T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Bakteriyofaj (fajının) ekran teknolojisi, George Smith tarafından 1985 yılında geliştirilen peptid veya protein ligandlar hedefleri veya reseptörleri hücre zarı, hastalık antijenleri, hücre organelleri veya özel karşı tanımlamak için güçlü, yüksek-den geçerek bir yaklaşım olduğunu organ ve dokulara son yirmi yılda^1,2. Burada, rasgele kütüphanelerin polipeptitler veya tek zincir antikorlar phages (genellikle M13 veya T7) kat protein üzerinde görüntülenir ve belirli ligandlar immobilize proteinler vitro veya içinde vivo karşı kaydırma tespit edilmesi Biyolojik sistemlerde bir yinelemeli seçim sürecinde. O zaman, ligandlar tanı ve tedavi hastalıkları^3,4için görüntüleme veya terapötik ajanlar ile birleştiğinde olabilir. Doğru bir şekilde phages biopanning birden çok adımı sırasında numaralandırmak için önemlidir: (1) substrat için bağlamak phages ölçmek için ve (2) her turda seçim ile zenginleştirme olup olmadığını belirlemek için phages ölçmek için (fajının zenginleştirme gösterir biopanned Feyc benzeşme hedef için). Miktar, Çift katmanlı plak yöntemi, geçerli altın standart birden çok zorluklar sunar; sıkıcı, hantal ve potansiyel olarak çok sayıda örnekleri için yanlış olduğunu. Bu nedenle, bizim grup M13 ve T7 fajının parçacıklar biopanning⁵numaralandırmak için bir hassas, tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yöntemi geliştirmiştir.

qPCR doğru bir şekilde T7 ve M13 phages ölçmek için cazip ve uygun bir yöntemdir. Her bireysel fajının parçacık yalnızca genomik DNA (dsDNA veya ssDNA) bir kopyasını içerebilir yana bir fajının genom bir fajının parçacık için eşdeğerdir; Feyc genleri sayısı miktarının tarafından phages sayısını ölçmek mümkün olabilir. QPCR, floresan muhabir sırasında boyalar özel olarak sigara fajının genomik DNA bağlamak veya özellikle fingerprinting astar PCR güçlendirme sırasında ve floresan sinyal güçlendirme her turu ile artar. Floresans sinyal bu yuvarlak/amplifikasyon döngüsü eşik ulaştığında eşik döngüsü (Ct) belirtilmektedir. Başvuru faj DNA bilinen konsantrasyonları standart bir eğri oluşturmak için Ct değerlerine karşı çizilir. Standart eğri DNA örnekleri Ct değerleri ile kullanarak, phages konsantrasyonları değiştirilmiş.

Çok sayıda stratejileri daha önce geliştirilen ve yoğun phages biopanning üzerinden ölçmek için kullanılan iken, her biri belirli zorlukları vardır. En popüler ve geleneksel yöntem çift-tabaka plak tahlil olduğunu. Burada, bakteri seri dilutions hazırlanan phages ile enfekte, solid agar substrat kaplama ve agar ile overlaid ana bilgisayar; phages oluşan plaklar (Yani, plak oluşturan birimler veya pfu) agar plaka numarası ile numaralandırılır. Plak tahlil hassas ama sıkıcı, zaman alıcı ve yanlış, özellikle çok sayıda örnekleri ve yüksek konsantrasyonları⁵. Ayrıca, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) M13 T7 fajının parçacıklar^6,7,ve⁸numaralandırmak için adapte edilmiştir. Burada, farklı dilutions, phages bağlı olan ve bir katı substrat (Yani, bir Mikroplaka) yakalanan, fajının özel antikorlar ile probed ve gazetecilere (Örneğin, enzim hassas chromogenic yüzeylerde, fluorophores) kullanarak tespit Feyc parçacıklar mevcut sayısını belirleyin. Veriler (Örneğin, floresan, absorbans) örneklerinin fajının standartları bilinen konsantrasyonlarda karşı bilinmeyen konsantrasyonları ölçmek için kullanılabilir. Farklı fajının tabanlı ELISAs geliştirilmiştir ancak potansiyel kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir grubu bir kağıda dayalı sandviç ELISA yedi büyüklük (10²-10⁹ pfu/mL); yayılmış bir miktar aralığı ile geliştirilen Ancak, bu yöntem birden çok adımı antikor kaplama gerekli ve tahlil⁸için tüm günümü aldı. Grubumuz aynı zamanda M13 fajının parçacıklar ölçmek için bir ELISA yöntemi geliştirilmiş ancak 10 daha az duyarlı algılama aralığı vardı⁶ ' 10¹¹ pfu/mL⁵. Değiştirilebilir lanthanide floresan problar M13 numaralandırmak için geliştirilmiştir ve miktar veri içinde 20 dk alınamadı; Ancak, bu tahlil vardır dar bir Dinamik Aralık 10 10¹² pfu/mL⁹⁹ . Bir grup atomik kuvvet mikroskobu M13 fajının parçacıklar çözüm numaralandırmak için kullanılan, ama bu gelişmiş elektron mikroskobu gerektirir ve sadece konsantrasyonları¹⁰dar bir Aralık içinde çalıştı. Başka bir çalışmada monodisperse emülsiyonlar floresan M13 ve T4 muhabir phages tuzak ve floresan damlacıkları tarafından phages saymak için kullanılır; Ancak, bu yaklaşım aynı zamanda bir dar miktar aralığı 10 sergilenen² 10⁶ pfu/mL¹¹. Damlacık dijital PCR M13 phages ölçmek için kullanılan, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan fajının parçacıklar¹²sayısı arasında ayırt etmek bu yaklaşım değiştiremiyor.

Bizim grup yakın zamanda T7 ve M13 phages biopanning iki farklı floresan muhabir boyalar⁵kullanarak bir kan - beyin bariyerini hücre modeli üzerinden tespit numaralandırmak için qPCR yöntemleri geliştirmiştir. Söz konusu miktar yöntemlerine göre geliştirdiğimiz qPCR yöntemleri yüksek üretilen iş ve zaman tasarruflu çok sayıda örnekleri ölçmek için ve mümkün ayırt arasında bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan phages DNaz ile ben, ön arıtma Feyc örnekleri. Önemlisi, bu yaklaşımın M13 ve T7 bacteriophages biopanning örneklerinden tekrarlanarak ve doğru bir şekilde ölçmek. Acemi araştırmacılar fajının qPCR alanında rehberlik için burada T7 fajının parçacıkları bir sistein kýsýtlanmýþ kitaplığı (CX7C) karşı bir vitro kistik fibrozis (CF) mukus bariyer panned numaralandırmak için detaylı qPCR yöntemi açıklanmaktadır. Bu işten qPCR yöntemi fajının parçacıklar biopanning diğer türlerinden ve su, toprak ve vücut sıvıları gibi diğer kaynaklardan ölçmek için genişletilebilir.

1. primer tasarım ve T7 fajının genomik DNA'ın Analizi

1. T7 fajının genomik DNA amplifikasyon için tasarım astar.
   Not: F (ileriye doğru) ve (bkz: Malzemeler tablo) R (ters) astar T7 DNA dizisi yükseltmek akıntıya karşı bulunduğu kitaplığı değişken bölge (Şekil 1).
2. Erime sıcaklığı (Tm), yüzde GC içeriği (GC %), astar Dimer, saç tokası oluşumu ve PCR uygunluğu (Şekil 1) de dahil olmak üzere astar, parametrelerini değerlendirmek için bir uygun astar analizörü seçin.
3. Astar oligonucleotides (oligos) sipariş ve elimize lyophilized oligos 100 µM hisse senedi konsantrasyonları bir 1,5 mL santrifüj tüpü alın ve birkaç ay için-20 ° C'de saklayın DNaz ve RNase free ultra saf su için resuspend.
4. Birkaç aliquots (yaklaşık 50 µL her 1,5 mL tüp) 100 µM astar stokunun olun.
   Not: Bu adımı sık donma-çözülme döngüsü önlemek için kullanılır.

2. standartlar T7 fajının genomik DNA miktar için hazırlayın

1. Seri olarak 0.1 µg/µL (1.0 x 10⁸ fg/µL) başvuru T7 faj DNA seyreltik (satın; 0,1 µg/µL bilinen bir konsantrasyon malzemeleri görmek) 10 kat 1.0 x 10⁶ x 10⁰ fg/µL ultra-saf H₂O ' 0.2 mL PCR tüpleri ile 1.0. 20 µL (Şekil 2) bir hacmi her konsantrasyon hazırlayın.
2. Girdap ayrıntılı seyreltme her adımda karıştırma sağlamak için PCR tüpleri. Ayrıca ipuçları DNA örneği için aşağıdaki seyreltme eklerken değiştirin.
   Not: Bu qPCR denemenin her toplu iş için standart bir eğri DNA standartların yeni çözüm hazırlamak için tavsiye edilir.
3. Denklem 1 (aşağıda) T7 fajının başvuru için DNA konsantrasyonları fg/µL genom kopya (gc) /µL (Şekil 2) dönüştürmek için kullanın.
4. T7 faj DNA konsantrasyon gc/µL =
   (1)
   Not: bp: baz çifti; T7 genomik DNA başvurudur 37314 bp.

3. ön tedavisinde fajının örnekleri önce qPCR reaksiyon hazırlık

1. (1. seçenek) Damlalıklı 20 µL vitro kistik fibrozis (CF) karşı biopanning seçildiği bir T7 klonu (fajının)-mukus model 1.5 mL santrifüj tüpleri içine gibi. DNaz 1,25 birimleri ekleyin ben (0.5 µL) her 20 µL örnek için.
   Not: T7 fajının sistein kısıtlanmış heptapeptide kitaplığı (CX7C) biopanned 15dk için 24-şey zar ekler ( Tablo malzemelerigörmek) kaplı CF benzeri mukus karşı yapıldı. Daha fazla bilgi sonuçları bölümünde sağlanır. Bir T7 klon qPCR numune hazırlama eluate üzerinden için seçildi.
   1. Seçenek 2: Damlalıklı 200 T7 µL klon 1,5 mL tüpler içine ve 5 adet DNaz ekleyin ben
      (2 µL) her örnek için.
      Not: Bu adımda seçilen fajının örnek hacmi biopanning toplanan birimden bağlıdır. Odağı iletişim kuralının biopanned fajının qPCR üzerinde olmakla birlikte, biopanning ayrıntılı için T7 fajının Kullanıcı Protokolü adımları (bakınız Tablo reçetesi)¹³kit.
2. T7 fajının örnek tüpler (adım 3.1) kap ve onları 37 ° c ısıtılmış kuru banyo (Yani, ısı blok) 10 min için kuluçkaya.
3. Bir ısıtmalı kuru banyoda (Şekil 3A) 15 dakika 100 ° C'de (Kimden adım 3.2) tüpler kuluçkaya.
   Dikkat: buharlaşma ve yoğunlaşma Isıtma adımı sırasında meydana beri 1.5 mL santrifüj tüpleri tamamen şapkalı emin olun.
4. Isıl phages adım 3.3 18,534 x g , 10 s. karışımı bir girdap karıştırıcı tüp yerleştirerek phages ayarla 10 s ve 18,534 x g 10 için spin için dokunmatik-harekete geçirmek modu için spin s tekrar.
   Not: Spin-mix-spin döngüsü ısıtmalı fajının örnekleri de karıştırılır emin olmaktır.
5. Onları deney tezgah veya mağaza buzdolabında 4 ° C'de gecede terk ederek örnek tüpler, oda sıcaklığında (RT) sakin.
   Not: Bu adımda deneme duraklatılmış.

4. qPCR reaksiyonlar hazırlayın

Not: Bir PCR reaksiyon için bir örnektir. 5 her PCR reaksiyon içerir µL qPCR Master mix (malzemeleri görmek), 5 µM astar çifti Mix 1 µL, H₂O 2 µL ve 2 µL ısıl T7 fajının örneği. Birden fazla PCR reaksiyonları için fajının örnek dışında tüm reaktifler bir 1,5 mL tüp premix. Premiks her reaktif hacmi qPCR için fajının örnek sayısına bağlıdır.

1. 10 biopanned fajının örnekleri bilinmeyen konsantrasyon ve 7 nüsha standart konsantrasyonlarda örnekleri qPCR Premiks hazırlayın. Sonuç olarak, 51 Toplam örnekleri ve bu nedenle, 51 qPCR reaksiyonlar (Yani, örnek başına bir reaksiyon) vardır. 51 reaksiyonlar için 255 µL (51 x 2 µL) qPCR ana Mix (51 x 5 µL), astar (51 x 1 µL) 51 µL ve H₂O 102 µL Premiks hazırlayın.
   Not: Bu bir kaç ilave PCR reaksiyonları sırasında aliquoting PCR karışımı içine her şey 96-şey qPCR plaka için hacim kaybı telafi etmek için hazırlamak için tavsiye edilir.
2. Aliquot 8 µL PCR Premiks 96-şey qPCR plaka 51 wells (Yani, 51 qPCR reaksiyonlar) olmak üzere toplam her kuyuya. Aliquoting sırasında ipuçları değiştirmeye gerek yoktur.
3. Her şey (Şekil 3B); 2 µL ısıl T7 fajının örnekleri (adım 3.4) veya T7 fajının başvuru DNA (adım 2.1) ekleme ipuçları farklı DNA örnekleri çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuya eklerken değiştirin. Ayrıca, 2 µL DNA örnekleri qPCR Premiks (Yani, 8 µL PCR Premiks içine) yüzeyinin altında dağıtmak.
4. QPCR levha yapıştırıcı film ile kapatın.
   Not: Bu qPCR plaka türü ne olursa olsun kritik bir adımdır. Plaka tamamen mühür için önerilen setini kullanın; Aksi takdirde, plaka mühürlü olmayan bölgede PCR sırasında cilt kaybı neden olur Bisiklete binme.
5. QPCR plaka floresan photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile sarın ve qPCR ekipman üzerinde çalışmaya devam edin.

5. qPCR Bisiklete binme koşulları

Not: qPCR Bisiklet koşullarını belirli qPCR ekipman üzerinde kurulmuştur ( Tablo malzemelerigörmek).

1. 96-şey qPCR plaka qPCR ekipman üzerinde çalıştırın. Ekipman, aşağıdaki deneysel koşullar (Şekil 3 c) ayarlamak için menüden ayarları seçin.
2. Koşulları aşağıdaki gibi 10 µL örnek hacmi için bisiklet ayarla: bir çevriminde 2 min 50 ° c 95 ° C'de bir döngüsü için 2 dk, ardından 40 döngüleri tarafından (95 ° C 15 s, 1 dk. için 60 ° C). Sonra çalışma eritebilir eğri ayarları: 95 ° C bir döngüsü için 15 s, 60 ° C için 1 dakika ve 95 ° C 15 s.
3. 6. adımda açıklandığı gibi verileri çözümlemek için devam edin.

6. qPCR ham veri analiz ve qPCR T7 Bacteriophages için gc/µL için Ct değeri dönüştürmek

1. Ham qPCR veri analiz etmek ve veri kalitesi ve ham veri (Şekil 4) karakteristik araziler analiz ederek değerlendirmek.
   Not: Amplifikasyon arsa, uygulamasının arsa ve erime eğrisi Arsa qPCR veri kalitesini doğrulamak anahtar özelliği araziler vardır.
2. İneklemek örneklerinden standart eğri (adım 2.1) her toplama, ortalama eşik döngüsü (Ct) değerleri hesaplar.
   1. Ortalama Ct (Y) günlük (gc/µL) (X Y doğrusal eğrisi almak için) karşı komplo = kX + b (k doğrusal eğrinin eğimini, b kesme noktası).
   2. Doğrusal katsayısı¹⁴ R² hesaplamak (R² -meli var olmak > 0.99).
3. Standart eğri Y kullanın = kX + b (Şekil 5) gc/µL T7 phages biopanning örneklerinde (Yani, phages CF benzeri mukus karşı seçili) sayısını hesaplamak için.
   Not: Standart eğrinin eğimini k var.
4. Aşağıdaki denklemle amplifikasyon verimlilik hesaplamak
   (2)
   Not: başvuru DNA qPCR oluşturulan standart eğrinin eğimini k var. İdeal amplifikasyon verimliliği % 90-110 aralığıdır.

Farklı astar tasarım araçları qPCR astar tasarlamak için kullanılabilir. Genellikle, astar tasarım programları hesaplamak ve astarlar, Örneğin, GC %, Tm, astar dimer veya saç tokası oluşumu, vb anahtar parametrelerinin genellikle doğrulamak için yerleşik kendi algoritmalar, anahtar ölçüt içinde farklı benzer astar tasarım araçları ve astar onların talimatları tasarlanabilir. Astar patlama astar özgüllük onaylamak için kullanılabilir. Bir astar genomik DNA Şekil 1' de gösterilen T7 değişken bölgesinin hedefleyen akıntıya karşı eşleyin. Feyc örnekleri biopanning, mutlak bir bilinmeyen konsantrasyonları belirlemek için miktar yaklaşım - standart eğri miktar - fajının genomik DNA kopyalarını numaralandırmak için seçildi. Referans T7 faj DNA (malzemeleri görmek) bilinen bir konsantrasyon 0.1 µg/µL seri olarak 1.0 x 10'dan düşürülmüştü0 1.0 x 106 fg / µL. Denklem 1 kullanılan dönüştürmek T7 faj DNA konsantrasyonları için fg/µL genom kopya (gc) için gelen / µL; başvuru T7 faj DNA konsantrasyonları edildi 2,66 x 10 107 gc/µL (Şekil 2) x 2,661 .

Dilutions referans DNA için standart eğri hazırladıktan sonra bir seçili CX7C T7 fajının qPCR (Şekil 3A) için hazırlanmıştır. Kısaca, seçili fajının biopanning açıklamak için: 4,2 x 109 pfu T7 CX7C fajının ilk bir konsantrasyon apikal üzerine eklenen bir Transwell kartı yuvası (donör) plaka (bkz: Malzemeler tablo) içeren 100 µL CF benzeri mukus ve 600 µL fosfat tamponlu tuz (PBS, Tablo malzemelerigörmek) demiri yerde (alıcı) ve 15 dakika (25 ° C) Oda sıcaklığında inkübe. 15 dk sonra alıcının eluate toplanan; eluate bir CX7C T7 klon qPCR tarafından sayısal üzere seçildi. qPCR reaksiyon hazırlık Şekil 3B' gösterildiği gibi gerekli reaktifler (Örneğin, qPCR ana mix, astar, H2O), buz üzerinde gerçekleştirildi. QPCR Bisiklet koşullarını bir qPCR thermocycler (bkz. Tablo malzemeleri, Şekil 3 c) örnekleri çalıştırmak için kurulmuştur.

Çalıştırmak qPCR sonra amplifikasyon arsa, erime eğrisi arsa ve uygulamasının Arsa (Şekil 4) yazılımı kullanarak ham verileri analiz edildi ( Tablo malzemelerigörmek). Amplifikasyon Arsa başarılı veya başarısız her örneğinin PCR güçlendirme gösterir. Uygulamasının Arsa amplifikasyon ve çürüme floresans sinyalinin (muhabir boya SYBR ve arka ROX boya) amplifikasyon döngüleri boyunca sunar. Erime eğrisi Arsa astar özgüllük bir benzersiz erime sıcaklığı (Tm) her PCR ürünü olduğundan doğrulamak için kullanılır.

QPCR ham veri kalitesi değerlendirme sonrasında yapılan başvuruyu DNA standart eğri oluşturuldu: Ct değerleri (Y) üzerinden günlük gc/µL ( Şekil 5' te gösterilen konsantrasyon dönüşüm); Y buradaydı =-3.5188 X + 35,09 (R20.999 =) (Şekil 5A ve 5B)

Yazarlar ifşa gerek yok.