Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Özet

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Özet

Tümör hücrelerinin tümör progresyon farklı noktalarda ayırmak zordur. Biz tümör hücreleri doğal bir matris ile etkileşim ve besin sürekli akışı gösterebilir bir ex vivo akciğer modeli, hem de tümör hücreleri normal hücresel bileşenleri ile etkileşim ve doğal bir matris gösterir bir model oluşturdu. Acellular ex vivo akciğer modeli bir sıçan kalp-akciğer bloğu izole edip decellularization işlemini kullanarak tüm hücreleri çıkarmadan oluşturulur. Sağ ana bronş kapalı bağladılar ve tümör hücreleri borusunda bir şırınga tarafından yerleştirilir. Hücreleri taşımak ve sol akciğer doldurmak. Akciğer sonra nerede bir kapalı devre içinde sürekli bir akış medya, pulmoner arter alır bir biyoreaktör yerleştirilir. Sol akciğer yetiştirilen birincil tümör tümördür. Dolaşımdaki medyada izole tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan vardır ve sağ akciğer tümör hücrelerinde metastatik lezyonlar vardır. Hücresel ex vivo akciğer modeli decellularization işleminin atlayarak oluşturulur. Her model farklı araştırma soruları cevaplamak için kullanabilirsiniz.

Giriş

Kanser metastaz çoğu kanser ölümler arkasında suçlu olduğunu ve son meydan kanser mücadele çalışmalarında teşkil etmektedir. Bu yöntem genel amacı yanı sıra üç boyutlu (3-b) hücre büyüme akışının bir boyut olan bir dört boyutlu (4 D) hücre kültürü için bir protokol tasarlamaktır. Metastaz işlemi [yani, tümör hücreleri (CTCs) ve metastatik lezyonlar dolaşan birincil tümörün] üç farklı aşamalarında temsil eder.

Son üç yılda dünya çapında bilim geliştirilmiş bir tedavi mi, yoksa ilerleme-Alerjik yaşam beklentisi farklı kanser metastatik ilerlemesinde temel mekanizmaları anlamak için bilgi benzersiz bir zenginlik vermiştir. Meme kanseri gibi bazı kanser türleri klinik yönetiminin¹önemli ölçüde geliştirilmiş; Ancak, akciğer kanseri gibi bazı kanser türleri hala zavallı hayatta kalma²var. Vitro ve in vivo hayvan modelleri yeni görüşler hastalık gelişimi destekleyecek mekanizmalar oluşturmak için vesile olmuştur. Son birkaç yıl içinde xenografts (CDX) satır elde edilen hücre ve hasta elde edilen xenografts (PDX) birincil insan tümör³, büyüme kinetik gibi birçok ilgili özellikleri histolojik özellikleri, davranış korumak gibi daha fazla ilgi olmuştur özellikleri ve tedaviye yanıt. Ancak, her model CTC oluşumu ve metastaz uzak organ^4,5,6mekanizmasını anlamak için kendi sınırlamaları vardır.

Son zamanlarda, organ yeniden yapılanma ve perfüzyon tabanlı hücre kültürü kavramı kullanarak bir 4-D ex vivo akciğer kanseri modeli geliştirdik. Zaman içinde kanser salgılanan benzer bir insanla büyümek perfusable tümör nodüller oluşturarak insan akciğer kanser büyüme taklit eden protein üretim⁷. Kanserli hastalarda zavallı hayatta kalma öngörür ve ayrıca sisplatin tedavisi^8,9üzerine tümör regresyon tarafından tedavi edici bir yanıt gösteren gen ifade imza temsil eder. Metastatik lezyonlar oluşturabilir böylece akciğer modeli daha da güncellenmiştir. CTCs birincil tümör ve intravasate damarlara geliştirmek ve metastatik lezyonlar¹⁰kurmaya kontralateral akciğer extravasate. Gen ifadesi çalışmaları birincil tümör, CTCs ve metastatik lezyonlar farklı ifade profil ve fenotip¹⁰için gerekli genler alt kümesini upregulation öneririm. Kanserli hastalarda görülen biyolojik koşulların varlığı nedeniyle metastatik bu işlem gerçekleşir. Bu modelin avantajı, doğal bir matris ve mimari varlığı ve tümör nodüller oluşumuna yol açar bir perfüzyon besin olduğunu. Buna ek olarak, aynı zamanda farklı bileşenleri tümör microenvironment veya uyuşturucu etkileri, tümör gelişimi zaman içinde çalışma olanağı sağlar. Bu model bir Aralık kanser hücrelerinin (akciğer kanseri, meme kanseri, sarkom vb) bir laboratuvar kurulumu büyümeye kullanılabilir.

Protokol

Hayvan deneyleri protokollerde kurumsal hayvan bakım ve Houston Methodist Araştırma Enstitüsü'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bütün mevzuatı, yasalara, kurallara ve politikaları uygun olarak yürütülmektedir.

1. fare akciğer hasat

1. 4 - için 6-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley rat ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) onun kanadını içinde bir mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi ne zaman hind bacak ayak forseps ile boğumlu bir devamsızlık hareketi için kontrol ederek emin olun.
2. 10 dk sonra göğüs ve karın tıraş ve deri bir klorheksidin bez ile silin.
3. Cilt o forseps ile tespit ve tek kullanımlık neşterle incising kaldırın. Neşter ile incising tarafından göğüs boşluğuna açtıktan sonra ikili torakotomi sol göğüs kafesinin ön tarafında ve diyafram sağ tarafına makasla keserek gerçekleştirin.
   Not: Bu bir hayatta kalma sigara cerrahidir.
4. Göğüs kafesi tutun ve 2 mL heparin (1000 adet/mL) 27 G iğne kullanarak kalbi sağ ventrikül enjekte.
   Not: Bu herhangi bir akciğer kan pıhtı oluşumunu engeller.
5. Tamamen göğüs kafesi makasla çıkarın ve kan çıkana kadar bir 18 G iğne sol ventrikül bir havalandırma yerleştirin. Sonra heparinized fosfat tamponlu tuz (12.5 adet/mL; heparinized PBS) 15 mL 25 G iğne kullanılarak sağ ventrikül enjekte.
6. İnferior ve superior vena kava, kalbin sağ tarafta iki büyük damarları keser ve akciğerler ile 27 G iğne kullanılarak sağ ventrikül heparinized PBS ek bir 10 mL sifonu.
   Not: İnferior vena kava kalbimle büyük bir gemi olarak altında görüntülenir kırmızı kan ile dolu. Benzer şekilde, üstün vena cava kalp üst kısmında büyük bir beden olarak görüntülenir.
7. Trakea tiroid tabanında kesti. Hemiazygos ven ve dalları Aort kemer düzeyinde azalan aort dikkatli bir şekilde çıkarın.
8. Göğüs boşluğuna ve vücudun kalan kısmına sıçan kalp-akciğer bloğundan çıkar.
9. Sağ ve sol ventriküllerin yarısı keserek ventriculotomy gerçekleştirmek ve özel yapım bir doldurulmuş 18 G paslanmaz çelik iğne kanül ile sağ ventrikül ana pulmoner arter (PA) yerleştirin.
10. Kanül ile 2-0 ipek kravat güvenli ve dikkatlice sağ ventrikül ve atrium bulaşmasına neden.
11. Bir kadın radarı bölme içinde sol ventrikül yerleştirin ve 2-0 ipek kravat ile sabitleyin.
12. PA kanül aracılığıyla heparinized PBS kalp-akciğer bloğu ile 20 mL sifonu ve kültür ortamı veya heparinized PBS içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.
    Not: adım biyoreaktör ayarlamak için 3.1 hücresel bir modeli için gidin. Bir acellular modeli için adım 2.1 decellularization için devam edin.

2. akciğer Decellularization

1. Decellularization birim hazırlanması
   1. Her decellularization odası/şişe şişe kapağı iki delik delme ve delik (Şekil 1A ve 1B) bir kadın radarı yakalamaya hazırlayın. Diğer tarafta bir siyah naylon halka ile güvenli. Benzer şekilde, başka bir şişe kapağı intravenöz set eki (Şekil 1 c) için tek bir delik matkap.
      Not: İki farklı taraf aynı şişe kapağıyla Şekil 1A ve 1B vardır. 2.1.1. adımda yukarıda belirtildiği gibi tek bir delik ile farklı bir kap Şekil 1 c olduğunu.
   2. Şişe kapakları (Şekil 1A ve 1B) içinde kadın bir radarı (at pulmoner arter veya PA bitiş) 0.5-inç tüp ve 6 inçlik tüpler (Şekil 1J) ekleyin ve bir erkek radarı kilit biter takın. 500 mL şişe ile kilit decellularization odası/şişe ayarlayın.
   3. Pompa baş (1E rakam ve 1F) bir kadın radarı bir kartuşla (Şekil 1G) tarafından bağlı olduğu pompa tüp (Şekil 1 H), her iki ucunun (hangi erkek radarı kilit ile bağlı) 2 2 ft tüp bir ucunu takın kilit (Şekil 1I).
   4. 2 ft tüpler (2.1.3. adımdaki) her kadın radarı kilit kafasına decellularization odası/şişe kapağı (Şekil 1 L) için diğer ucunu bağlayın.
   5. Ters bir şişe şişe kapağı ve decellularization c bağlı 2 ft tüp yerine distal son eklenen bir intravenöz set (Şekil 1 d) proksimal ucu olan bir stand üzerinde asılı tarafından PBS şişeyle (PBS 200 mL) 250 mL kurmak heparinized hamber/şişe PA sonunda (Şekil 1B). Bu 2 ft tüp atma biberondan bağlayın.
      Not: resim 1 Kiçinde gösterildiği gibi karton, şişeleri ayarlanır. İntravenöz tüpler reaktifler akciğer iskele içinde dağıtmak için asılı şişe çıkması.
2. Akciğer decellularization işlemi
   1. Decellularization odası/şişe içinde serbestçe akar kadar 30 mm Hg (Şekil 1 K) bir fizyolojik perfüzyon basıncı heparinized PBS'yi çalıştırmak ve sonra kalp-akciğer bloğu PA kanül PA sonuna ekleyin.
   2. Herhangi bir aşırı arabellek/çözüm decellularization odası/şişe içinde atılan böylece pompa sürekli olarak çalışır durumda tutun.
   3. PA, perfüzyon basıncı 30 mm Hg (Şekil 1 K) ilk yıkama için 15 dakika ile heparinized PBS'yi çalıştırmak.
   4. Deiyonize su % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) heparinized PBS şişe yerine ve decellularization için 2 h için akciğer sıvı.
   5. Decellularization sonra 15 dk akciğer iskele deiyonize suyla autoclaved su sıvı.
   6. Sonra %1 non-iyonik deterjan 10 dk deiyonize su sıvı.
   7. Decellularization odası/şişe 500 mL autoclaved PBS 1 x antibiyotik (penisilin-streptomisin amfoterisin) ile desteklenmiş asılı akciğer içinde şişe kapağı ile olduğu gibi tutmak yerine.
   8. Ayarlama, decellularization odası pulmoner arter sonuna geri atarak kapsayıcıya bağlı 2 ft tüpü yerleştirmek ve 6 mL/dk (Şekil 1 L) pompa çalıştırmak Intravenous atmak.
   9. Akciğerler için 72 h sıvı ve antibiyotik her 12 h PBS değişen tutmak.
      Not: Acellular akciğer hemen kullanıma hazırdır. İhtiyaç kadar-80 ˚C depolanabilir. Akciğer lobları pembe lekeler veya kan pıhtıları açıkça görüntülenmeyecektir Eğer akciğer atmak. Rastgele DNA ve histopatoloji için test etmek mümkündür. Tam bir acellular akciğer hücreleri ve DNA'ın % 99.9 yıkanması göstermez.
      Not: bir hücresel akciğer modeli ile çalışırken, decellularization atlayın. Hasat akciğer (adım 1) doğrudan biyoreaktör ayarlayabilirsiniz.

3. biyoreaktör Set-up

1. Biyoreaktör şişe ve kurulum için gereken maddeleri hazır olun.
   1. Bir 500 mL şişe kapağı eşit uzaklıkta, üç delik ve bir kadın radarı siyah naylon halkalar (Şekil 2A ve 2B) kullanarak tüm üç delik olarak düzeltin.
      Not: bir ucunu şişenin iç yüzleri ise iki delik radarı kilit yüz dışı sona erer.
   2. 6 pompa Tüp, 2 tüp, Tüp, 1,5 ft Tüp, 2 ft tüp ve 10 ft oxygenator tüp 6 biyoreaktör kesilmiş.
   3. 18 G paslanmaz çelik iğne kesin ve tekrar, trakeal kanül biyouyumlu boruları ile biter takın.
   4. Oxygenator tüp radarı kilit konektörler otoklav bantlar (Şekil 2C) kullanarak bir solenoid hasır üstünde belgili tanımlık etraf ile sarın.
   5. Otoklav yukarıda bahsedilen öğeleri ve UV 10 dakikadır ışık tutun.
2. Normal hücre kültür inkübatör (37 ° C, % 5 CO₂) içinde pompa ile kolayca 500 mL şişe sığdırmak için tepsiler arasındaki uygun aralığı ayarlayın.
3. % 70 etanol pompası çıkarma, sprey ve pompa boru dişi radarı kilit konektörler pompa her iki ucundaki ile bağlayın.
4. Pompa tüp ve biyoreaktör 1,5 ft tüp ile diğer ucunu bir ucunu (çıkış) oxygenator bağlanarak solenoid tel örgü hücre kültür inkübatör içinde sarılı oxygenator ayarlayın.
5. Bir Biyogüvenlik biyoreaktör şişede aseptik koşullar ile kabine ayarlayın.
   1. PA üzerinden akışını denetlemek için kadın yapma biri kafasına bir 3-yönlü stopcock (sarı) eklemek
   2. Tek yönlü stopcock (mavi) başka bir kadın radarı kilit bölme trakea (Şekil 2F) tohum hücre için bağlayın.
   3. 2. Boru dış bağlanmak (beyaz) ve medya dışarı dolaşmaya şişe içine tüp 6. Erkek radarı kilit 2 ft tüp için uygun ve bir kadın radarı lug stil eklemek veya bir şey kaldırmak için erişilebilirlik sağlamak için Tee ekleyebilirsiniz.
   4. Tek yönlü bir stopcock üç yönlü konnektör (kadın radarı lug tarzı Tee) açıklıklar birine iliştirin.
   5. Erkek radarı kilit ve kadın radarı kilit 2 ft tüpler için ekleyin.
   6. RPMI1640 200 mL % 10 FBS ve % 1 antibiyotik hücre kültür (hücre şartının değişir) orta ile ekleyin ve biyoreaktör kuluçka makinesi için transfer. Oxygenator tüp iki açık ucu için (tek yönlü stopcock ve Tee bağlayıcı) kapalı çevrim biyoreaktör sağlamak üzere bağlayın.
6. O hiçbir hava kabarcıkları boru içinde pompa 6 mL/dk içinde hücre kültür kuluçka hücre kültür oxygenator ve tüpler, doldurmak için medya ile önceden çalıştırın.
7. Tüpler ile dolu bir kez medya, stopcock kapatın ve biyoreaktör şişe biyoreaktör şişe her iki ucunda Oksijenatörler keserek kuluçka makinesi kaldırın.
8. Biyoreaktör şişe içinde Biyogüvenlik kabini koymak, Kültür medya stopcock yoluyla geçmek ve akciğer iskele (acellular veya hücresel) PA kanül stopcock erkek radarı Bağlayıcısı aracılığıyla ekleyin.
   Not: Burada (decellularization süreç sonrasında) acellular modeli veya taze hasat kalp-akciğer bloğu kullanmak mümkün (yani, hücresel modeli, o kadar yerli fare hücreleri korur).
9. Kültür medya yoluyla herhangi bir hava kaldırmak ve trakea ipek iplik tarafından trakeal kanül kravat tek yönlü bir stopcock geçmek.
10. Herhangi bir PA ve trakea büküm önlemek emin olun. Yakın biyoreaktör şişe kapağı ile akciğer içinde İskele yapısı ve, tekrar, aseptik biyoreaktör kuluçka makinesi için aktarmak ve 6 mL/dk hızında pompa başlatın.
11. Kültür medya tüm lob şişirilmiş ve iyi durumda (Şekil 2 g) akciğer görünüyor emin olmak 10-15 dk için çalıştırın.

4. metastaz modeli ve hücre tohumlama

Not: Yukarıdaki akciğer modeli için bir birincil tümör büyüme çalışma ile tohum hücre geçin. Akciğer İskele yapısı-İskele (acellular veya hücresel) metastatik modeli için aşağıdaki gibi değiştirin.

1. Biyoreaktör ile akciğer iskele kuluçka makinesi üzerinden çıkar ve biyogüvenlik kabine koymuştum.
2. Nefes borusu yoluyla kültür ortamının 5 mL geçmek ve biyoreaktör kap asarak da açmak için bir radarı kilit şırınga kullanın akciğer İskele yapısı-İskele (Şekil 2F).
3. Bu adımda, bir kişi daha akciğer değişiklik metastatik manken için yardımcı olmak için gereklidir.
4. İpek 2-0 açısal forseps trakea geçmekle çatallanma noktada yapmak için kullanın ve hazır olsun.
5. Sağ akciğer çatallanma noktada olacak trakea kravat ve kültür ortamı geçirerek medya Sol akciğer için nefes borusu yoluyla serbest akışını kontrol edin.
   Not: trakea çatallanma noktada bağlı sonra nefes borusu seribaşı hücreleri otomatik olarak tohum sol lob için yönlendirilirsiniz. Bu hücreleri tohum önce nefes borusu yoluyla bastırıyor Kültür medya tarafından test edilebilir. Metastatik modelinde, medya sadece, şişirmek, sol lob ve sağ lob¹⁰hareket edecek.
6. 20 mL radarı kilit şırınga trakeal kanül üstüne ayarlayın ve RPMI1640 komple Kültür Medya (Şekil 2F) 50 mL ATCC akciğer kanseri hücreleri (A549, H1299) ekleyin.
7. Biyogüvenlik kabini tohum hücre gerçekleştirin. Hücre 15 mL şırıngada ekleyin ve yerçekimi tarafından akciğer loblar geçmek. Herhangi bir hava kabarcıkları ile geçirmeden hücreleri geri kalanını ekleyin.
8. Acellular akciğer tohum, biyoreaktör şişede damlama perfused medya toplamak ve nefes borusu tekrar 3 x geçmek izin.
   Not: Perfused medya bazen numaralı seribaşı kanser hücreleri vardır. Bu nedenle, verimli tohum için medya tekrar borusunda şırınga yerine koy.
9. Seribaşı sonra şırınga kaldırmak için 15 dakika bekleyin, taze medya eklemek ve biyoreaktör kuluçka geri dönmek. Herhangi bir hava kabarcıkları boru içinde kaldırın.
10. 6 mL/dk medya sıvı pompa başlatın.

Sonuçlar

Sıçan gelen hasat akciğer sağlam damarlara ve alveoller¹¹ (Şekil 3A ve 3B) tutar. Decellularization, kolajen, fibronektin ve elastin, gibi bir acellular akciğer hücre dışı matriks bileşenlerinin¹¹ (Şekil 3 c, 3D, 3Eve 3F) korunur. Decellularization yerli fare hücreleri mevcut Hematoksilen ve eozin (H & E) tarafı...

Tartışma

Ex vivo 4-D akciğer tümör büyüme ve metastaz bir laboratuvar tuzak içinde çalışma olanağı sağlar. Bir yerel akciğer matris normal doku için destek sağlar ve hücre-hücre etkileşimleri, hücre-matris etkileşimleri, hücresel başkalaşım ve doku organizasyon korur karmaşık bir sistemdir. Tümör büyüme üzerindeki etkileri ve diğer hücreleri ile etkileşim çalışmaya herhangi bir tümör microenvironment bileşenleri eklemek için bir fırsat sağlar.

Akciğer hasat ex vivo 4-D akciğer modeli ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sprague Dowley sıçan	Harlan	206M	Erkek
Klorheksidin sürüntü	Prevantics, NY, ABD	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, ABD	NDC 25021-400-10
18 gauge iğne	McMaster Carr, ABD	75165A249
2-0 ipek kravat	Ethicon, San Angelo, TX, ABD	A305H
Masterflex L/S pompa	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	EW-07554-80
Masterflex L/S pompa kafası	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	EW-07519-05
Masterflex L/S pompa kartuşu	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	EW-07519-70
Tygon Tüpü	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	14171211
MasterFlex Pompa tüpü	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	06598-16
Dişi luer kilit konektörleri	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	45508-34	75165A249
Erkek luer kilit konektörleri	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	45513-04
siyah naylon yüzük	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	EW-45509-04
İntravenöz set	CareFusion	41134E
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiyotikler	Gibco	15240-062
Silikon oksijenatör	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	ABW00011	Saint-GoBain-Tel
örgü	1164610105	Lowes	New York Tel
Dişi luer Pabuç Stili TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	45508-56
200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	45518-08
Dişi luer iplik stili kuplör	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	45508-22
Clave konektörü	ICU Medical	11956
Hi-Flo ve ticaret; 4 Musluk w / döner erkek luer kilit	smith Tıbbi	MX9341L
MasterFlex Pompa tüpü	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ABD	06598-13	kanül için