Method Article

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bugüne kadar odak dejeneratif hastalıkların tedavisi için farklı gelişim aşamalarında birkaç kök hücre türü vardır. Henüz, ilk büyük hücre ölümü ve düşük tedavi edici etkileri, gibi belirli özellikleri onların geniş klinik çeviri bozulmuş. Genetik Mühendisliği kök hücre nakli öncesinde tedavi kök hücre efektleri optimize etmek için umut verici bir yöntemi olarak ortaya çıktı. Ancak, güvenli ve verimli gen vasıtalarının hala eksik. Bu nedenle, uygun yöntem geliştirme kök hücre tabanlı tedaviler mevcut sorunları çözmek için bir yaklaşım sağlayabilir.

Mevcut Protokolü çıkarma ve karakterizasyonu insan diş kökü kök hücre (hDFSCs) yanı sıra kendi viral genetik değişiklik açıklar. Doğum sonrası diş kökü yüksek yayılma potansiyeli haiz yetişkin multipotent kök hücre hasat için umut verici ve kolayca erişilebilir bir kaynak olarak açıkladı. Açıklanan yalıtım yordamı hDFSCs gömülü yirmi yaş dişleri üzerinden hasat için basit ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Ayrıca bu iletişim kuralı izole hücreler kök hücre özelliklerini tanımlamak için yöntem oluşmaktadır. Genetik mühendisliği için hDFSCs, bir en iyi duruma getirilmiş katyonik lipit tabanlı transfection strateji sitotoksik efekt neden olmadan sağlayan yüksek verimli mikroRNA giriş sunulmaktadır. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme tehlike olmadan davranışını kontrol mikroRNA'lar geçici hücre düzenleme, uygun adayları şunlardır. Böylece, bu iletişim kuralını onların tedavi edici etkinliği optimize etmek için önemli hale gelebilir hDFSCs Mühendisliği için güvenli ve verimli yordamı temsil eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan diş kökü bir gevşek ectomesenchymally kaynaklı bag gelişmekte olan diş1,2çevreleyen doku var. Işlevini koordinat osteoclastogenesis ve osteogenesis diş Erüpsiyonu işleminin, özellikle periodontium3,4,5geliştirilmesi için kök ve progenitör hücrelerin bu doku liman. Bu nedenle, diş kökü insan yetişkin kök hücreleri6,7hasat için alternatif bir kaynak olarak kabul edilir.

Çeşitli çalışmalarda insan diş kökü kök hücreler (hDFSCs) dokusunu, bağ fibroblastlar ve cementoblasts8,9,10 da dahil olmak üzere periodontal lineage ayırt yetenekli olduğunu gösterdi . Ayrıca, bu hücreler kendini yenileyerek kapasitesi, plastik bağlılık, ifade belirli yüzey işaretleri de dahil olmak üzere tüm özellikleri mezenkimal stromal hücre (MSCs) Maç gösterilmiştir (örneğin, CD73, CD90, CD105) olarak osteojenik de, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma potansiyeli11,12,13. Diğer çalışmalar da hDFSCs2,14,15,16,17,18bir sinirsel farklılaşma potansiyeli ortaya koydu.

Umut verici özellikleri ve kolay erişim nedeniyle, hDFSCs doku mühendisliği19,20,21için son zamanlarda ilgili oldu. İlk çalışmalar DFSCs potansiyeli kemik, periodontal yeniden üzerinde yoğunlaştı ve19,22,23,24,25,26Diş kökleri, 27,28,29,30. HDFSCs nörojenik yeteneğini bilen beri onların uygulama nörodejeneratif hastalıklar için olası tedavi olarak incelenen31,32,33olmuştur. HDFSCs da ile mineral için önem kazandı diğer dokulara (Örneğin, kornea epitel)34,35rejenerasyon. HDFSC tedavi edici potansiyel sadece onların doğrudan farklılaşma potansiyeli aynı zamanda parakrin faaliyetlerini dayalı değildir. Son zamanlarda, hDFSCs bir servet matriks metalloproteinazların (MMPs), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve Hepatosit büyüme gibi biyoaktif faktörlerin salgılar gösterilmiştir faktör (HGF), anjiogenez, immunomodulation, ekstra hücresel matris remodeling ve onarıcı süreçleri36için çok önemli bir rol oynamaktadır.

Ancak, kök hücre tedavisinin geniş klinik çeviri hala büyük ilk hücre ölümü ve düşük faydalı kök hücre etkileri37,38gibi çeşitli sorunlar tarafından Engelli. Genetik Mühendisliği bu sorunları ele almak üzere bir umut verici strateji sağlar ve bu nedenle kök hücre38,39,40tedavi edici etkinliği büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme41,42, tehlike olmadan davranışını kontrol uygun adaylar, mikroRNA (miRs) geçici hücre manipülasyon için şunlardır 43. bugüne kadar birkaç yararlı miRs kök hücre çoğalması, hayatta kalma, posta, parakrin aktivite yanı sıra kendi farklılaşma içine birkaç soy44teşvik tespit edilmiştir. Örneğin, miR-133a hazır sıçan kalpler değiştirilmemiş MSCs45ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş bir kardiyak fonksiyon sonuçlanan bir artan hayatta kalma ve engraftment gösterdi MSCs mühendislik. Aynı şekilde, miR-146a overexpressing MSCs iskemik doku46gelişmiş bir terapötik verimliliği için sırayla açan VEGF daha yüksek miktarda salgılaması için gösterildi.

Bu el yazması seçici ayıklama ve hDFSCs genetik mühendisliği için detaylı bir Protokolü sunar. Bu amaçla, biz insan diş köklerinin hasat ve enzimatik sindirim yanı sıra hDFSCs sonraki yalıtım nitelendirdi. İzole hücreleri ayırdetmek için MSC özellikleri doğrulanması için önemli talimatlar için hücresel tedavi13uluslararası toplumun kurallarına uygun olarak dahil edilmiştir. Buna ek olarak, biz katyonik lipit tabanlı transfection strateji ve transfection verimliliği ve sitotoksisite değerlendirilmesi uygulayarak hDFSCs miR-modified nesil için ayrıntılı bir açıklama sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs çıkarılan yirmilik dişler bölümü Oral ve Maksillofasiyal Cerrahi plastik cerrahi Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından sağlanan diş köklerinin etkilenmezsiniz. Aydınlatılmış onam ve yazılı onayı elde edilen tüm hastalar. Bu çalışmada Rostock Üniversitesi (izni Hayır ' 2017-0158) Yerel Etik Komitesi tarafından yetkilendirilmiştir.

1. hDFSCs yalıtım

Not: Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yirmilik dişler çıkarma önce patlak değil

  1. Gerekli çözümleri hazırlanması
    1. Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hazırlamak / penisilin-streptomisin-glutamin (P-S-G) çözüm: PBS 495 mL 5 mL P-S-G çözeltisi ile karıştırın. Mağaza aliquots 4 ° C'de 50 ml
    2. HDFSC kültür ortamı hazırlamak: Bazal orta 445 mL 5 mL antibiyotik Ajan ve 50 mL fetal Sığır serum (FBS) ile karıştırın. 4 ° C'de mağaza
    3. Collagenase türü hazırlamak çözüm (30 mg/mL) stok: 300 mg Collagenase tip ı bazal orta 10 mL % 1 antibiyotik ajanı ile desteklenmiş oranında seyreltin. Çözüm kuvvetle karıştırın. Çözüm 0.2 µm filtre kullanarak filtre. Mağaza aliquots Collagenase 500 µL olan tip ı hisse senedi çözüm-20 ° C'de
    4. Dispase II stok çözüm (40 mg/mL) hazırlamak: Dispase II 40 mg 10 ml % 1 antibiyotik ajanı ile desteklenmiş bazal orta oranında seyreltin. Çözüm kuvvetle karıştırın. Çözüm 0.2 µm filtre kullanarak filtre. -20 ° C'de Dispase II stok çözeltinin 500 µL deposu aliquots
  2. Cerrahi müdahale
    1. Yeterli miktarda enjekte (en fazla: 2 mL) Yerel anestezi.
    2. Oluşturmak ve bir üç cepheli mucoperiosteal kapak yükseltmek. Dilli bir kapak yükselterek gerekli değildir.
    3. Dilli yönü periosteal bir Asansör ile korumak.
    4. Yavaşça değirmen bukkal ve distal kemik ile bir yuvarlak sert metal burr.
    5. Periosteal bir Asansör ile folikül dokusu gevşetin. Dikkatli bir şekilde tam diş (mikrop) ve taç çekerek folikül (ve folikül) posterior (üçüncü molar) forseps ile çıkarın.
    6. Yarayı ve soket NaCl çözüm ile iyice sulama.
    7. Mucoperiosteal flep ( Tablo malzemelerigörmek) vicryl sütür ile değiştirin.
    8. Diş kökü ağız boşluğu kaldır ve çözüm PBS/P-S-G 50 mL bir aliquot koyun.
      Not: Örnek 4 ° C'de daha fazla işleme kadar saklanır.
  3. Diş folikülü enzimatik sindirim
    1. HDFSC kültür orta ve oda sıcaklığında (RT) PBS/P-S-G çözüm önceden ısıtmak.
    2. Çözülme her Collagenase türden bir aliquot ben ve Dispase II stok çözümleri. Hazırlamak bir sindirim çözüm olarak 3 mg/mL Collagenase türü ben ve 4 mg/mL Dispase II her Collagenase 500 µL tip ı ve Dispase II stok çözüm 4 ml bazal orta içeren % 1 antibiyotik Aracısı ekleyerek.
    3. Ayıklanan folikül içinde steril Petri kabına yerleştirin ve 10 mL çıkarılan doku yıkamak için PBS/P-S-G çözeltisi ekleyin. İki kez bu çamaşır tekrarlayın.
    4. Yaklaşık 1 mm x 1 mm içinde Petri kabına 10 mL PBS/P-S-G çözeltisi içeren steril neşter ile parçalara ayıklanan folikül kıyma.
    5. Kıyılmış transferi doku ve 50 mL konik santrifüj tüpü Petri kabına çözümden PBS/P-S-G. Petri kabına 10 mL PBS/P-S-G çözeltisi ile yıkayın ve çözüm aynı tüpün içine aktarın.
    6. Konik santrifüj tüpü için de RT 353 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    7. 5 mL sindirim çözeltisi pelleted doku ekleyin. Çözüm ve doku karışımı yavaşça. Titreyen bir kuluçka 2 h 37 ° C ve % 5 CO2 karisimin kuluçkaya.
    8. Santrifüj hücre/doku süspansiyon vasıl 353 x g 10 dakika dik atma süpernatant, sindirmek ve elde edilen Pelet 6 mL hDFSC kültür ortamının yeniden askıya alma.
    9. Tohum hücre süspansiyon 25 cm2 ' deki kültür şişesi hücre ve hücre 37 ° C, % 5 CO2 ve %20 O2kuluçkaya.
      Not: Doku tamamen sindirilmiş değil, kalan doku hücre kültür şişesi için de aktarın.
    10. Orta hücre tohum sonra 24 h dikkatli bir şekilde değiştirin. Daha sonra orta confluency kadar üç her gün değiştirin.
      Not: HDFSCs plastik-yapışık 24 h hücre tohum sonra olmalıdır ve yapışık olmayan hücreleri ve kan bileşenleri sadece orta değiştirerek ayrılabilir.
  4. Hücre hasat
    1. HDFSC kültür orta, PBS/P-S-G çözüm ve tripsin/Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm RT. için önceden ısıtmak
    2. Süpernatant kültür balonun üzerinden atmak ve konfluent hücreleri 5 mL PBS/P-S-G çözeltisi ile yıkayın.
    3. Kültür şişeye 1 mL tripsin/EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 3 min için kuluçkaya Kültür şişeye hDFSC kültür orta 3 mL ekleyerek sindirim işlemini durdurun.
    4. Hücre süspansiyon 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarmak ve süspansiyon RT. atma süpernatant de 353 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi ve Pelet hDFSC kültür orta uygun bir miktar yeniden askıya alma.
    5. Hücreleri saymak: hücre süspansiyon 10 µL Trypan mavi çözüm 10 µL ile karışımı yavaşça. 10 µL sayım odasına uygulamak ve hDFSC hücre tutarını hesaplar.

2. hDFSCs karakterizasyonu

  1. Immunophenotyping
    1. Akış sitometrik çözümlemesi için hücre hazırlık
      1. Gerekli çözümleri hazırlanması
        1. PBS/EDTA (2 mM) hazırlamak: PBS 996 mL EDTA (0,5 M) 4 mL ile karıştırın.
        2. Boyama arabellek hazırlamak: PBS/EDTA (2 mM) 995 mL 5 g BSA ile karıştırın. 0,22 µm filtre birimini kullanarak çözüm filtre ve kullanım kadar 4 ° C'de depolayın.
        3. Paraformaldehyde (PFA) hisse senedi çözüm (% 4) hazırlamak: 4 g PFA PBS 100 ml seyreltik ve çözüm ile 80 ° c ısı Çözüm mix ve 7.3 pH değerine ayarlayın. Aliquot İngiltere'de yılın ilgili tutarları (1,5 mL) ve mağaza-20 ° C'de çözümde kullanımı kadar elde.
          Dikkat: PFA duman zehirli olduğundan, İngiltere'de yılın çözüm havalandırılmış duman başlıklı hazırlayın.
      2. (1.4) hasat hücre sonra 14 örnekleri 5 x 104 hücre 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın. Süspansiyonlar, 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
        Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreleri ve Kimyasalları buz Aksi belirtilmediği sürece tutun.
      3. Boyama arabellek (4 ° C) belirli miktarda hücrelerde yeniden askıya alma ve Tablo 1' de gösterildiği gibi reaktif (4 ° C) engelleme FcR ekleyin.
      4. İlgili örnek iç tarafında üzerine aşağıdaki antikorlar Tablo 1' de gösterildiği gibi ekleyin: Allophycocyanin (APC) fare anti-insan CD29; APC fare Igg1 κ izotip kontrol; Peridinin-klorofil protein (PerCP)-Cyanine5.5 fare anti-insan CD44; PerCP-Cyanine5.5 fare Igg2b κ izotip kontrol; V500 fare anti-insan CD45; V500 fare Igg1 κ izotip kontrol; Phycoerythrin (PE) fare anti-insan CD73; PE fare Igg1 κ izotip kontrol; PerCP-Cyanine5.5 fare anti-insan CD90; PerCP-Cyanine5.5 fare Igg1 κ izotip kontrol; Anti-insan CD105 fare: Alexa Fluor (AF) 488; fare Igg1 negatif kontrol: AF488; PE-Cyanine7 fare anti-insan CD117; PE-Cyanine7 fare Igg1, κ izotip kontrol. Antikorlar her örnek için eklendikten sonra antikorları Döndür ve karışımı yavaşça. 4 ° C'de 10 dakika için çözümler kuluçkaya
      5. PBS (4 ° C'de) 1 mL ekleyin ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
      6. PBS (4 ° C) 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma ve İngiltere'de yılın (% 4) 33 µL ekleyin. Çözüm mix ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.
    2. Akış sitometrik ölçüm hücre
      Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreler buz üzerinde ölçüm kadar tutmak.
      1. Ifade yüzey antijenleri incelemek tüpler akış sitometrik ölçümleri için uygun içine örnekleri aktarın.
      2. Akış Sitometresi kullanarak en az 2 x 104 olayları ölçmek. Şekil 2' de gösterildiği gibi analiz.
  2. HDFSCs multipotent farklılaşma potansiyeli
    1. Adipojenik ve osteojenik ve hDFSCs chondrogenic farklılaşma potansiyeli onaylamak için bir ticari olarak mevcut insan mezenkimal kök hücre fonksiyonel kimlik seti kullanın. Eşek Anti-keçi AF488 ikincil antikor yağ asidi bağlayıcı protein 4 (FABP4) boyama için geçerlidir ve aggrecan yanı sıra eşek Anti-fare AF488 ikincil antikor osteokalsin boyama için. Çekirdekleri boyama için montaj orta 4' ile 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanın.
      Not: Örnekleri olmadan birincil antikor negatif denetimleri mikroskobik analizleri için hazırlamak.
    2. İfade proteinlerin confocal mikroskobu tarama lazerle inceliyorlar. Mikroskopi ayarları: 40 x amacı ile petrol daldırma; uyarma lazer 488 nm (için AF488) ve 405 nm (için DAPI).

3. hDFSCs transfection

  1. (1.4) hasat hücre sonra 24-şey hücre kültür tabakta transfection önce 24 h hDFSCs tohum.
    Not: Hücre yoğunluğu yaklaşık Iyi başına 4 x 104 hücre ulaşıyor. Hücreleri ~ %80 izdiham transfection gününde ulaştırılması gerekmektedir.
    Not: bir diğer hücre örnek olarak denetim akış sitometrik çözümlemesi için tohum.
  2. Transfection konut projeleri hazırlanması
    Not: RNases gelen önlemek amacıyla RNase dekontaminasyon çözüm kullanarak transfection kompleksleri hazırlanması önce doğrudan çalışma alanı temiz. Yalnızca RNase ücretsiz malzeme ve çözümleri kullanın.
    Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin.
    1. MiR hisse senedi çözüm (50 µM) hazırlamak: nükleaz ücretsiz 100 µL suda Cy3 etiketli habercisi miR (5 nmol) yeniden askıya alma. Aliquot miR ilgili tutarları (5 µL) hisse senedi çözümde ve mağaza-20 ° C'de karanlıkta kullanım kadar elde.
    2. MiR (50 µM miR hisse senedi çözüm 0.8 µL) indirimli serum orta 66.7 µL 40 pmol oranında seyreltin. Çözüm karışımı yavaşça
    3. İndirimli serum orta 66.7 µL katyonik lipit tabanlı transfection reaktif 0.67 µL sulandırmak. Çözüm karışımı yavaşça ve RT., 5 min için kuluçkaya
    4. Kuluçka sonra önceden seyreltilmiş transfection reaktif için önceden seyreltilmiş miR ekleyin. Çözüm karışımı yavaşça ve RT., 15 dk için kuluçkaya
  3. Hazır transfection kompleksleri dropwise doğrudan hücre kültür medyada ekleyin. 24-şey hücre kültür plaka ileri geri sallanan tarafından karışımı yavaşça.
  4. Hücreleri 37 ° C, % 5 CO2ve %20 O2 24 h için kuluçkaya.

4. Transfection Analizi

Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin.

  1. Transfection sonra hasat hücre
    Not: Tüm hücre çözümleri aynı 15 mL konik santrifüj tüpü içinde bir örneği toplamak.
    1. 24 h transfection sonra ilgili santrifüj tüpleri örneklerinde süpernatant toplamak.
    2. PBS 1 mL hücrelerle yıkayın, PBS ilgili santrifüj tüpüne aktarmak ve 500 µL eklemek tripsin/EDTA (RT) hücrelere. 37 ° C'de 3 dk için çözümler kuluçkaya
    3. Trypsinization 1 mL (RT) kültür ortamının ekleyerek hücreleri ve transfer çözüm ilgili santrifüj tüpü içine bırak. 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj hücreleri
      Not: Bu tarihten itibaren aksi belirtilmedikçe hücreleri ve Kimyasalları buz üzerinde tutun.
  2. Akış sitometrik çözümlemesi için hücre hazırlık
    1. Süpernatant atmak. Boyama arabellek (4 ° C) ve transfer hücre çözümü için 1.5 mL microcentrifuge tüp 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
    2. 0.5 µL Amin reaktif boya örnekleri için canlı ve ölü hücreleri arasında ayırmak için ekleyin. Yavaşça çözüm mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
    3. Hücreleri ve 300 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için PBS (4 ° C'de) 1 mL ekleyin Süpernatant atmak.
    4. PBS (4 ° C) 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma ve İngiltere'de yılın (% 4) 33 µL ekleyin. Çözüm mix ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.
  3. Akış sitometrik ölçüm hücre
    Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreler buz üzerinde ölçüm kadar tutmak.
    1. Örnekleri tüpler akış sitometrik ölçümleri için uygun içine aktarın.
    2. Hücre canlılığı ve miR alımını verimliliği bir akış sitometresi kullanarak inceleyin. En az 2 x 104 olaylar ölçmek. Şekil 4' te tasvir gating stratejiyi kullanın.
      Not: Untransfected hücreleri negatif kontrol Cy3 pozitif hücreler için geçişi düzenlemek ve transfection tarafından neden olduğu hücre ölümü hesaplamak için kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hDFSCs insan diş kökü dokusundan hasat için detaylı yalıtım talimat mevcut. Rutin bir ameliyat sırasında diş kökü kolay erişim nedeniyle, bu yetişkin kök hücreleri çıkarım için umut verici bir kaynaktır.

İzole hDFSCs MSCs13tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi. Aslında, plastik-yapışık hücreleri küçük kültür koşulları açıklanan ve fibroblast benzeri morfoloji (Şekil 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erişkin kök hücrelerin şu anda birçok dejeneratif hastalıkların tedavisi için odak vardır. Özellikle, kemik iliği (BM)-hematopoetik kök hücre (HSCs) de dahil olmak üzere, kök hücre elde edilen ve MSCs, yoğun klinik soruşturma47altında. Ancak, BM hasat bağış yerinde ağrı neden invaziv bir işlemdir ve istenmeyen olaylar48olarak yol açabilir. Son zamanlarda, Doğum sonrası diş dokusu bir roman ve kök hücre için kolayca erişilebilir kaynak olarak ortaya çıkmıştır. Bu diş kök hüc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889018) ve nemli Vakfı (2016-11) FORUN Program tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak,'da ve R.D. BMBF (VIP + 00240) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fare anti İnsan CD105 Antikoru: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Klonu SN6, monoklonal
Fare IgG1 Negatif Kontrol Antikoru: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488monoklonal
APC Fare Anti-İnsan CD29 AntikoruBD Biosciences559883Klon MAR4, monoklonal
APC Fare IgG1, κ İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences555751Klon MOPC-21, monoklonal
PE Fare Anti-İnsan CD73 AntikoruBD Biosciences550257Klon AD2, monoklonal
PE Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences555749Klon MOPC-21, monoklonal
PE-Cy7 Fare Anti-İnsan CD117 AntikoruBD Biosciences339217Klonu 104D2, monoklonal
PE-Cy7 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences557872Klon MOPC-21, monoklonal
PerCP-Cy5.5 Fare Anti-İnsan CD44 AntikoruBD Biosciences560531Klon G44-26, monoklonal
PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b, & kappa; İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences558304Klon 27-35, monoklonal
PerCP-Cy5.5 Fare Anti-İnsan CD90  AntikorBD Biosciences561557Klon 5E10, monoklonal
PerCP-Cy5.5 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences55095Klon MOPC-21, monoklonal
V500 Fare Anti-İnsan CD45 AntikoruBD Biosciences560777Klon HI30, monoklonal
V500 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol AntikoruBD Biosciences560787Klon X40, monoklonal
FcR Bloke Edici Reaktif, insanMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 & mikro; m, radyo-sterilize, polietersülfon
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
İnsan Mezenkimal Kök Hücre Fonksiyonel Tanımlama KitiR& D SystemsSC006
RNase dekontaminasyon solüsyonu; RNaseZap RNase Dekontaminasyon SolüsyonuThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3 etiketli öncü miR; Cy3 Boya Etiketli Pre-miR Negatif Kontrol #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Pre-miR miRNA Öncü Negatif Kontrol #1Thermo Fisher ScientificAM17110 5 nmol
Katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi; Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher Scientific11668019
Azaltılmış serum ortamı; Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985070
Eşek anti-Keçi IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055poliklonal
Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202poliklonal
Montaj ortamı; DAPISigma-AldrichF6057-20MLhistoloji montaj ortamı
ELYRA PS.1 LSM 780 konfokal mikroskopZeiss
BD FACS LSRII akış sitometresiBD Biosciences
BD FACSDiva Yazılımı 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 yazılımıZeiss
Trypsin / EDTA çözeltisi (% 0.05 / % 0.02)PBS'de BiochromL2143, w/o: Ca2+, Mg2+
Amin reaktif boya; CANLI/ÖLÜ&ticaret; Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke KitiThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7.4; w/o: Ca ve Mg
PSG (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
Bazal ortam; Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antibiyotik, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Kollajenaz tip IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Filtre, Sterifix şırınga filtresi 0.2 ve mikro; mBraun4099206
50  mL konik santrifüj tüpüSarstedt62,547,254
15 mL konik santrifüj tüpüSarstedt62,554,502
Hücre kültürü şişesi 75 cm2Sarstedt833,910,002
Hücre kültürü şişesi, 25 cm2Sarstedt833,911,002
Dondurma ortamı, BiofreezeBiochromF 2270
KriyotüplerThermo Fisher Scientific3772671.8 mL
Tripan mavisi çözeltisiSigma-AldrichT8154%0.4
Sayma odasıPaul Marienfeld
Lokal anestezik, Ksilositin (lidokain hidroklorür) %2 epinefrin (adrenalin) ile %0.001Mibe
NaCl çözeltisiBraun0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapideEthicon3 - 0
ile Fluoroshield

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles