Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

11K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58165

⸱

27 Eylül 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Pharmaceutics and Drug Delivery, College of Pharmacy, University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.

Özet

Bu iletişim kuralı T7 phages fajının seçimi deneyler (Yani, "biopanning") üzerinden Numaralandırılacak kantitatif PCR (qPCR) kullanımını açıklar. qPCR DNA ölçmek için bir floresan tabanlı yaklaşımdır ve faj parçacıklar için bir proxy olarak faj genleri ölçmek için adapte işte. Bu protokol için yüksek sıcaklık ısıtma olmadan ek DNA arıtma kullanılarak facile faj DNA hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Yöntemin yalnızca küçük hacimli ısı phages ve küçük hacimli qPCR tepki gerekir. qPCR yüksek üretilen iş ve hızlı, işlemek ve diğer fajının numaralandırma yaklaşımlar 2 – 4 h. ile karşılaştırıldığında tepkileri bir 96-şey tabak veri almak mümkün, qPCR daha zaman verimli olur. Burada, qPCR biopanning karşı vitro kistik fibrozis gibi mukus modeli üzerinden tespit T7 phages numaralandırmak için kullanılır. QPCR yöntemi T7 phages biopanning diğer türleri dahil olmak üzere diğer deneyler üzerinden ölçmek için genişletilebilir (e.g., protein bağlayıcı, içinde vivo immobilize fajının tarama) ve diğer kaynaklar (Örneğin, su sistemleri veya vücut sıvıları). Özet olarak, herhangi bir DNA kapsüllenmiş virüs ölçmek için bu iletişim kuralı değiştirilebilir.

Giriş

Bakteriyofaj (fajının) ekran teknolojisi, George Smith tarafından 1985 yılında geliştirilen peptid veya protein ligandlar hedefleri veya reseptörleri hücre zarı, hastalık antijenleri, hücre organelleri veya özel karşı tanımlamak için güçlü, yüksek-den geçerek bir yaklaşım olduğunu organ ve dokulara son yirmi yılda1,2. Burada, rasgele kütüphanelerin polipeptitler veya tek zincir antikorlar phages (genellikle M13 veya T7) kat protein üzerinde görüntülenir ve belirli ligandlar immobilize proteinler vitro veya içinde vivo karşı kaydırma tespit edilmesi Biyolojik sistemlerde bir yinelemeli seçim sürecinde. O zaman, ligandlar tanı ve tedavi hastalıkları3,4için görüntüleme veya terapötik ajanlar ile birleştiğinde olabilir. Doğru bir şekilde phages biopanning birden çok adımı sırasında numaralandırmak için önemlidir: (1) substrat için bağlamak phages ölçmek için ve (2) her turda seçim ile zenginleştirme olup olmadığını belirlemek için phages ölçmek için (fajının zenginleştirme gösterir biopanned Feyc benzeşme hedef için). Miktar, Çift katmanlı plak yöntemi, geçerli altın standart birden çok zorluklar sunar; sıkıcı, hantal ve potansiyel olarak çok sayıda örnekleri için yanlış olduğunu. Bu nedenle, bizim grup M13 ve T7 fajının parçacıklar biopanning5numaralandırmak için bir hassas, tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yöntemi geliştirmiştir.

qPCR doğru bir şekilde T7 ve M13 phages ölçmek için cazip ve uygun bir yöntemdir. Her bireysel fajının parçacık yalnızca genomik DNA (dsDNA veya ssDNA) bir kopyasını içerebilir yana bir fajının genom bir fajının parçacık için eşdeğerdir; Feyc genleri sayısı miktarının tarafından phages sayısını ölçmek mümkün olabilir. QPCR, floresan muhabir sırasında boyalar özel olarak sigara fajının genomik DNA bağlamak veya özellikle fingerprinting astar PCR güçlendirme sırasında ve floresan sinyal güçlendirme her turu ile artar. Floresans sinyal bu yuvarlak/amplifikasyon döngüsü eşik ulaştığında eşik döngüsü (Ct) belirtilmektedir. Başvuru faj DNA bilinen konsantrasyonları standart bir eğri oluşturmak için Ct değerlerine karşı çizilir. Standart eğri DNA örnekleri Ct değerleri ile kullanarak, phages konsantrasyonları değiştirilmiş.

Çok sayıda stratejileri daha önce geliştirilen ve yoğun phages biopanning üzerinden ölçmek için kullanılan iken, her biri belirli zorlukları vardır. En popüler ve geleneksel yöntem çift-tabaka plak tahlil olduğunu. Burada, bakteri seri dilutions hazırlanan phages ile enfekte, solid agar substrat kaplama ve agar ile overlaid ana bilgisayar; phages oluşan plaklar (Yani, plak oluşturan birimler veya pfu) agar plaka numarası ile numaralandırılır. Plak tahlil hassas ama sıkıcı, zaman alıcı ve yanlış, özellikle çok sayıda örnekleri ve yüksek konsantrasyonları5. Ayrıca, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) M13 T7 fajının parçacıklar6,7,ve8numaralandırmak için adapte edilmiştir. Burada, farklı dilutions, phages bağlı olan ve bir katı substrat (Yani, bir Mikroplaka) yakalanan, fajının özel antikorlar ile probed ve gazetecilere (Örneğin, enzim hassas chromogenic yüzeylerde, fluorophores) kullanarak tespit Feyc parçacıklar mevcut sayısını belirleyin. Veriler (Örneğin, floresan, absorbans) örneklerinin fajının standartları bilinen konsantrasyonlarda karşı bilinmeyen konsantrasyonları ölçmek için kullanılabilir. Farklı fajının tabanlı ELISAs geliştirilmiştir ancak potansiyel kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir grubu bir kağıda dayalı sandviç ELISA yedi büyüklük (102-109 pfu/mL); yayılmış bir miktar aralığı ile geliştirilen Ancak, bu yöntem birden çok adımı antikor kaplama gerekli ve tahlil8için tüm günümü aldı. Grubumuz aynı zamanda M13 fajının parçacıklar ölçmek için bir ELISA yöntemi geliştirilmiş ancak 10 daha az duyarlı algılama aralığı vardı6 ' 1011 pfu/mL5. Değiştirilebilir lanthanide floresan problar M13 numaralandırmak için geliştirilmiştir ve miktar veri içinde 20 dk alınamadı; Ancak, bu tahlil vardır dar bir Dinamik Aralık 10 1012 pfu/mL99 . Bir grup atomik kuvvet mikroskobu M13 fajının parçacıklar çözüm numaralandırmak için kullanılan, ama bu gelişmiş elektron mikroskobu gerektirir ve sadece konsantrasyonları10dar bir Aralık içinde çalıştı. Başka bir çalışmada monodisperse emülsiyonlar floresan M13 ve T4 muhabir phages tuzak ve floresan damlacıkları tarafından phages saymak için kullanılır; Ancak, bu yaklaşım aynı zamanda bir dar miktar aralığı 10 sergilenen2 106 pfu/mL11. Damlacık dijital PCR M13 phages ölçmek için kullanılan, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan fajının parçacıklar12sayısı arasında ayırt etmek bu yaklaşım değiştiremiyor.

Bizim grup yakın zamanda T7 ve M13 phages biopanning iki farklı floresan muhabir boyalar5kullanarak bir kan - beyin bariyerini hücre modeli üzerinden tespit numaralandırmak için qPCR yöntemleri geliştirmiştir. Söz konusu miktar yöntemlerine göre geliştirdiğimiz qPCR yöntemleri yüksek üretilen iş ve zaman tasarruflu çok sayıda örnekleri ölçmek için ve mümkün ayırt arasında bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan phages DNaz ile ben, ön arıtma Feyc örnekleri. Önemlisi, bu yaklaşımın M13 ve T7 bacteriophages biopanning örneklerinden tekrarlanarak ve doğru bir şekilde ölçmek. Acemi araştırmacılar fajının qPCR alanında rehberlik için burada T7 fajının parçacıkları bir sistein kýsýtlanmýþ kitaplığı (CX7C) karşı bir vitro kistik fibrozis (CF) mukus bariyer panned numaralandırmak için detaylı qPCR yöntemi açıklanmaktadır. Bu işten qPCR yöntemi fajının parçacıklar biopanning diğer türlerinden ve su, toprak ve vücut sıvıları gibi diğer kaynaklardan ölçmek için genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. primer tasarım ve T7 fajının genomik DNA'ın Analizi

  1. T7 fajının genomik DNA amplifikasyon için tasarım astar.
    Not: F (ileriye doğru) ve (bkz: Malzemeler tablo) R (ters) astar T7 DNA dizisi yükseltmek akıntıya karşı bulunduğu kitaplığı değişken bölge (Şekil 1).
  2. Erime sıcaklığı (Tm), yüzde GC içeriği (GC %), astar Dimer, saç tokası oluşumu ve PCR uygunluğu (Şekil 1) de dahil olmak üzere astar, parametrelerini değerlendirmek için bir uygun astar analizörü seçin.
  3. Astar oligonucleotides (oligos) sipariş ve elimize lyophilized oligos 100 µM hisse senedi konsantrasyonları bir 1,5 mL santrifüj tüpü alın ve birkaç ay için-20 ° C'de saklayın DNaz ve RNase free ultra saf su için resuspend.
  4. Birkaç aliquots (yaklaşık 50 µL her 1,5 mL tüp) 100 µM astar stokunun olun.
    Not: Bu adımı sık donma-çözülme döngüsü önlemek için kullanılır.

2. standartlar T7 fajının genomik DNA miktar için hazırlayın

  1. Seri olarak 0.1 µg/µL (1.0 x 108 fg/µL) başvuru T7 faj DNA seyreltik (satın; 0,1 µg/µL bilinen bir konsantrasyon malzemeleri görmek) 10 kat 1.0 x 106 x 100 fg/µL ultra-saf H2O ' 0.2 mL PCR tüpleri ile 1.0. 20 µL (Şekil 2) bir hacmi her konsantrasyon hazırlayın.
  2. Girdap ayrıntılı seyreltme her adımda karıştırma sağlamak için PCR tüpleri. Ayrıca ipuçları DNA örneği için aşağıdaki seyreltme eklerken değiştirin.
    Not: Bu qPCR denemenin her toplu iş için standart bir eğri DNA standartların yeni çözüm hazırlamak için tavsiye edilir.
  3. Denklem 1 (aşağıda) T7 fajının başvuru için DNA konsantrasyonları fg/µL genom kopya (gc) /µL (Şekil 2) dönüştürmek için kullanın.
  4. T7 faj DNA konsantrasyon gc/µL =
    figure-protocol-1(1)
    Not: bp: baz çifti; T7 genomik DNA başvurudur 37314 bp.

3. ön tedavisinde fajının örnekleri önce qPCR reaksiyon hazırlık

  1. (1. seçenek) Damlalıklı 20 µL vitro kistik fibrozis (CF) karşı biopanning seçildiği bir T7 klonu (fajının)-mukus model 1.5 mL santrifüj tüpleri içine gibi. DNaz 1,25 birimleri ekleyin ben (0.5 µL) her 20 µL örnek için.
    Not: T7 fajının sistein kısıtlanmış heptapeptide kitaplığı (CX7C) biopanned 15dk için 24-şey zar ekler ( Tablo malzemelerigörmek) kaplı CF benzeri mukus karşı yapıldı. Daha fazla bilgi sonuçları bölümünde sağlanır. Bir T7 klon qPCR numune hazırlama eluate üzerinden için seçildi.
    1. Seçenek 2: Damlalıklı 200 T7 µL klon 1,5 mL tüpler içine ve 5 adet DNaz ekleyin ben
      (2 µL) her örnek için.
      Not: Bu adımda seçilen fajının örnek hacmi biopanning toplanan birimden bağlıdır. Odağı iletişim kuralının biopanned fajının qPCR üzerinde olmakla birlikte, biopanning ayrıntılı için T7 fajının Kullanıcı Protokolü adımları (bakınız Tablo reçetesi)13kit.
  2. T7 fajının örnek tüpler (adım 3.1) kap ve onları 37 ° c ısıtılmış kuru banyo (Yani, ısı blok) 10 min için kuluçkaya.
  3. Bir ısıtmalı kuru banyoda (Şekil 3A) 15 dakika 100 ° C'de (Kimden adım 3.2) tüpler kuluçkaya.
    Dikkat: buharlaşma ve yoğunlaşma Isıtma adımı sırasında meydana beri 1.5 mL santrifüj tüpleri tamamen şapkalı emin olun.
  4. Isıl phages adım 3.3 18,534 x g , 10 s. karışımı bir girdap karıştırıcı tüp yerleştirerek phages ayarla 10 s ve 18,534 x g 10 için spin için dokunmatik-harekete geçirmek modu için spin s tekrar.
    Not: Spin-mix-spin döngüsü ısıtmalı fajının örnekleri de karıştırılır emin olmaktır.
  5. Onları deney tezgah veya mağaza buzdolabında 4 ° C'de gecede terk ederek örnek tüpler, oda sıcaklığında (RT) sakin.
    Not: Bu adımda deneme duraklatılmış.

4. qPCR reaksiyonlar hazırlayın

Not: Bir PCR reaksiyon için bir örnektir. 5 her PCR reaksiyon içerir µL qPCR Master mix (malzemeleri görmek), 5 µM astar çifti Mix 1 µL, H2O 2 µL ve 2 µL ısıl T7 fajının örneği. Birden fazla PCR reaksiyonları için fajının örnek dışında tüm reaktifler bir 1,5 mL tüp premix. Premiks her reaktif hacmi qPCR için fajının örnek sayısına bağlıdır.

  1. 10 biopanned fajının örnekleri bilinmeyen konsantrasyon ve 7 nüsha standart konsantrasyonlarda örnekleri qPCR Premiks hazırlayın. Sonuç olarak, 51 Toplam örnekleri ve bu nedenle, 51 qPCR reaksiyonlar (Yani, örnek başına bir reaksiyon) vardır. 51 reaksiyonlar için 255 µL (51 x 2 µL) qPCR ana Mix (51 x 5 µL), astar (51 x 1 µL) 51 µL ve H2O 102 µL Premiks hazırlayın.
    Not: Bu bir kaç ilave PCR reaksiyonları sırasında aliquoting PCR karışımı içine her şey 96-şey qPCR plaka için hacim kaybı telafi etmek için hazırlamak için tavsiye edilir.
  2. Aliquot 8 µL PCR Premiks 96-şey qPCR plaka 51 wells (Yani, 51 qPCR reaksiyonlar) olmak üzere toplam her kuyuya. Aliquoting sırasında ipuçları değiştirmeye gerek yoktur.
  3. Her şey (Şekil 3B); 2 µL ısıl T7 fajının örnekleri (adım 3.4) veya T7 fajının başvuru DNA (adım 2.1) ekleme ipuçları farklı DNA örnekleri çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuya eklerken değiştirin. Ayrıca, 2 µL DNA örnekleri qPCR Premiks (Yani, 8 µL PCR Premiks içine) yüzeyinin altında dağıtmak.
  4. QPCR levha yapıştırıcı film ile kapatın.
    Not: Bu qPCR plaka türü ne olursa olsun kritik bir adımdır. Plaka tamamen mühür için önerilen setini kullanın; Aksi takdirde, plaka mühürlü olmayan bölgede PCR sırasında cilt kaybı neden olur Bisiklete binme.
  5. QPCR plaka floresan photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile sarın ve qPCR ekipman üzerinde çalışmaya devam edin.

5. qPCR Bisiklete binme koşulları

Not: qPCR Bisiklet koşullarını belirli qPCR ekipman üzerinde kurulmuştur ( Tablo malzemelerigörmek).

  1. 96-şey qPCR plaka qPCR ekipman üzerinde çalıştırın. Ekipman, aşağıdaki deneysel koşullar (Şekil 3 c) ayarlamak için menüden ayarları seçin.
  2. Koşulları aşağıdaki gibi 10 µL örnek hacmi için bisiklet ayarla: bir çevriminde 2 min 50 ° c 95 ° C'de bir döngüsü için 2 dk, ardından 40 döngüleri tarafından (95 ° C 15 s, 1 dk. için 60 ° C). Sonra çalışma eritebilir eğri ayarları: 95 ° C bir döngüsü için 15 s, 60 ° C için 1 dakika ve 95 ° C 15 s.
  3. 6. adımda açıklandığı gibi verileri çözümlemek için devam edin.

6. qPCR ham veri analiz ve qPCR T7 Bacteriophages için gc/µL için Ct değeri dönüştürmek

  1. Ham qPCR veri analiz etmek ve veri kalitesi ve ham veri (Şekil 4) karakteristik araziler analiz ederek değerlendirmek.
    Not: Amplifikasyon arsa, uygulamasının arsa ve erime eğrisi Arsa qPCR veri kalitesini doğrulamak anahtar özelliği araziler vardır.
  2. İneklemek örneklerinden standart eğri (adım 2.1) her toplama, ortalama eşik döngüsü (Ct) değerleri hesaplar.
    1. Ortalama Ct (Y) günlük (gc/µL) (X Y doğrusal eğrisi almak için) karşı komplo = kX + b (k doğrusal eğrinin eğimini, b kesme noktası).
    2. Doğrusal katsayısı14 R2 hesaplamak (R2 -meli var olmak > 0.99).
  3. Standart eğri Y kullanın = kX + b (Şekil 5) gc/µL T7 phages biopanning örneklerinde (Yani, phages CF benzeri mukus karşı seçili) sayısını hesaplamak için.
    Not: Standart eğrinin eğimini k var.
  4. Aşağıdaki denklemle amplifikasyon verimlilik hesaplamak
    figure-protocol-2(2)
    Not: başvuru DNA qPCR oluşturulan standart eğrinin eğimini k var. İdeal amplifikasyon verimliliği % 90-110 aralığıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farklı astar tasarım araçları qPCR astar tasarlamak için kullanılabilir. Genellikle, astar tasarım programları hesaplamak ve astarlar, Örneğin, GC %, Tm, astar dimer veya saç tokası oluşumu, vb anahtar parametrelerinin genellikle doğrulamak için yerleşik kendi algoritmalar, anahtar ölçüt içinde farklı benzer astar tasarım araçları ve astar onların talimatları tasarlanabilir. Astar patlama astar özgüllük onaylamak için kullanılabilir. Bir astar genomik DNA

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

QPCR yöntemleri fajının genomik DNA5ölçmek için geliştirdiğimiz ve burada açıkladığımız ve T7 phages karşı bir CF benzeri mukus bariyer seçili numaralandırmak için qPCR yöntemini benimsemiştir. Yayın, nicel gerçek zamanlı PCR deneyler (MIQE) yönergeleri için en az bilgiyi geliştirmek ve numaralandırma T7 phages15qPCR yöntemini doğrulamak için adapte. Phages biopanning deneyler üzerinden ölçmek için geliştirilmiş zaman verimli, güvenilir ve ekonomik bir yaklaşım protokolüdür...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser ilaç Vakfı araştırma Starter hibe tarafından desteklenen ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R01HL138251 altında verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler ve Reaktifler< T7 genomik DNA için güçlü >
primerler IDTF: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG
R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select ambalaj kontrolü DNAEMD Millipore69679-1UG
MicroAmp optik 96 kuyulu reaksiyon plakasıThermoFisher ScientificN8010560
qPCR ana karışımı - SYBR'yi güçlendirin Yeşil ana karışımUygulamalı biyosistemlerA25742
MicroAmp optik yapışkan film kitiThermoFisher Scientific4313663
T7Select 415-1 Klonlama KitiEMD Millipore70015Kullanıcı protokolleri: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP
DNase I çözeltisiThermoFisher Scientific90083
24 kuyulu transwell plakasıCorning3472
UltraPure DNase / RNase İçermeyen Damıtılmış H 2< / sub>OInvitrogen10977015
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)Corning21040CV
strong > Name< / strong > <strong > Company < / strong >< strong > Katalog NumarasıComments
Equipments
ViiA7 Hızlı 96 Kuyulu Bloklu Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermoFisher Scientific4453535
Heraeus Pico 21 MikrosantrifüjThermoFisher Scientific75002415
Fisherbrand Dijital Vorteks KarıştırıcıFisher Scientific02-215-370
HERMO SCIENTIFIC Çoklu Blok IsıtıcıThermoFisher Scientific Model:2001
Sorvall Legend X1 SantrifüjThermoFisher Scientific75004220
M-20 Mikroplaka Sallanan Kova RotorThermoFisher Scientific75003624
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Software
QuantStudio Gerçek zamanlı PCR yazılımıThermoFisher Scientificv1.2
Gerçek zamanlı qPCR primer tasarımıIDT
OligoAnalyzer 3.1IDT
<

Kaynaklar

  1. Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  2. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
  3. Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
  4. Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
  5. Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
  6. Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
  7. Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
  8. Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
  9. Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
  10. Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
  11. Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
  12. Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
  13. T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP (2018).
  14. Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
  15. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
  16. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  17. Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
  18. Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
  19. Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
  20. Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
  21. Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
  22. Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
  23. Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Faj SayımıBiyopanning DeneyleriFaj DNA HazırlamaqPCR Standart EğrisiFaj Genom KopyalarıPlak Analizi KarşılaştırmasıIsıl İşlem Yöntemi96 Kuyucuklu qPCR Plakası
T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.