$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır. Tüm katılımcılar Yazılı onam alındı ve kan ve lenf nodu (IRB #809316, IRB # 815056) Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulunun onayı ile satın alınan. Tüm insan denekler yetişkindi. Kordon kan örnekleri nazikçe işçi ve kadın Doğum bölümü & Thomas Jefferson Üniversitesi'nde kadın hastalıkları teslim tarafından temin edilmiştir. Tüm örneklerini de-tespit edildi.
1. yalıtım CD4+ T hücreleri bir görüntü analizi için
-
107 dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya lenf nodu mononükleer hücreler (LNMCs) toplanan örnekleri içeren 1 mL aliquot çözülme. Steril bir başlık, penisilin/streptomisin ve glutamin ile RPMI 9 mL çözdürülen hücreleri ekleyin.
- Centrifugate 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için hücreleri süpernatant Aspire edin ve 5 mL ilave RPMI % 10 içeren hücrelerde resuspend FBS (tam orta). CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya
- Ertesi gün, CD4 arındırmak+ T hücreleri tarafından olumsuz immunomagnetic üreticinin yönerge göre piyasada bulunan bir seti kullanarak sıralama.
- Taze arıtılmış CD4 sayısı ölçmek için+ T hücreleri, hücre süspansiyon 5 µL bir trypan mavi çözüm eşit bir hacmi ile karıştırın. Bir hemasitometre hücre trypan ile yük mavi karışımı ve hemasitometre 5 bölümlerini içinde canlı hücreleri saymak.
- Hücre sayı ortalamasını almak ve özgün hücre süspansiyon hücre sayısı belirlemek: hücreler/1 mL sayısı = x 2 x 104ortalama sayısı. İzole hücre toplam sayısı çok küçük ise, hücre sayım olmadan olduğu gibi kullanın.
- Hücreleri vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve onları arabellekte bir tahlil (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2ve % 1 insan serum albümin) 105 resuspend < /C13 > hücreler/50 µL veya daha az ve hücreleri (için 1-2 h) 4 ° C'de deneylerde kullanıma hazır kadar tutun.
- Tüm biyolojik atık ilgili kurumsal yönergelere uygun bir biçimde atın.
- Denetimi hücre nüfus isterseniz, kordon kanı PBMC aktif CD8 T hücrelerden hazırlamak, 5 mL anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları 10 µg/mL ve 1 µg/mL karışımı ile kaplı bir T25 kültür şişesi tam orta de 107 hücreleri yer , sırasıyla.
- Ertesi gün, aktif kordon kanı hücreleri balonun kaldırmak için onları yıkamak ile taze 1 x tamamlamak orta ve rekombinant IL-2 huzurunda hücreleri genişletin (100 U/mL) 2 hafta boyunca.
- Kordon kanı CD8 arındırmak+ T hücreleri üreticinin yönerge göre piyasada bulunan kit kullanarak negatif immunomagnetic sıralayarak. Hücreleri saymak ve tahlil arabellek medyaya LN ve PB CD8 için 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi döviz+ T hücreleri.
2. düzlemsel Lipid Bilayers hazırlanması için bileşenler
- Başka bir yerde5açıklandığı gibi lipozomlar 3 tür hazırlamak: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) lipozomlar, (b) 0.4 mM DOPC lipozomlar 33 mol % köpekler-NTA içeren (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic asit) succinyl] (amonyum tuz)) lipidler, 4 mol % Biotinyl-Cap-PE içeren (c) 0.4 mM DOPC lipozomlar (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(kap biotinyl) (sodyum tuzu)).
-
%5 kazein çözüm yukarıda açıklanan5olarak hazırlayın.
- 5 g kazein tozu Ultrasaf Su 100 ml dağıtılması ve 10 M sodyum hidroksit 350 µL ekleyin. Her şey üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında 2 h için kullanılabilir ölçeğine göre yavaş hızda karıştırın ve sonra 4 ° C'de gece 7.3 ve ultracentrifuge 100.000 x g 4 ° C'de 2 h için çözüm pH ayarlama Süpernatant 0,22 µm steril filtre ile filtre ve çözüm aliquots-80 ° C'de depolayın
Dikkat: Sodyum hidroksit çözüm kimyasal yanıklara neden ve gözlerle temas üzerine kalıcı körlüğe neden olabilir. Lastik eldiven, Emanet giyim ve göz koruması bu kimyasal ya da çözümleri işlerken kullanır.
-
Etiket anti-CD3 antikor ile mono-bionylated antikor molekülleri ile yukarıda açıklanan yaklaşım8üretmek için biotin.
- Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 mg/mL, Biotin-PEO4-NHS çözeltilerine hazırlayın. Antikor fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 mM sodyum bikarbonat içeren 0.5 ml 1 mg Biotin-PEO4-NHS çözüm 3.7 µL ekleyin.
- Karışımı oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. Alexa Fluor 488 NHS ester adlı 10 mg/mL DMSO çözeltisi hazırlamak. Alexa Fluor 488 NHS ester çözüm Biotin-PEO4-NHS tarafından 10 kat molar aşırı etiketli antikor ekleyin.
- Karışımı yavaş karıştırma üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İlişkisiz boya boyutu-dışlama Kromatografi kullanarak ayırın.
- 280, antikor çözümün optik yoğunluk ölçerek antikor konsantrasyonu belirlemek nm (bir280). 577, etiketli antikorlar optik yoğunluğunu ölçmek nm (bir577).
- Boya antikor oranı aşağıdaki denklemi kullanarak belirleyin:
Not: ek ayrıntılar üreticinin iletişim kuralı'nda bulabilirsiniz.
-
Rekombinant çözünür ICAM-1 protein3,4,9,10daha önce açıklandığı gibi bir Drosophila ifade sisteminde hızlı.
- Klon cDNA kodlama ile ICAM-1 ectodomain içine Drosophila ifade vektör DEVRESEL_ÖDEME/V5-O'nun bir His ile eklenmiş bir Rekombinant protein üretmek için bir indüklenebilir metallothionein organizatörü ile6 etiketi C-terminal ucunda.
- S2 hücreleri elde edilen ICAM-1 içeren plazmid ve G418 ifade vektör Co transfect. Kararlı transfectants % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve 0,5 mg/mL G418 ile 3 hafta boyunca takıma Schneider'ın Drosophila medya kullanarak seçin. Serum içermeyen böcek orta hücrelerde genişletin ve bir protein ifade ile 0,5 mM CuSO4 3 d için teşvik.
- Kültür süpernatant 10 x konsantre ve PBS üzerinden karşı teğet akışı yoğunlaştırıcı yukarıda açıklanan11olarak diyaliz.
- Süpernatant konsantre kültür Sepharose ile kovalent immobilize bir anti-ICAM-1 monoklonal antikor içeren bir sütun için geçerli ve ilişkili ICAM-1 50 mM glisin arabelleği, pH 3.0 ile elute. Hemen eluted ICAM-1 protein 2 M Tris arabelleği, pH 8.0 ile etkisiz hale getirin.
- PBS, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz ve bir sütun içeren Ni-NTA özel diyaliz malzeme ekleyin. Çözünür ICAM-1 200 mM imidazole, pH 8.0 ile elute. PBS arabellek, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz.
- Arıtılmış ICAM-1 Cy5 NHS ester göre üreticinin yönerge ile etiketleyin.
Not: En iyi son boya protein oranı 1: 1'dir.
- Fab üretmek papain sindirim tarafından bir anti-CD107a antikor parçaları ve Fab arındırmak parçaları3daha önce açıklandığı gibi İyon Kromatografi tarafından. Etiket Alexa Fluor 568 NHS ester göre üreticinin yönerge ile Fab parçaları.
3. düzlemsel Lipid Cam destekli Bilayers oluşumu
- Bir taze asidik piranha çözüm 140 mL konsantre sülfürik asit ve % 30 hidrojen peroksit 60 mL karıştırarak hazırlayın. Cam coverslips akışı slaytlar için onları 30 dk. tutun asit piranha çözümde cam coverslip Polipropilen makas tipi forseps ile ıslatarak yıkayın.
Dikkat: Son derece güçlü bir oksitleyici Piranha çözümdür. Aşınma koruyucu gözlük ya da gözlük ya da kalın lastik eldiven ile birlikte tam yüz bir kalkan çözüm işleme sırasında her zaman unutmayın. Piranha çözüm bir duman başlık altında sadece çalışmak. Patlayabilir o olabilir gibi Isıtma, taşıma veya herhangi bir anında kullanım, sallıyorum kaçının. Piranha atık kurşun içeren çukur bir cam şişe içine toplamak. Kurumsal Güvenlik Komitesi uygun atık kullanımı hakkında başvurun.
-
Yıkanmış coverslips 7 durulama taze su içeren şişeler sırayla aktarmadan tarafından Ultrasaf Su ile x. Su kalan izin vermek bir yana coverslips ıslak kuru cam geride bırakarak temiz cam kapalı rulo seti.
- Alternatif olarak, bir vakum pompa bağlı bir pipet ucu dikkatle kalan su damlacıkları coverslips kaldırmak için kullanın.
- Steril başlık, lipozom mix bilayers yapmak için üretmek için çeşitli lipitler dilutions gerçekleştirin. İlk olarak, DOPC lipozomlar 37 µL ve Biotinyl-Cap-PE lipozomlar 3 µL birleştirir. İkinci olarak, DOPC lipozomlar 14 µL ve köpekler-NTA lipozomlar 15 µL karıştırın. Üçüncü olarak, ilk Mix 1 µL son lipozom karışımı imal etmek ikinci mix 29 µL için ekleyin.
-
Steril başlık, bir çalışma alanı tarafından kuru coverslips yakın ile ayarlayın. Aliquot 2 µL son lipozom karışımı (bkz. Adım 3.3) tam olarak kendinden yapışkanlı slayt kanal merkezinde. Hemen ve çok hassas bir temiz ve kuru coverslip slayt ile hizalayın ve slayt yapışkan tarafındaki coverslip yavaşça indirin.
- Birden fazla slayt hazırlama, iş bir slayt üzerinde teker teker beri lipozom karışımı hızla buharlaşır. Slayt çevirin ve polipropilen makas tipi forseps dış halkasındaki kaydıraklı, slip kaçağı önlemek için slayda sıkıca bağlı olduğundan emin yapma coverslip periferik kişiye hafif bir basınç uygulamak için kullanın.
Not: kırılma veya coverslip çatlama önlemek için slayt kanalları karşı basın değil.
- Slayt üzerinde yeniden açın ve derleme dış slayt tarafındaki bilayer çevresinde kalıcı bir kalem ile çizim 4 nokta tarafından bir damla coverslip ve kanal slayt arasında gibi görünüyor kurulan bilayer konumunu işaretleyin.
- Kanal içine ilk enjeksiyon bir sıvı önce kanalın bir bağlantı noktası giriş bağlantı noktası diğer çıkış bağlantı noktası olarak atayın ve bu atama deneme boyunca korumak.
- Kabarcıklar oluşturan önlemek için doğrudan kanal giriş liman damlalıklı ucu ucunu bağlayın. Yavaş yavaş slayt kanalları sıcak 50 µL ile doldurun (en azından oda sıcaklığı) tahlil arabellek (bkz. Adım 1.5 arabellek oluşturma için).
- 0, 5 M nickel(II) klorür çözüm hazırlamak. 2 mL aliquot su banyosu için 30 dk 37 ° C'de çözümde kazein, çözülme ve bir nikel klorür çözüme 200 µM son bir konsantrasyon ile ek.
- Bilayers ilk kanal giriş limanında kazein çözeltinin 100 µL enjekte ve sonra hemen dışarı slayt çıkış noktasındaki 100 µL pipetting tarafından kaldırarak yıkayın. Aynı çözüm ile bilayers 100 µL kazein çözümün her kanal giriş portuna enjekte ve slayt için 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka engelleyin.
- Aliquots Cy5-ICAM-1-O'nun6 ve streptavidin proteinlerin çözülme. 2 µg/mL her son konsantrasyonu, tahlil arabellekte proteinleri birleştirir. Belgili tanımlık eriyik için 20.000 x g ve herhangi bir toplamları kaldırmak için 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.
- Engelleme çözüm geri kalanı pipetting tarafından slayt kanal çıkış bağlantı noktasından çıkarın. 100 µL ICAM-1 ve streptavidin giriş portuna içeren çözüm enjekte.
- Slayt 45 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x ilk kanal giriş limanında tahlil tamponunun 100 µL enjekte ve sonra hemen çıkış bağlantı noktası dışında 100 µL kaldırarak.
- Alexa-Fluor-488-etiketli bir anti-CD3 antikor tahlil arabelleği için 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile sulandırmak. Antikor çözeltinin 100 µL slayt giriş portuna enjekte ve oda sıcaklığında 45 dk için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x 100 µL olduğu gibi adım 3.11 tahlil arabelleği ile.
4. düzlemsel Bilayer ile T hücreleri etkileşim görüntüleme
-
Sahne ve confocal veya toplam iç yansıma (TIRF) Floresan mikroskop amacı sıcaklığı 37 ° C'de equilibrated kadar onceden Bilayer(s) slaytla ısıtmalı sahnede ayarlayın. Sahne mürekkep işaretleri göre uygun bir konuma taşımak ve floresan Cy etiketli ICAM-1 moleküllerin istihdam bilayer odaklan.
- 61 X amaç confocal mikroskop için veya 100 X amaç TIRF mikroskopla uygun filtre ayarlarını kullanın.
-
Granül için görüntüleme TIRF mikroskobu tarafından serbest, Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a eklemek için 4 µg/mL giriş noktalarına hücreleri enjekte önce son bir konsantrasyon, hücre süspansiyon parçaları antikor Fab.
- Hazırlanan CD4 resuspend+ T hücreleri izole LN veya PB veya kordon kan ve hücre süspansiyon 50 µL bilayer içeren slayt kanalı giriş bağlantı noktası enjekte.
- Alanları istediğiniz sayıda ve kayıt görüntüleri her alanının 1 x 30 dk için her 2 dk sonra enjeksiyon seçin.
- Alan parlak, yansıyan ışık ve floresan kanal (Alexa 488 ve Cy5) görüntüleri elde etmek için confocal mikroskop yararlanmak. Alexa-Fluor-488 ve Alexa-Fluor-568 floresans ve widefield Cy5 floresan, hem de TIRF mikroskop üzerinde parlak alan görüntüleme için TIRF modunu kullanın.
5. görüntü analizi
- Uygun yazılımı kullanarak alınan görüntüleri analiz. Hücre morfolojisi iletilen ışık görüntü, kümelenmiş ve gözle görülür hasar dışlama veya analiz apoptotik hücreler içinde gözlemlemek. Analizde sadece üretken bilayer yüzey (Örneğin, Alexa-Fluor-488 Floresan (anti-CD3 antikor) arayüz biriken hücreler) ile etkileşim hücreler içerir.
- 20 dk hücre adezyon alanının boyutu hücre bilayer etkileşim başlandıktan sonra belirleyin.
Not: Parazit yansıması mikroskobu (IRM) resim hücre bilayer arabirimde geliştirilen karanlık alan yapışma alandır.
- Cy5-ICAM-1 floresans herhangi bir birikimi ve yüzük kavşak bir oluşum tarafından ayrılmış Cy-ICAM-1 moleküller hücre bilayer arayüz gözlemlemek. Birikmiş ICAM-1 molekülleri bir yapışma halkası kavşak en az iki ardışık görüntülerde oluşan isterseniz bu tür hücrelerin periferik supramolecular aktive küme (pSMAC)12gelişmekte olan hücreler olarak belirleyin.
- Granül sürümü hücre yakın temas bölgesinin dışında arka plan floresans üzerinde T hücre bilayer arabirimi Alexa-Fluor-568 floresans yoğunlukta ölçerek değerlendirin. Alexa-Fluor-568 sinyal-için-arka plan en az 1,3 oranında hücreleri degranulating hücreler olarak belirleyin.