonyum tuzu) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS # 799268-53-4
Özel Ekipman
IncuCyte FLR veya ZOOMEssen BioScience, Inc.Canlı hücre mikroskobu görüntüleme
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher Scientific Elektronmikroskobu
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comGörüntüleme analizi
FEI MAPS, ThermoFisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analizi
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMR veri toplama
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMR veri analizi
Slidebook3i (Akıllı Görüntüleme Yenilikleri)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookKonfokal mikroskopi
,, , , ,,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MLKL NecroptosisPlasma Membrane RuptureLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

İlgili makaleler