Yöntem makalesi

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

5.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58163

⸱

16 Aralık 2018

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

Bu makalede

Özet

Burada, yalıtım, genişleme ve köpek yumurtalık dokusundan mezenkimal kök hücre farklılaşma için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilgi yalıtım, genişleme ve kültür kolaylığı nedeniyle son on yıl içinde artmıştır. Son zamanlarda, çalışmalar bu hücreler sahip geniş farklılaşma kapasite göstermiştir. Yumurtalık hücre tabanlı terapiler için umut verici bir aday MSCs içinde zengin ve sık sık biyolojik atık olarak ovariectomy ameliyat sonra atılan nedeniyle gerçeğini temsil eder. Bu makalede, yalıtım, genişleme, için yordamlar açıklanır ve MSCs farklılaşma hücre sıralama gerekliliği olmadan köpek yumurtalık türetilmiştir teknikleri. Bu iletişim kuralı rejeneratif tıp için önemli bir araç nedeniyle klinik çalışmalar son derece türevlenebilir bu hücrelerde geniş uygulanabilirliği temsil eder ve terapötik kullanır.

Giriş

Kök hücreler üzerinde odak önemli ölçüde güçlü rejeneratif tıp terapiler keşfetmek toplu amacı tarafından yakıt oldu bir araştırma çaba son on yıl içinde artmıştır yayımlanmış çalışmaları sayısı. Kök hücreler var iki birincil tanımlama işaretleri: öz - yenileme ve farklılaşma. Mezenkimal kök hücre normal doku ciro için sorumlu ve embriyonik kök hücre1' e göre farklılaşma daha sınırlı bir kapasiteye sahip. Son zamanlarda, birçok çalışma geniş bir MSCs farklılaşma göstermiştir ve olup farklar embriyonik ve yetişkin kök hücreleri arasındaki tüm2adlı bir konudur tartışma altında.

Ovarium yüzey epitel hücreleri yanıt olarak farklı türdeki ayırt etmek için kapasite istinat hem epitelyal ve mezenkimal işaretçileri3, ifade farklılaşmış, bir kaydedilmemiş katman hücre, nispeten daha az olduğunu çevre sinyalleri4. Yumurtalık kök hücre tam konumunu iyi bilinen değildir; Ancak, tunica albuginea bipotential ataları germ hücreleri5' e çıkmasına önerilmiştir. İmmünolojik araştırmalar bu hücreler stromal kökenli6 veya içinde bulunduğu veya proksimal Over yüzey7onaylanmadığına karar. Mezenkimal kök hücre hücre adezyon8' önemli bir rol oynamaktadır çok sayıda reseptörleri hızlı beri bir deney bir nüfus hızlı adezyon içeren hücrelerin seçerek hücreleri nüfusu açıkça ayırmak hipotezi test etmek için tasarlanmıştır doğada mezenkimal olarak characterizable. Son zamanlarda, bizim grup MSCs türetmeye yumurtalık dokusu hücreleri hızlı yapışma9sergilenmesi arıtılmış nüfusu elde etmek için onların ilk 3 h kültür, kültür tabakta plastik yüzeyine yapışma üzerine kurulu kapasiteli bildirdi. Burada, yumurtalık dokusu mezenkimal kök hücre izolasyon için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu deney dört melez kadın köpek bir köpek sterilizasyon programı seçmeli ameliyat sonrası hibe yumurtalık ile gerçekleştirildi. Bu deney UNESP-FCAV (protokol No 026991/13) hayvanların kullanımı Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. deneysel hazırlık

  1. Hazırlamak veya 500 mL steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) kalsiyum ve magnezyum olmadan satın alın.
  2. Bir collagenase hazırlamak enzim DPBS 1 ml 40 µg karıştırılarak çözüm stok. 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama ve 2 mL aliquots-20 ° C'de depolayın
  3. Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) düşük glikoz % 10 fetal serum ve antibiyotiklerin % 1 ile kültür ortamından hazırlayın.
  4. Steril malzeme toplamak: makas ve forseps, doku kültürü flask, yemekler, tüpler ve 10 mL ve 5 mL pipetler.
  5. Standart hücre kültür Labaratuar donanımları kullanın: bir biyolojik emanet dolabı (BSC), % 5 CO2 ve 38 ° C ve bir santrifüj ayarlamak bir hücre kültür kuluçka makinesi.
  6. BSC temiz: eldivenli elleriyle % 70 ile sterilize alkol, UV ışığı kullanarak.

2. izolasyon yumurtalık mezenkimal kök hücre

  1. Ameliyattan sonra onların varış laboratuarındaki kadar PBS bir konik tüp buzda yumurtalık unutmayın.
  2. 100 mm Petri tabağı PBS 10 mL ile doldurulması.
  3. Yumurtalık tüpü çıkarması ve PBS ile ilk Petri kabına aktarın. Onları hareketleri karıştırma ile yıkayın.
  4. Yavaşça yumurtalık almak ve başka bir çanak içine yerleştirin. Steril cımbız ve makas ile çok küçük parçalara, yaklaşık 1 mm boyutunda doku kıyma.
  5. Yumurtalık dokusu bir 35 mm Petri kabına aktarın ve collagenase 2 mL ekleyin. Doku biraz daha kıyma.
  6. 38 ° c kuluçka 3 h için Petri kabına yerleştirin ve yavaşça dairesel hareketler her 20 min ile Petri kabına sallamak.
  7. 3 saat sonra Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.
  8. Yemeğin içeriğini 15 mL tüp aktarmak. Genişletme ortam 5 mL ekleyin.
  9. Santrifüjü önce tüpü yavaşça tersine çevirin. 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet genişleme medya 3 mL ile resuspend.
  10. Pelet T25 biberondan aktarın. Kuluçka % 5 ile şişe koyun 3 h için 38 ° C'de CO2 .
    Not: Prosedürün en önemli kısmı kuluçka 3 h sonra medya değiştirmektir.
  11. Şişe kuluçka makinesi kaldırın ve medya kalan doku ile kaldırın. Taze genişleme medya 3 mL şişe ekleyin.
  12. Medya her 48 h değiştirmek ve hücresel izdiham için şişe gözlemlemek.
    Not: Yordamı ana adımları Şekil 1' de görülebilir.

3. yumurtalık mezenkimal kök hücre genişlemesi

  1. Hücre geçiş
    1. Hücreleri izdiham ulaştığınızda, medyayı şişeden çıkarın.
    2. PBS ile 3 mL şişe yıkama. PBS kaldırın.
    3. Tripsin ve şişe 38 ° C'de kuluçka 3 dakika süreyle hafifçe dokunun ayırmak için hücreleri yardımcı şişe yerine 1,5 mL ekleyin.
      Not: Hücreleri izdiham yaklaşık 5 - 7 sonra ilk kaplama d ulaştırılması gerekmektedir.
    4. Genişletme ortam 3 mL ekleyin ve içeriği bir konik tüp aktarın.
    5. 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL genişleme medya ekleyin.
    6. Yavaşça tüp içeriğini lunaparkçı.
    7. 10 µL sayma ve hücreleri ile tüp da kuluçka makinesine koy hücre gerçekleştirmek için örnek bir aliquot al.
    8. Karışımı içine hemasitometre yer 10 µL.
  2. Hücreleri sayma
    1. Hemasitometre kılavuz çizgileri üzerinde odaklanmak ve mikroskop'ın 10 X objektif kullanın.
    2. Beş küçük kareler (Şekil 2) içinde hücreleri saymak.
    3. Sayılan sayısı mililitre başına hücre sayısı tahmin etmek için 50.000 tarafından çarpın.

4. yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Not: Hill ve ark. içinde kurulan esaslarına göre farklılaşma deneyleri gerçekleştirilmiştir 9.

  1. Kuyuda nüsha, 4-şey kültür tabak başına tohum 1.0 x 104 hücre.
  2. Genişletme ortam 1 mL ekleyin.
  3. Yavaşça dairesel hareketler ile çanak kışkırtmak.
  4. 24 saat sonra arzu edilen farklılaşma medya ile kültür ortamı değiştirin.
  5. İçin osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma, kuluçkaya indüksiyon medya 30 d için hücrelerle, Medya değiştirme ile her 3 ö. belirli farklılaşma kitleri her bu deneyleri için kullanıldı.
  6. Nörojenik lineage farklılaşma için indüksiyon medya, medya değiştirilmesi her 3 d ile 10 d için hücreleri kuluçkaya. Burada kullanılan ortamı DMEM düşük glikoz, 2 mM valproik asit, 1 µM hidrokortizon, 10 µM forskolin, 5 mM potasyum klorür, 5 µg/mL insülin ve 200 µM butylated hydroxyanisole yer.
  7. Endoderm medya reaktif üreticinin yönergelerine göre 5 d için endoderm öncüleri, kuluçkaya.
  8. Primordial germ hücreli lineage farklılaşma için indüksiyon medya medya değiştirilmesi her 3 d ile 14 d için hücrelerde kuluçkaya. Burada kullanılan medya bulunan DMEM, %10 FBS, 1 mM sodyum pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1 mM gerekli olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insülin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL fare epidermal büyüme faktörü, 1 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü, 40 ng/mL insan gliyal hücre satırı kaynaklı nörotrofik faktör ve 15 mg/L penisilin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre izolasyon:

Yumurtalık MSC yalıtım yordamı Şekil 1' de özetlenmiştir. Cerrahi, doku kıyma, collagenase sindirim ve medya Değiştir 3 h başında kültür sonra sonra hızlı plastik yapışkanlı özellikleri sözde MSC nüfusuyla başarıyla köpek yumurtalık dokusundan izole edildi. Hasat hücreleri hızla kültür çanak plastik yüzeye yapıştırılı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada kanıt MSCs ovariectomy sonra biyolojik atık olarak kabul edilir köpek yumurtalık dokusu yalıtılmış olmasını sağlamak. Birçok hücre tipleri-ebilmek bulunmak içinde Yumurtalık nedeniyle gerçeğini, başarılı bir şekilde büyüdü hücreleri bir monolayer fibroblast benzeri görünümdeki seçili plastik hızlı onların bağlılığı dayalı MSCs seçmek için bir protokol evlenme teklif etti.

MSCs türetmeye kemik iliği ilk rapor MSCs plastik yapışma kapasitesini kültür11ilk 48 saat d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar köpek sterilizasyon program UNESP-FCAV, lütfen yumurtalık sağlamak için kabul etmiş oluyorsunuz. Bu eser FAPESP (işlem No 2013/14293-0) ve burunları gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DPBS Thermo Fisher14190144
Kollajenaz IThermo Fisher17100017
Doku şişesiCorningCLS3056
DMEM düşük glikozluThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE ekspresThermo Fisher12604021
StemPro Adipogenez Farklılaşma KitiThermo FisherA1007001
StemPro Kondrogenez Farklılaşma KitiThermo FisherA1007101
StemPro Osteogenez Farklılaşma KitiThermo FisherA1007201
STEMdiff Kesin Endoderm KitiStemCell5110
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
ve beta;-Tubulin MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG- FITCAbD SerotecSTAR120F

Kaynaklar

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145(2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H cre zolasyonuK pek Over DokusuK k H cre DiferansiyasyonuH cre Geni letme ProtokolRejeneratif T p UygulamalarOverektomi Doku KaynaK k H cre K lt r TeknikleriMezenkimal K k H cre Geni letmeK pek K k H cre Diferansiyasyonu

İlgili makaleler