Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Birincil hücre kültürü yaygın hücresel özellikleri ve izole hücreler kontrollü bir ortamda mekanizmaları incelemek için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir araçtır. Memeliler ve balık arasında Fizyoloji büyük farklılıklara rağmen birincil hücre kültür balık iletişim kurallarından kez kez küçük değişiklikler ile memeli kültür koşulları temel alır. Çevre farklılıklar sadece vücut sıcaklığı, aynı zamanda kan serum parametreleri osmolalite, pH ve pH Tampon kapasitesi gibi etkiler. Hücre kültür medya ve benzer çalışma çözümleri ekstraselüler sıvı ve/veya kan serumu bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit içindir gibi bu parametreler söz konusu hayvan için özel olarak ayarlanır önemlidir.
Geçerli protokol medaka (Oryzias latipes) için en iyi duruma getirilmiş birincil kültür koşulları açıklar. Protokol yalıtmak ve sağlıklı korumak konusunda ayrıntılı adımlar ayrışmış hipofiz hücreleri bir haftadan fazla sağlar ve aşağıdaki adımları içerir: 1. osmolalite değerlere ayarlama bulundu medaka kan plazması, 2. ayarlaması inkübasyon sıcaklığı normal medaka sıcaklığa (burada akvaryum tesiste) ve 3. pH ve bikarbonat arabellek değerlerle karşılaştırılabilir benzer sıcaklıklarda yaşayan diğer balık türleri için uyum. Sonuçları açıklanan protokolü kullanılarak sunulan fizyolojik açıdan anlamlı sonuçlar medaka için teşvik ve bir başvuru kılavuzu olarak birincil hücre kültürleri diğer memeli olmayan tür yapım bilim adamları tarafından kullanılabilir.
Giriş
Hücre kültürü normal Hücresel Fizyoloji uyuşturucu tarama ve karsinojenezis1' e kadar farklı biyolojik sorulara cevap için bir mükemmel model sistemi sağlayan moleküler biyolojik araştırmalarda kullanılan ana araçlardan biridir. Primer hücre, enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle hayvan dokudan doğrudan izole çoğu zaman daha biyolojik olarak çok hücre satır ilgili biyolojik yanıt vivo içinde durumuna yakın olabilir olarak kabul edilir. Birincil hücre kültürleri hazırlanması için protokol faiz bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit ve fizyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için her tür ve hücre türü için optimize edilmelidi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan deneyleri yaşam bilimleri, bakım ve araştırma hayvan refahı için aşağıdaki yönergeleri Norveççe Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması çözümleri
- Osmometer ve pH metre aletleri doğru ölçümler emin olmak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.
-
Ca2 +- ve Mg2 +500 mL hazırlamak-7,75 (adım 1.2.1) için pH ve 290 mOsm/kg (adım 1.2.2) steril filtrasyon (adım 1.2.3) önce osmolalite ayarlama Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (dPBS), ücretsiz.
- PH 7,75 için kalibre edilmiş pH metre ile dikkatli bir şekilde çözüm dikkat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu iletişim kuralı bir birincil hücre kültürü medaka pituitaries üzerinden hazırlanması açıklar ve bir kültürde en az bir hafta için korunabilir sağlıklı hücreleri sağlar. Protokol medaka14 için fizyolojik ilgili değerleri temel alarak ve ayrıca hipofiz doku yetişkin balık, doku kaplama için hasat--dan tüm prosedürü sırasında 7,75 pH ve bir osmolalite 290 mOsm/kg kullanarak için optimize edilmiştir hücre kültürü (resim 1 ve
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Vitro hücre kültür sistemleri doğru şekilde1' de kullanılan bir bolluk farklı biyolojik soru cevap araştırmacılar için güçlü araçları sağlar. Onlar aslında içinde vivodaha onların bağlantı komşu hücrelere kaybetmiş Disosiye hücreleri farklı işlevsel özellikleri alınan olduğunu hatırlamak önemlidir. Vitro deneylerden elde edilen sonuçları misinterpreting riskini önlemek için faiz türler ve hücre türü birincil hücre kültür yordamına ayarlama dikkate almak önemlidir. Hatta .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bildirmek için bir şey yok.
Teşekkürler
Bu proje, yaşam bilimleri ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numarası 243811 ve 244461 (su ürünleri programı) Norveççe üniversite tarafından finanse edildi. Balık tesisi korumak için Lourdes Carreon Tan yaşam bilimleri Norveççe Üniversitesi için minnettarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (dPBS), kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | D8537 | Çözeltiyi 1M NaOH ile pH 7.75'e ve mannitol ile 290 mOsm'ye ayarlayın. |
| L-15 orta (Leibovitz), L-glutamin | Sigma olmadan (Merck, Damstadt, Almanya) | L5520 | 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glikoz, 2 mM Glutamax içeren 500 ml kültür ortamını takviye edin. Mannitol ile çözeltiyi 290 mOsm'ye ayarlayın ve çözeltiyi 0.2 & mikro ile filtreleyin; m PES steril filtre, 2,5 mL Penisilin-Streptomisin çözeltisi eklemeden önce (ayrıntılar için aşağıya bakın). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | S5881 | dPBS ve kültür ortamının pH'ını 7.75'e çıkarmak için 1 M çözelti damlaları ekleyin. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | S5761 | 10 mM NaHCO3, 500 mL kültür ortamı başına 420 mg'a eşittir. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | 63565 | dPBS ve kültür ortamının ozmolalitesini artırmak için kullanın. 290 mOsm'luk bir ozmolaliteye ulaşmak için gereken doğru miktarı hesaplayın. |
| D-glukoz | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | G5400 | 4.5 mM D-glukoz, 500 mL kültür ortamı başına 405 mg'a eşittir. |
| GlutaMAX Takviyesi | Gibco (Yaşam Teknolojileri, Paisley, İngiltere) | 35050-061 | Arttırılmış stabilite ile L-glutamine alternatif. 2 mM Glutamax, 500 mL kültür ortamında 5 ml 100x stoka eşittir. |
| Penisilin-Streptomisin | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | P0781 | Stok çözeltisi mL başına 10.000 birim penisilin ve 10 mg streptomisin. 500 mL L-15 ortamında 2.5 mL stok çözeltisi kullanın (50 U / mL Penisilin ve 50 & mikro; g / mL Streptomisin). |
| Tripsin tip II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | T7409 | dPBS çözeltisinde 1 mg / mL hazırlayın. |
| Tripsin inhibitörü tip I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | T6522 | dPBS çözeltisinde 1 mg / mL hazırlayın, 2 ve mikro ile destekleyin; g/ml Dnase I (aşağıdaki ayrıntılara bakın). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Almanya) | D5025 | Tripsin inhibitörü çözeltisinde kullanım (yukarıya bakın). |
| 0.2 ve mikro; m Polietersülfon (PES) steril filtre sistemi | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Ayarlamalardan sonra dPBS ve L-15 ortamının steril filtrasyonu için kullanın. |
| Cam tabanlı 35 mm hücre kültürü kabı, poli d-lizin kaplı | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak plastik tabak ile de değiştirilebilir. |
| Dumont #5 ince forseps | Güzel Bilim Araçları (CA) | 11254-20 | Düz uçlu |
| Dumont #5/45 ince forseps | Güzel Bilim Araçları (CA) | 11253-25 | Açılı 45 derecelik uç |
| Stereo mikroskop SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japonya)Hipofiz | diseksiyonu için kullanın. | |
| Alegra X-22R Santrifüj | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | Soğutma seçeneği ile (mevcut model XR-30'a | |
| Su banyosu | Techne (Staffordshire, İngiltere) | Sıcaklığı ayarlama imkanı olan herhangi bir su banyosu yapacaktır. | |
| Pastör cam pipetler | VWR (NY) | 612-1701 | Dış çap 1,6 mm, kullanmadan önce ateş cilası ve otoklav. |
| Galaxy MiniStar masa santrifüjü | VWR (NY) | 521-2844 | Herhangi bir küçük masa santrifüjü yeterli olacaktır. |
| İnce iğneler / böcek pimleri | Güzel Bilim Araçları (CA) | 26001-40 | Çap 0,03 mm. Bunun yerine başka ince iğneler de kullanılabilir. |
| Balmumu plakası | Büyük petri kabına erimiş parafin mumu eklenerek özel olarak yapılır. |
Kaynaklar
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells fr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
