Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Özet

Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.

Özet

Bağışıklık sistemini sağlıklı bir kalp, temel bir bileşenidir. Miyokardiyum olduğunu farklı bağışıklık hücre alt kümeleri fonksiyonel bölünebilme kararlı duruma sırasında ve çeşitleri enflamasyon sırasında ile zengin bir nüfusa ev. Yakın zamana kadar kalbinde bağışıklık hücreleri çalışma mikroskobu kullanımını gerekli veya yeterli duyarlılığı sırasında şiddetli inflamasyon sağlanan ama güvenle aciz kalmışlardır kötü gelişmiş sindirim protokollerini tanımlamak küçük — ama anahtar — nüfus hücreleri kararlı duruma sırasında. Burada, bir basit yöntem birleştirerek enzimatik (collagenase, hyaluronidase ve DNaz) ve küçük ayırt etmek için antikorlar fluorescently etiketli intravasküler yönetimi tarafından öncesinde fare kalplerin mekanik sindirim tartışmak ama kaçınılmaz damar içi hücre kirletici. Bu yöntem tarafından incelendi akış sitometresi tanıma, fenotipleme ve miktar veya floresan aktif hücre sıralama veya manyetik boncuk ayrılması için daha fazla saf izole hücrelerin bir süspansiyon oluşturur Transkripsiyon analiz veya vitro çalışmalar. Biz anahtar makrofaj ve dendritik hücre popülasyonlarının kalp ayırt etmek için bir adım adım akış sitometrik analizin bir örnek içerir. Bir orta ölçekli deney (10 kupa) yordamı tamamlandıktan 2 – 3 saat gerektirir.

Giriş

Miyokardiyal stres veya yaralanma, iskemik dahil olmak üzere (iskemi reperfüzyon veya miyokard infarktüsü) farklı formları ve iskemik olmayan (hipertansiyon veya miyokardit), ama aynı zamanda Onarıcı ve koruyucu, inflamatuar hücrelerle istihdamı teşvik patojenik özellikleri. 1891, gibi erken Romberg ilk hücresel infiltratlar tifüs ve Kızıl hastalığı¹ile infekte hastaların Miyokardiyum varlığı tarif. Ancak, kardiyak bağışıklık hücreleri detaylı çalışmanın daha gelişmiş immunophenotyping teknikleri geliştirilmesi gerekmektedir. Sonuç olarak, yakın zamanda bağışıklık hücreleri temel bakım rolleri ile farklı bir popülasyon sırasında kararlı duruma Miyokardiyum içinde bulunduğu anlamaya başlamıştır.

Histoloji oldu ve hala, enflamasyon sırasında kalp bağışıklık hücreleri ayırdetmek için en yaygın yöntem. Ancak, Histoloji değerli bir tanı aracı temsil ederken, kullanımı kardiyak bağışıklık hücreleri insan önemli sınırlamaları vardır. Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri toplam hücrelerin çok küçük bir oran temsil ve orantılı olarak çok büyük bir alanda daha fazla veya daha az eşit olarak dağıtılır. Benzer şekilde, kardiyak inflamasyon, viral miyokardit gibi çeşitli formları inflamasyon odak desenleri gösterin. Kalp bağışıklık sisteminin doğru analiz kez yüksek derece histolojik örnekleme, önyargı azaltmak için maliyeti artan gerektiren anlamına gelir. Ayrıca, Histoloji çok sınırlı bir hücre kimliği (Örneğin sayıda parametre) kullanışlı bilgileri sağlar. Akış Sitometresi (yüzey işaretleyicileri, transkripsiyon faktörleri veya salgılanan moleküller gibi) birden çok ifade işaretleri kullanımını gerektiren hücre alt kümeleri artan bir sayı ile immunophenotyping için en güçlü araç olarak kendisini kurmuştur, düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi nedeniyle.

İmmunophenotyping teknikleri çok sayıda hücreleri tek hücre analizi için izin verimli sindirim protokolleri gelişimini yakından bağlıdır. Hücre ekstraksiyon ayrıntılı iletişim kuralları gelişimi kardiyak İmmünoloji çalışmada fırsatları yeni bir pencere açtı. Arada sindirim, akış sitometresi ve transcriptomics yoluyla, makrofajlar ve dendritik hücreleri merkezinde ikamet eden büyük nüfus karakterize^2,3olmuştur. Kardiyak bağışıklık hücreleri en bol popülasyon sırasında kararlı duruma vardır CD64⁺MerTK⁺ CCR2 veya CD11c²onların ifade üzerinde temel alan makrofajlar, daha da ayrılabilir. CCR2⁺ ise makrofajlar yetişkin kemik iliği hematopoiesis kaynaklanan çoğu CCR2 MHC-II yüksek veya düşük düzeyde ifade edebilir,^- makrofajlar, esas olarak Doğum öncesi kökenlidir. Makrofajlar onarım⁴ ve enkaz⁵ kaldırılması sırasında yaralanma veya elektrik bağlantısı⁶ sabit durumda destekleyen gibi temel fonksiyonları yerine getirir. Enflamasyon sırasında çeşitleri Ly6C^Merhaba MHC-II^lo CD64^int monosit önemli bir akını oluşur, hangi daha sonra Ly6C^Merhaba CCR2 ayırt⁺ makrofajlar^2,7 . Önemli ölçüde daha küçük ancak önemli Vaha'da hücrelerinin sağlıklı bireyler Miyokardiyum içinde ikamet eden dendritik hücreler^8,9/ oluşur. Kardiyak geleneksel DCs (KGK) iki ana alt kümeleri son zamanlarda nitelendirmiştir: cDC1 (CD103⁺ DCs) ve cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs enfeksiyon⁸ karşı savunmak için önemli rol oynarlar ama aynı zamanda kendini yaralama sırasında özellikle⁹miyokard infarktüsü enflamasyon sırasında yükseltebilirsiniz.

Burada, fare Miyokardiyum üzerinden kardiyak immün hücrelerin izolasyonu için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi analiz veya daha fazla akış sitometresi sıralama veya manyetik boncuk zenginleştirme tarafından saf bir tek hücre süspansiyon elde etmek için enzimatik ve mekanik sindirim bir hücre-Süzgeç filtrasyon ile birleştirir. Extravascular miyokard hücrelerinin doğru ölçümler kardiyak perfüzyon kardiyak microvasculature kan olası kirletici kaldırmak için gerektirir. Buna ek olarak, biz daha fazla intravasküler kirleticiler, Galkina ve ark. Protokolü¹⁰tabanlı miyokardiyal hücreler ayırt etmek için kullanılan bağışıklık hücrelerinin damar içi etiketleme, isteğe bağlı bir adım mevcut. Son olarak, biz büyük makrofaj ve cDC altgrupları tanımlamak için bir temel Akış Sitometresi Analizi mevcut.

Protokol

Etik Beyanı: Bu protokol gözden geçirilmiş ve Üniversitesi Sağlık Ağı (Toronto, Kanada), hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ile uyumlu.

1. arabellek hazırlık

1. HBB arabellek (Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, %0,2 sığır serum albümin) hazırlayın. Isı 10 mL Sığır serum ve HBSS 500 ml Sığır serum albümin 1 g inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın
2. FACS arabellek hazırlamak (fosfat tamponlu tuz (PBS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, pH 8.0)). Sığır serum ve 1 mL 0.5 M EDTA PBS 500 ml 10 mL ısı inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın
   Not: Çözümler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.

2. lökosit dolaşan etiketleme

1. Aseptik steril fosfat tamponlu tuz (PBS) için 200 µL/fare son enjeksiyon hacmi içinde seyreltilmiş antikor 1 µg ile Anti-fare CD45 enjeksiyon hazırlayın. Birim 28,5 G insülin enjektör yük ve ışıktan uzak tutun.
   Not: iki farklı fluorochrome etiketli anti-CD45 antikorlar intrakardiyak boyama üzerinden intravasküler (damar yolu yönetim lekeli) ayırt etmek için kullanın (sindirim sonra lekeli; bkz. Adım 4).
2. Fareler (8-12 hafta yaşlı) kırmızı ısı lamba 5 min için kuyruğuna açarak önceden ısıtmak.
   Dikkat: hayvan aşırı değil. Lamba güvenli bir mesafede tutmak (> 30 cm).
   1. Hayvan sternal konumda uygun bir aygıt kullanarak engelleyin. Ortaya çıkarmak ve sigara dominant el ile kuyruk kuyruk dizin ve orta parmak ile altyapı ve kuyruk başparmak ve parmak yüzük ile orta-distal bölge immobilizing tarafından stabilize.
      Dikkat: cilt çıkardı gibi çok fazla güç kuyruk ucunda geçerli değildir. İğne eğimi damar içine yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. Gibi damar ponksiyon kolay iğne her zaman ven paralel tutun.
      Not: kan şırınga girerek oluşabilir ve iyi bir enjeksiyon işaretidir. İğne 90 ° açı bükme damardan yönetim kolaylaştırabilir. Bükme iğneler bir tehlike temsil edebilir gibi ile emanet ofis onaylayın.
   2. 200 µL intravenöz kuyruk damar içine enjekte. Sıvı kolay akışını ve geçici olarak ven temizleyin.
      Dikkat: direnç karşılandığında sıvı zorlamayın. Bu iğne saklanmalıdır işaretidir.
   3. Antikor insanca fare ötenazi önce 5 min için dolaşmaya izin.

3. kalp yalıtma ve sindirim

1. CO₂ kullanarak fare ötenazi veya diğer kurumsal olarak kabul edilen ötanazi yordam tarafından.
   1. CO₂ ötenazi, CO₂ odasında fareyi getirin ve dakikada (odası 10 L, 2 L/dk dolgu iseYani, ) Odası hacmi %20 için dolgu oranını ayarlamak. Nefes kesildiği tarih vardır kadar 2 dk ve monitör mouse için çalıştırın.
   2. CO₂ kes ve ek bir 1-2 dk. nefes odası açmadan önce kesildiği tarih vardır sağlamak için fare ve fare fare işlemeye devam etmeden önce öldü onaylamak için bir ayak çimdik gerçekleştirmek.
2. Sprey % 70 etanol ile fare. Karın, cilt kaldırın ve fare kadar göğüs kemiği kalça düzeyinde ventral orta hat başlangıç boyunca keserek incelemek. Karın açar ve diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer gider.
3. Diyafram, sonra kaburga akciğer ve kalp delinme önlemek için dikkatli olmak orta çizgi, her iki tarafta kesti.
   1. Peeling ezbere geri kaburga, sonra Sol kulakçık sağ kulakçık tarafından takip kesim ilk maruz.
      Dikkat: Bu organlarda bulunan kan yıkama etkinliğini azaltabilir gibi herhangi bir arter veya damarlar yaralandı, sağlanması atria, kesme dikkatli kullanın.
   2. 15-20 mL soğuk PBS 21 G iğne ile donatılmış bir 60 mL şırınga kullanarak ve soğuk PBS kalple sıvı. Yavaşça kalp Bankası forseps ile kavramak ve tepe yakınındaki sol ventrikül iğne yerleştirin. Sağ ventrikül yordamı yineleyin. Uygun bir enjeksiyon beyaz akciğerler ve soluk karaciğer ile sonuçlanır.
      Not: Perfüzyon ötenazi sonra 5 dakika içinde organ hücreleri dolaşan ile ilgi kontamine kan pıhtılaşması önlemek için yapılmalıdır.
4. Kalp Bankası forseps ile tutun ve hafifçe yukarı çekin kalp, sonra kalp ana pulmoner arterler ve damarlar, aort ve perikardiyal çuval keserek ayırmak.
   1. Kalp kalp başparmak ve işaret parmakları arasında bir temiz havsız kağıt havlu ile nazikçe tutarak temiz ve kulakçık ve ana arterler ve damarlar ve diğer kirletici maddeleri kalıntıları forseps ile çekin.
      Not: kulakçık tamamı kaldırılır ve bu dokularda kendi yerleşik bağışıklık hücreleri gibi hiçbir diğer dokular, akciğer veya kan damarları, gibi mevcut olun. Akciğer özellikle bu Miyokardiyum içinde daha küçük nüfus maske yapabilirsiniz bir büyük bağışıklık hücre nüfusa sahiptir.
5. Kalp 50 µL soğuk PBS ile 5 cm plastik çanak yerleştirin.
   1. Görünür hiçbir parça vardır ve pürüzsüz bir tutarlılık vardır kadar eğri diseksiyon makası kullanarak kalp kıyma.
      Not: kalp doku kaybı en aza indirmek için kesme sırasında yemeğin bulunduğu bir alanda bulundurmaya çalışın.
   2. 2 mL microcentrifuge tüp ile 800 µL soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) içine eğri forseps kullanarak thetrituratedheart doku aktarın.
6. Ben, hyaluronidase tip ı-S 60 U/mL ve DNaz 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase ekleyin-ben her örnek için.
   1. 45-60 dk 50 RPM sallanan bir shaker olarak 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
7. Sindirim, girdap örnekleri kısa bir süre sonra (20 s) ve hemen buz örnekleri 4 ° C'de tutmak için yer
   1. Doku örnekleri homojen ve Pipet Ucu zarar değil kadar 1 mL pipettor kullanarak, örnekleri yukarı ve aşağı pipet.
      Not: bir kaç kez pipet için tanımlama tekrarlanabilirlik artabilir. Kalpleri en iyi şekilde sindirmek değil eğer Miyokardiyum adet pipet engel. Yavaşça microcentrifuge tüp karşı pipet ucu Bileme daha büyük doku parçaları homojenize yardımcı olacaktır.
8. 50 mL konik tüp ile 1 mL soğuk HBB yerleştirilen bir 40 µm hücre süzgeç önceden ıslak.
   1. Homojenize örnek için filtre ekleyin ve yavaş yavaş 12-14 mL soğuk HBB dökerek ile yıkayın.
   2. Filtre uygulanmış örnekleri etiketli 15 mL konik tüp aktarmak ve 4 ° C'de tutmak
9. Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de Süpernatant Aspire edin.
   1. Her örnek için 1 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği ekleyerek kırmızı kan hücreleri parçalayıcı. Örnekleri vortexing tarafından resuspend ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   2. Lizis tamamladıktan sonra 5-8 mL, soğuk Hank'in dengeli tuz çözüm (hemoliz durdurmak için HBSS) ekleyin.
10. Örnekleri, 400 x gfor 4 ° C'de 5 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin.
11. Her örnek ve etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp transferi FACS arabelleği 1 mL ekleyin.
    Not: Protokol burada en fazla 2 saat için 4 ° C'de depolanan örnekleri ile duraklatılmış

4. akış sitometresi boyama ve analiz

1. Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de
   1. Non-spesifik antikor bağlama azaltmak için seyreltik 1: 100 anti-CD16/CD32 ve monosit engelleyici (1:20) (bakınız Tablo reçetesi) muhasebe örnek başına 50 µL FACS için. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
   2. Antikor seyreltme (1:250 her antikor için) muhasebe FACS 50 µL örnek başına için hazırlayın.
      Not: Bir canlılık boya antikor kokteyl ölü hücreleri dışlamak için eklenebilir. Alternatif olarak, küçük boyutlu dışlama akışı analizi tarafından kullanılan (Şekil 1C ve D) olabilir.
   3. Çamaşır olmadan, 50 µL antikor ana karışımı her örnek ve karışımı ekleyin.
   4. Örnekleri için karanlıkta 30 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
2. Yıkama ve örnekleri, 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek 600 µL FACS eklemek
3. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 300 µL FACS içinde resuspend. Karanlıkta 4 ° C'de örnekleri tutmak.
   Not: Bazı canlılığı boya, DAPI gibi akış sitometresi çalıştırmadan önce 10 dakika içinde boyama gerektirir.
4. Akış Sitometresi tarafından analiz (bkz: Şekil 1 ve 2) sonraki 3 saat içinde. Eğer daha uzun bir süre düşük konsantrasyon paraformaldehyde kullanarak gerekli, kısa vadeli fiksasyon (0.5-%1 PBS) boyama korumak için önerilir.
   Not: Akış sitometresi akışkanlar tıkanıklığı önlemek için bir 40 µm hücre süzgeç önce başlatmak Akış Sitometresi Analizi yoluyla örnekleri filtre uygulamak için önerilir.

Sonuçlar

Bugüne kadar iyi bir yöntem yoktur cardiomyocytes gibi diğer kardiyak hücre bileşenlerinden bağışıklık hücreleri izole etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, kardiyak tek hücre süspansiyon tarafından Akış Sitometresi Analizi bir tek hücre ve küçük boyutlu dışlama gating (Şekil 1A) ardından bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlamak için CD45 ile önceden geçişi gerektirir. Alternatif olarak, ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık boyama g...

Tartışma

Miyokardiyal iltihap veya miyokardit, en kalp-damar hastalıkları bir özelliktir. Ancak, Miyokardiyum sigara hastalık durumlarında kendi bağışıklık bileşenlerinde yoksun değildir. Kararlı duruma sırasında birçok bağışıklık hücreleri Miyokardiyum içinde bulunan ve bakım ve koruma önemli rol oynarlar. Bu farklı nüfus hücrelerin karakterizasyonu bu protokol için sunulan bir gibi yöntemleri olmadan mümkün olmazdı.

Miyokardiyum mekanik ve enzimatik sindirim bir arada analiz, akış sitometresi veya im...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fosfat tamponlu tuzlu su Wisent		311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) PrecisionGlide İğne	BD	305167
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Sığır serumu	Sigma	B9433
0.5 M Etilendiamintetraasetik asit	BioShop	EDT111
Vakum filtresi, 0.2 ve mikro; m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insülin şırıngası	BD	329424
60 mL şırınga	BD	309653
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM, 4.5 g/L glikoz ve L-Glutamin ve Sodyum Piruvat
Kollajenaz ile	Clostridium histolyticum'dan	Sigma	C0130
Hyaluronidaz tip I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513
Hücre süzgeci, 40 & m Naylon	Falcon	352340
Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponu	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-fare/insan CD11b	Biolegend	101222	1:250 seyreltme
APC/Cy7 anti-fare Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 seyreltme
APC anti-fare CD103	Biolegend		121414 1:250 seyreltme
Brilliant Violet 605 anti-fare CD11c	Biolegend	117334	1:250 seyreltme
PE anti-fare Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 seyreltme
Pasifik Mavisi anti-fare I-Ab	Biolegend	116422	1:250 seyreltme
FITC anti-fare CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 seyreltme
PE / Cy7 anti-fare CD45	Biolegend	103113	1:250 seyreltme
PerCP/Cy5.5 anti-fare CD45	Biolegend	103132	1:40 seyreltme
TruStain fcX (anti-fare CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 seyreltme
True-Stain Monosit Bloker	Biolegend	426101	1:20 seyreltme
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Fare: Batf3-/-	Jackson Laboratuvarı	JAX: 013755