Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Summary

Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Abstract

Carboxylesterase-aracılı metabolizma çeşitli böcek böcek ilacı direnci önemli bir rol oynamaktadır düşünülmektedir. Böcek ilacı direnci veriyor onların rolleri keşfedilmeyi kaldı, ancak birkaç carboxylesterase genler dayanıklı ev sinek gerginliği, yukarı düzenlenir bulunamadı. Burada, biz bir protokol carboxylesterases fonksiyonel karakterizasyonu için tasarlanmıştır. Üç örnek deneyler sunulmaktadır: (1) ifade ve yalıtım carboxylesterase protein aracılığıyla bir baculovirus-aracılı böcek Spodoptera frugiperda (Sf9) hücre ifade sistemi; (2) bir hücre tabanlı MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromür) böcek hücreleri toleransları farklı Permetrin tedavilere; ölçmek için sitotoksisite tahlil ve carboxylesterases doğru Permetrin metabolik yeteneklerini keşfetmek için (3) vitro metabolik çalışmaları. MdαE7 dayanıklı bir evden klonlanmış carboxylesterase gen soy ALHF sinek ve Sf9 hücreleri enfeksiyon için rekombinant baculovirus oluşturmak için kullanılan. Hücre viabilities farklı Permetrin tedaviler karşı MTT tahlil ile ölçüldü. Permetrin için denetim gruplarının (kedi-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri ve GFP-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) ile karşılaştırıldığında deney grubu (MdαE7-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) Gelişmiş hücre toleransları tedaviler MdαE7 yeteneklerini böylece hücrelerin kimyasal zararlardan korunması, böcek öldürücüler, metabolize önerdi. Bunun yanı sıra, carboxylesterase proteinler böcek Sf9 hücrelerde ifade ve vitro metabolik çalışma yapmak için izole. Bizim sonuçları önemli vitro bir metabolik verimlilik MdαE7 Permetrin, doğrudan böcek ilaçları metabolize içinde carboxylesterases tutulumu gösteren doğru belirtilen ve böylece evde böcek ilacı direnci veriyor uçar.

Introduction

Böcek ilacı direnç Şu anda evi sinek denetim dünya çapında^1,2önemli bir konudur. Böcek ilacı direnç mekanizmasının belirlemek için çabaları bu konunun daha iyi anlamayı kolaylaştırır ve böylece etkili önlemek veya direnç geliştirme³yayılmasını en aza indirmek için roman stratejileri sağlamak. Carboxylesterases, bir büyük detoksifikasyon enzimler olarak iyon ve böcek öldürücüler çeşitli böcekler^4,5,6metabolize rolleri için ilgi çok çekmiştir. Bizim önceki çalışma evi sinekler içinde birden çok c....

Protocol

1. ifade ve yalıtım bir böcek hücre Baculovirus-aracılı ifade sistemi ile hedef proteinlerin

1. Directionally evi sinekler üzerinden hedef proteinlerin PCR ürünleri künt uçlu klon.
   1. PCR astar yeşil flüoresan protein (GFP) ve ev sinek MdαE7 gene onların dizileri ve seçtikleri vektörü (Tablo 1) özel gereksinimleri temel tasarım.
   2. Bir transfer, prova-okuma DNA polimeraz ve astar adım 1.1.1 150 µL PCR reaksiyon (30 µL tepki arabelleği, 10 mM dNTPs, DNA polimeraz 1,5 µL, ev sinek şablon DNA, ileri astar 7.5 µL 6 µL 3 µL yapmak için kullanın Bir son Hacim 150 µL su ile ters astar 7.5 µL). PCR reaksiyon için 30 98 ° c ısı 35 98 ° C de....

Results

Hücre canlılığı farklı Permetrin tedaviler (ÇMT tahlil) doğru

.......

Discussion

Son yıllarda, kapaklı ifade sistemleri yaygın olarak hızlı ve büyük miktarda protein, böylece biyokimyasal ve fonksiyonel belirlenmesi ve enzimler vitrokarakterizasyonu izin izole etmek için kullanılmıştır. Bugüne kadar Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeve Spodoptera frugiperda gibi birkaç farklı model sistemleri Rekombinant protein ifade ve seçim için adapte edilmiştir vitro sistem baktılar proteinler^22,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q5 Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz	New England Biolabs inc.	M0491L
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti, Tek Atışta TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli	Invitrogen ile yaşam teknolojisi K240020		SEC ortamı ve evrensel M13 dizi primerleri bu kite dahil edilmiştir.
PureLink HiPure Plazmid Miniprep Kiti	Yaşam teknolojisi ile canlandırıcı	K210002
Gateway LR Clonase II BaculoDirectTM Kitleri için	enzim karışımı Yaşam teknolojisi ile Invitrogen	11791-023
BaculoDirect C-Term Lineer DNA Transfeksiyon Kiti	Yaşam teknolojisi ile canlandırıcı	12562-019	Cellfectin transfeksiyon reaktifi ve gansiklovir bu kite dahil edildi
	pENTR-CAT plazmid	İnvitrojeni	BaculoDirect C-Term Lineer DNA Transfeksiyon Kitine dahildir, konsantrasyon: 0.5 ug / uL
Isı ile inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu,	Life Technologies tarafından Sertifikalı Gibco	10082-139
Sf9 hücreleri Sf-900 III SFM	Gibco by Life Technologies	tarafından 12659017
Böcek Hücresi-PE LB Böcek Hücresi Protein Ekstraksiyonu & Lysis Buffer	G Biosciences, A Geno Technology Inc	786-411
Sf-900 III SFM (1 kez;) Serum İçermeyen Ortam	Komple Gibco by Life Technologies	12658-019
Grace's Insect Medium, takviyesiz	Gibco by Life Technologies	11595030
Permetrin (izomerler) analitik standardı	SUPELCO by Solutions WithinTM	442748
Metanol (analitik dereceli)	Sigma-Aldrich	67-56-1
Asetonitril (analitik dereceli)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Akrodisk 25 mm Şırınga Filtreleri 0.45 & mu; m GHP Membran (HPLC Sertifikalı)	Pall Yaşam Bilimleri	21890388
Alliance Waters 2695 HPLC Sistem	Suları
T100 Termal Çevrim	Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş.
Nanodrop 2000/2000c Spektrofotometreler	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Sitasyon 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu	BioTek