Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

9.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58140

⸱

3 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HKHT) genetiği hematopoetik hücrelerin kötü huylu potansiyelini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını açıklar. HKHT çeşitli malign hematopoetik hücrelerin vivo içinde değerlendirmek için hem de Roman terapiler değerlendirmek için büyük bir kohort myelodisplastik sendrom (MDS) veya lösemi ile farelerin üreten yararlıdır.

Özet

Myelodisplastik sendrom (MDS) etkisiz hematopoiesis, periferik kan cytopenias, displazi ve akut lösemi için dönüştürme için bir eğilimi tarafından tanımlanan hematopoetik kök hücre bozuklukları farklı bir grubuz. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenik farelerde periferik kan cytopenias, displazi ve akut lösemi için dönüşüm açısından insan MDS özetlemek. Biz daha önce MDS MDS ile genetik bir fareden vahşi tipi alıcılara MDS kemik iliği parçalanmayabilir hücreleri (BMNC) dikim tarafından aktarılabilir olduğunu gösterdi. Daha açık MDS hücre kökenli anlamak, yaklaşımlar belirli nakli için geliştirdiğimiz, immunophenotypically hematopoetik kümelerinden. Bu makalede, yalıtma ve hematopoetik kök ve progenitör hücre belirli nüfus nakli işlemi açıklanmaktadır. Ekimi nakli verimliliğini ve sebat donör MDS hücre değerlendirmek için yaklaşımları açıklar.

Giriş

Myelodisplastik sendrom (MDS) klonal kan bozuklukları etkisiz hematopoiesis, displazi morfolojik kanıtı ve akut miyeloid lösemi (AML)1,2 için dönüştürme için bir eğilimi ile karakterize olan çeşitli bir dizi temsil ,3,4. Etkisiz hematopoiesis bir olgunlaşma durması kemik iliği ve periferik kan cytopenias bir hiperhücre kemik iliği1,3rağmen sonuçlarında kabul edilmektedir. MDS insidansı değişik Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 100.000 kişi başına 2-12 vaka olarak tahmin edilmektedir ve bu yaşlanma ABD nüfusunun3verilen anlamak için önemli bir koşulu yapma yaş ile MDS insidansı artar, 5. MDS vakalarının çoğu etiyoloji yok olsa da, bazı durumlarda MDS, benzen ve kanser kemoterapi6gibi maddeleri de dahil olmak üzere bilinen genotoksik acentelere maruz olduğu düşünülür.

MDS hastalar genellikle MDS hücreleri7' deki mutasyonlar elde etti. Nispeten nadir olsa da, MDS hasta sayısı NUP98, EVI1, RUNX1 ve MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) gibi genleri içeren dengeli kromozomal translokasyonlar elde etti. Bizim Laboratuvar NUP98 gene8dahil kromozom translokasyonlar uzun zamandır devam eden bir ilgisi yok. Transgenik fareler bir NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene Vav1 düzenleyici tarafından düzenlenmekte ve artırıcı unsurlar MDS, periferik kan cytopenias, morfolojik kanıt displazi ve AML9 için dönüştürme de dahil olmak üzere temel özellikleri listeler bu hızlı .

MDS 60 yıl10için tanınan ve bir klonal kök hücre bozukluk olarak kabul rağmen MDS hücreler kötü11engraft çünkü insan MDS hücre immünyetmezligi farelerde engraft çabaları büyük ölçüde başarısız sağlanmıştır, 12,13,14 ve fareler klinik hastalık geliştirmek değil. Hangi hematopoetik hücrelerin MDS iletebilir tanımlamak için bir çaba NHD13 modeli için açık ve tüm insan MDS, periferik kan cytopenias, dahil olmak üzere temel özelliklerini gösterdi bir hastalık varlık olarak MDS engraft gösterdi displazi, ve AML15' e dönüştürme. Bu raporda, biz bir çaba MDS başlatılıyor hücrelerini tanımlamak için yaklaşımlar daha da hematopoetik kök ve öncü hücreleri (HSPC), fractionate yanı sıra bu deneyler teknik ayrıntılarını mevcut.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu makalede açıklanan hayvan yordamlar Bethesda hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından kabul edildi ve insana ilişkin bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, halk sağlığı hizmet politikası içinde bulunan ilkelerine uygun Hayvan hakları yasası ve Care and Use of Laboratory Animals için kılavuz.

1. hücre hazırlık

  1. Hasat kemik iliği çekirdekli hücre (BMNC)
    1. Sadece steril malzemeler kullanın. Bir Buhar Otoklav kullanarak yeniden kullanılabilir aletleri sterilize. İğneler, şırınga ve tek kişi kullanımlı steril kaplar içinde plastik eşya satın alabilirsiniz. Tüm hayvan ve hücre uygulamaları bir sınıf II, tip A2 biyolojik güvenlik kabini gerçekleştirin.
    2. BMNCs 14 mL yuvarlak HF2 3 mL içeren alt Tüp hazırlayın (Hank'in dengeli tuz solüsyonu % 2 fetal Sığır serum ile desteklenmiş).
    3. Donör fareler (CD45 alleli CD45.2 için pozitif), tipik olarak 2-6 ay, Yaş C57Bl6 CO2 odası kullanarak ötenazi.
    4. Fare leşi % 70 etanol tüm vücut üzerinde bir sprey şişesinde ile püskürtülerek sterilize. Bacaklar, leğen kemiği aşağı ayak bileği dan cilt soyma.
    5. Femora ve tibiae steril makas (düz, keskin/keskin, 11,5 cm) ve forseps (Graefe, tırtıklı, 0,8 mm uç genişliği) kullanarak karkas kaldırın. Ekli kasları açıkça kırpın.
    6. Tibia proksimal ve distal ucunun makasla kesme. Tibia forseps ile tutarak, HF2 2.5 mL (ayak bileği) tibia distal ucunda tibial kemik iliği kavite içine içeren bir 27'lik 3 mL şırınga yerleştirin. Floş 14 mL hafif basınç kullanarak tibia kemik iliği hücrelerinden alt tüp yuvarlak.
      1. Diğer tibia için yineleyin.
    7. Uyluk kemiği proksimal ve distal ucunun makasla kesme. Distal uyluk kemiği iliği kavite sonuna HF2 2.5 mL içeren ve şırınga için hafif basınç uygulayarak 3 mL şırınga floş bir 20'lik iğne ekleyerek uyluk kemiği iliği boşluğuna bağlı.
      1. Her iki tibiae tüm kemik iliği toplama diğer uyluk için yineleyin ve alt tüp femora aynı 14 ml Yuvarlak.
    8. İliği kitle yukarı ve aşağı birkaç kez 3 mL şırınga bağlı aynı 20'lik iğne ile alıyorum tarafından dağıtmak.
  2. BMNC antikor boyama
    1. Kont BMNC. 1.1.8. adımda oluşturulan BMNC süspansiyon 20 µL 20 µL %3 asetik asit çözüm ekleyin. O zaman, bir hemasitometre ve ters bir mikroskop kullanarak sayılır.
    2. 450 x g 4 ° C'de 5 min için de nazik Santrifüjü tarafından BMNC cips 90 µL başına 107 hücre kullanarak Pelet HF2 ile resuspend ve biotinylated Anti-lineage antikor kokteyl 10 µL hücre süspansiyon için ekleyin.
    3. 4 ° C'de 20 dk için kuluçka sonra fosfat tamponlu tuz (PBS) 3 mL lekeli hücrelerle yıkayın.
    4. HF2 100 µL başına 107 hücreleri ile BMNC resuspend. Allophycocyanin (APC) 2 µL Anti-biotin antikor kuluçka için 20 dk 4 ° C'de ve ardından hücre süspansiyon için Birleşik ekleyin.
    5. PBS 3 mL ile lekeli BMNC durulama ve 0.2 µg/mL propidium iyodür (PI) akış sitometresi hücre sıralama ile takıma HF2 ile BMNC resuspend.
  3. Akış Sitometresi hücre BMNC sıralama.
    1. Akış Sitometresi hücre sıralayıcısı kalibre. Tüm photomultiplier tüp (PMTs), dağılım ve floresan parametreleri günahı hücreleri kullanarak optimize etmek ve her dedektör doğrusal Aralık içinde ayarlayın.
    2. Hazırlamak günahı, PI lekeli ve APC soy adım 1.2 paralel kokteyl hücreleri etiketli. Spektral tazminat için analiz.
    3. FSC-H vs SSC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H ve 640-SSC-w 640-SSC-S vs sıralı çoğunluğuna göre eş hücreler ayırımcılık
    4. Nonviable hücreleri 561 nm ve 614/20 bant geçiren filtresi ile toplanan emisyon PI heyecan kullanarak hariç. Lineage 640 nm ve toplamak emisyon hücreleri 671/30 bant geçiren filtresi ile etiketli APC heyecanlandırmak.
    5. Floresans değerlerini gerilim yükseklik kaydedin ve liste modu veri dosyalarında sıralanması için nüfus görselleştirmek için en az 100.000 olayları toplamak.
    6. Aşağıdakiler için 10.000 hücre üç örnek alınıyor sonra spektral tazminat hesaplama: hücreler, hücre etiketli PI ve anti-lineage antikor kokteyl hücreleri etiketli APC ile Birleşik etiketsiz.
    7. Lineage negatif (LN), soy pozitif (LP) loş floresan yoğunluğu (LP1) ve LP nüfus ile parlak floresan (LP2) 0.5 mL % 10 FBS medya içeren 5 mL tüpler içine ile sıralamak için üç bölgeye ayarlayın.
    8. Bir damla kullanarak sıralama hücreleri örtmek ve iptal modu arındırmak.
    9. Post sıralama Analizi 1.000 toplam hücreleri ile saflık ve sıralanmış hücre canlılığı onaylamak için sıralanmış örnekleri üzerinde gerçekleştirin.
    10. Santrifüjü 450 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından sıralanmış hücreleri toplamak ve hücre Pelet HF2 0.5 mL ile resuspend.
    11. Sıralanan hücre hemasitometre ve Trypan mavi onaylayın. Cep numarasını HF2 ile nakli için ayarlayın.
      Not: BMNC nüfusun geniş bir spektrum 1.2.2 yukarıdaki adımda fluorochrome Birleşik antikorlar ek bileşimlerini kullanarak nakli için ayrılmış olabilir.

2. alıcı fareler hazırlık ve hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HKHT)

  1. Organ nakli alıcılar hazırlanması
    1. Veteriner ve Hayvancılık congenic alıcı farelerde (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) belirli patojen ücretsiz (SPF) hayvan tesis bakım korumak.
    2. Profilaktik dekontaminasyon gastrointestinal parça için öldürücü doz (9 Gy) ışınlama önce 7 gün 100 mg/L Siprofloksasin alıcılara içeren steril su sağlamak ve 14 gün boyunca ışınlama takip korumak.
    3. Cs kaynak ölümcül doz (9 Gy) ışınlama aşağıdaki gibi sağlar. Eğitimli, sertifikalı Cs işlecini kullanın. 70 cGy/min Toplam vücut gama ışınlama teslim etmek için Cs kaynak aleti ayarla. 10 fareler bir özel tasarlanmış sahibi ve tutucu irradiator odanın içine yerleştirin. 13 dk 9 Gy tüm vücuda radyasyon vermeliyiz teslim ve fareler için onların kafes dönmek.
  2. Hematopoetik kök hücre transplantasyonu
    1. Vahşi türü (WT) BMNC bir congenic alıcı fare (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) fare ile 2 ile 5 x 10 başına 2 x 105 hücre hücre doz, üzerinden4 hücreleri BMNC hazırlanan arıtılmış test akış sitometresi yukarıda açıklandığı 1.3 sıralama ile karıştırın. Aynı şırınga hücrelerde karıştırın.
      Not: WT BMNC bir radyasyon tutumlu etkisi için alıcı fare sağlamak ve test hücreleri hematopoiesis desteklemiyorsa alıcı fare hayatta kalmak için izin verir. WT BMNC böyle bir deney CD45.1 alleli hızlı kullanılan ve böylece CD45.1 ve CD45.2 arasında ayırımcılık antikorları kullanarak test hücrelerden ayırt edici olabilir. WT BM hücreleri "yardımcı hücreleri", "radyasyon tutumlu hücreleri" ya da "rakip hücreleri" olarak adlandırılır.
    2. Hücre karışımı sesi enjeksiyon kolaylaştırmak için steril HF2 kullanan alıcı başına 200 µL için ayarlayın.
    3. 1 mL şırınga ve radyoterapi 24 h içinde 28'lik iğne kullanarak öğrenirim radyasyonlu alıcı fare ile intravenöz kuyruk ven enjeksiyon için hücre karışımları nakli. Isı ven dilatasyon kuyruk yol açar gibi fare kuyruk a ısı lamba altında yerleştirin.
      Not: alıcı fareyi çalışma sonunda ötenazi ve hastalık ilerleme Nekropsi, Histoloji ve akış sitometresi değerlendirmek.

3. engraftment tahlil akış sitometresi kullanarak

  1. Donör hücre engraftment değerlendirmek için 6 hafta, 12 hafta ve 16 hafta sonra nakli alıcı fareler periferik kan (PB) toplamak.
  2. Fare bir restrainer yerleştirin ve yaklaşık 1 dakika için ısı lamba ile alıcı içinde belgili tanımlık kafes sıcak.
  3. Kuyruk ven bir neşter (bıçak 10, #3 bistüri sapı) ile kesme ve PB 100 µL EDTA bir antikoagülan olarak içeren bir microcapillary tüp kullanan alıcı başına toplamak.
  4. Toplanan PB iki eşit aliquots bir steril microcentrifuge tüp içinde 50 µL yerleştirerek bölün. (Ncı histopatoloji özünde yapılır) bir aliquot için bir otomatik tam kan sayımı (CBC) kullanın ve ikinci aliquot antikor boyama için kullanın ve akış sitometresi.
  5. Akış Sitometresi tarafından donör engraftment algılamak için toplanan PB 50 µL için 1 mL hipotonik RBC lizis arabelleği (NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0,037 g/L Na2EDTA, pH 7.2 8.29 g/L) ekleyerek kırmızı kan hücreleri (RBC) koşullar. Girdap karışımı ve oda sıcaklığında 10 dk kuluçkaya örnek.
  6. İçin 1,5 dk. dikkatle süpernatant Aspire edin ve 4,600 x g de lysed PB santrifüj kapasitesi.
  7. Kısmen hücre Pelet hafifçe dokunarak veya "tüp alt flicking" bozabilir. PBS 1.3 mL Pelet içine tüp ve 1,5 dakika süreyle santrifüj 4.600 x g de dikkatle aspiratı ve atma süpernatant yer alan ekleyin.
  8. Hücre Pelet dokunarak veya flicking bozabilir ve 200 µL % 5 fare serum için hücre Pelet ile takıma HF2 ekleyin.
  9. Anti-CD45.2 antikor (1 µL) ile allophycocyanin (APC) hücre süspansiyon için Birleşik ekleyin. En az 30 dakika ve kısaca girdap karışımı için 4 ° C'de kuluçkaya.
  10. Boyama sonra iki kez yukarıda açıklandığı gibi hücreleri yıkama ve 1 µg/mL ile PI takıma HF2 400 µL ile resuspend.
  11. 4-renkli akış sitometresi kullanarak engraftment bulmak. B veya T lenfositler gibi belirli hücre türlerini algılamak için ek antikorlar ekleyerek periferik kan içinde hücre türleri hakkında daha fazla bilgi edinin.
  12. Daha fazla veri analiz için izin vermek için bir forma sayfasını kullanarak seri engraftment verilerini kaydeder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz çeşitli deneylerin sonuçlarını temsilcisi rakamlarını gösterir. Şekil 1 deney sıralama bir temsilcisi akış sitometresi gösterir. Normal hematopoetik farklılaşma sırasında hücreleri belirli bir hematopoetik soy kararlı olmak gibi onlar hücre yüzey işaretleyicileri lineage tanımlama elde etmek ve kendini yenileme için potansiyel kaybedersiniz. Bu nedenle, vahşi tipi fareler, kök hücre kendini yenileme soy-negatif BMNC için sınırlı olduğunu. Bu deneyde, soy-...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MDS bir klonal hematopoetik kök hücre bozukluğu olmasına rağmen MDS "kök" veya Başlatan hücreleri, değil henüz karakterize. Biz daha önce MDS transplantable kemik iliği NHD13 fareler HKHT, makrositer anemi, lökopeni, nötropeni ve morfolojik displazi15kanıtı ile karakterize tarafından kullanarak WT farelere olabilir gösterdi. Buna ek olarak, rekabetçi repopulation deneyleri NHD13 MDS kemik iliği hücrelerinden büyüme avantajı tespit edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular bir MDS kök veya ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

İfşa etmek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir (vermek numaraları ZIA SC 010378 ve M.Ö. 010983) Sağlık Ulusal Enstitüsü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL yuvarlak tabanlı tüpFalcon352057
Hank'in dengeli tuz çözeltisiLonza10-527F
Anti-CD45.2 antikoruSouthern Biotech1800-15LOT # A077-T044O
3 mL ŞırıngaMonoject8881513934
27-G iğneBD305109
20-G iğneBD
Soy KokteyliMiltenyi130-090-858LOT # 5170418221
Anti-Biyotin antikorlarıMiltenyi130-113-288LOT #
5171109046 1 mL ŞırıngaExcelint26027İnsülin Şırınga
Isıtma LambasıThermo Fisher ScientificE70001901
FACS makinesiCytecFACScan2 lazerler, 5 renk dedektörü
FACS sıralama aleti BeckmanCoulterMOFLO ASTRIOS5 lazer, 23 parametre, 6 popülasyon aynı anda sıralama
Propidyum İyodürThermo Fisher ScientificP3566
Gama IşınlayıcıEn İyi TheratronicsGammacell 40
Kan alma tüpüRAM scientific76011
Alıcı farelerCharles RiverB6-LY5.1 / Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 farelern/aC57Bl / 6, CD45.2NIH 5 mL'de tutulan koloni
yuvarlak tabanlı tüpFalcon352058
305176

Kaynaklar

  1. Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
  2. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
  3. Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
  4. Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
  5. Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
  6. Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
  7. Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
  8. Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
  9. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  10. Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
  11. Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
  12. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
  13. Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
  14. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  15. Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
  16. Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  17. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  18. Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kemik li i ekirdekli H creleriAk SitometrisiT m V cut I nlamasH cre Ay klamaAdaptif TransferCD45 2 Mark rLineage Negatif H crelerPeriferik Kan Analizi
Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.