Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

8.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58201

⸱

3 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, Jichi Medical University

Bu makalede

Özet

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Özet

Hangi yakalayabilir ve mikroplar yok nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), aktif. Son yıllarda yapılan çalışmalarda NETs, otoimmün hastalığı, kan pıhtılaşması ve tümör Metastazlari gibi çeşitli hastalık süreçlerini katılmaktadırlar öneririz. İşte, bindirme ağları için ek sonra büyümek ücretsiz tümör hücrelerinin sırasında NET faaliyet algılamak için detaylı vitro tekniği göstermektedir. İlk olarak, biz düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) laparotomies yapılan hastaların postoperatif peritoneal lavaj sıvı toplanan. Kısa vadeli LDN kültür yeşil floresan nükleer ve kromozom counterstain ile görüntülenmiştir büyük NET oluşumu sonuçlandı. Sonra eş kuluçka insan mide kanseri hücre hatların MKN45, OCUM-1 NUGC-4 ağları ile birçok tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın. Daha sonra ek tamamen DNaz ı. Time-lapse video ağları tarafından tuzağa tümör hücreleri ölmek ortaya ağlar bozulması tarafından kaldırıldı ama bunun yerine şiddetle sürekli bir kültürde büyüdüm. Bu yöntemler ağlar ve hücreleri ve materyaller çeşitli yapışkanlı Hofstede tespiti için uygulanabilir.

Giriş

Polimorf nükleer nötrofiller kan dolaşan içinde genelde yoğunluk gradient hazırlama yöntemi mononükleer hücreler ayrılır. Ancak, bazı nötrofil düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), CD11b(+), CD15(+), CD16(+) ve CD14(-) fenotipleri ile bilinen mononükleer hücreler ile birlikte saf. LDN göreli sayısı otoimmün hastalıklar1,2, sepsis3ve kanser4,5de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarında önemli ölçüde artırır. Önceki çalışmalarda LDN nötrofil6phenotypically ve işlevsel olarak ayrı bir sınıf olduğunu göstermiştir. Bu unutulmamalıdır ki kan dolaşan içinde LDN nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) normal yoğunluk nötrofil2,7' den üretmek olasılığı vardır. Ağlar nükleik asitler, histon, proteaz ve taneli ve sitozolik protein oluşan web benzeri yapılar, ve verimli bir şekilde tuzağa ve patojenler8yok.

Son zamanlarda, NETs sadece mikroplar, ama aynı zamanda trombosit ve dolaşan trombus olgusu oluşumu9 ve tümör Metastazlari10,11' yardımcı olabilir tümör hücreleri yakalamak için gösterilmiştir. Ancak, ağlar ve trombosit veya tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler arkasında moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, bir vitro yapışma tahlil myeloid lösemi hücreleri (K56212) ve Akciğer Karsinomu Hücre (A54913) ağlar için β1 ve β3 integrinler yolu ile atamanız da ortaya koydu. Yazarlar nötrofil izole ve phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olarak yapışma substrat14tarafından aktive NET stok kullanılır. Bu tahlil NET bileşenleri ile gerçek etkileşim tespiti nötrofil yokluğunda sağlar, "hücre-ücretsiz NET hisse senedi" ile yüksek hızlı Santrifüjü izole moleküler yapısı içinde üretilen Nets aynı olup olmadığı korur tartışılabilir olsa da Vivo. Son zamanlarda, sonra karın ameliyatı büyük ağlar oluşturulan ve periton Metastazlari15neden tümör hücrelere bağlı olan birçok olgun LDN bulunan peritoneal lavaj sıvıyı bulduk. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde herhangi bir fiziksel manipülasyon olmadan sağlam Nets tümör hücrelerinin yapışma inceledi. İşte, ağlar ve ücretsiz tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler algılamak için bir teknik ayrıntılarını göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

LDN Bu çalışmada kayıtlı hastalardan elde edilmiştir ve kurumsal İnceleme Kurulu, Jichi tıbbi üniversite tarafından kabul edildi.

1. yalıtım LDN karın boşluğu Lavages ve NET algılama

  1. Örnek alma
    1. 1000 mL normal steril serum doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçiren hastalarda yara kapatma önce karın boşluğu içine süzülür.
      Not: Örnekleri gastrektomi, kolektomi veya yaşında yaş veya cinsiyet dayalı önyargı olmadan yapılan hastalarda elde edilmiştir. Serum fizyolojik bir konteyner içine transfer ve bir dakika içinde tüm karın dökülür. Bu rutin bir ameliyat sonrası periton yıkama hasta üzerinde önemli etkisi olmadan olarak gerçekleştirilir.
    2. Lavaj en az 1 dk. için kapsamlı bir şekilde karın boşluğu.
      Not: Bu örnekleri tek tip olması infüzyon sıvı yavaş yavaş cerrahın elleri ile karıştırılır tavsiye edilir.
    3. Lavaj sıvı dört 50 mL şırınga ile 200 mL kurtarmak.
      Not: Bazen bir lastik bağlayıcı sıvılar çekmek için kullanılır.
  2. Arıtma periton LDN granülosit belirli mAb, CD66b16kullanarak gerçekleştirin.
    Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonra ara katman birçok mononükleer hücreler içerdiğinden, polimorf nötrofil CD66b mAb kullanma olumlu seçimi gerçekleştirildi.
    1. Peritoneal lavaj sıvı bir 50 mL tüp aktarın.
      Not: Bu adımda, sıvılar kirleri çıkarmak için bir 100 µm naylon filtreden geçmek.
    2. 270 x g 7 dk RT. az için peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi
    3. Granül PBS %0.02 EDTA ile 5 ml resuspend.
    4. Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 3 mL yoğunluk gradient çözüm üzerinde 5 mL yerleşimi.
    5. 1.700 x g RT, 15dk sınırlarında olmadan için santrifüj kapasitesi.
    6. Bir pipet kullanarak ara Katmanlar (Şekil 1A) içeren çözüm ~ 2-3 mL hasat ve PBS %0.02 EDTA ile 10 mL ile karıştırın.
    7. RT, 7 dk 400 x g, peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    8. PBS %0.02 EDTA ve santrifüj ile başka bir 10 mL 270 x g RT. atma süpernatant 7 dakika için ekleyin.
    9. Hücre Pelet (1 x 107) arabelleği için manyetik hücre ayrılık teçhizat 60 µL geçiyoruz.
    10. Fc blok 20 µL için granül ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
    11. Anti-CD66b 20 µL lastikteki ile Birleşik ve ek bir 10 min 4 ° C'de için kuluçkaya ekleyin
    12. Yıkama ve granül MAC'ler arabellek 500 µL içinde yeniden askıya alma.
    13. Hücre süspansiyon uygun manyetik ayırıcı manyetik alan manyetik bir sütun için geçerli ve sütun arabellek 15 mL ile yıkayarak akışı aracılığıyla içeren CD66b(-) hücreleri toplamak.
    14. Sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak ve hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik olarak etiketli CD66b(+) hücreleri floş.
      Not: CD66b(+) hücre nüfus çoğunlukla nötrofil gösteren FACS analiz tarafından belirlenen oluşur > CD66(+) kesir % 95'i CD11b, CD15 ve CD16 olumlu ama CD14 için negatif.
  3. Nesil ağlar
    1. 270 x g RT, 7 dk de aralıklarla sonra izole LDN yeniden askıya alma (5 x 106) RPMI1640% 10 FCS ile 1 ml.
    2. LDN tabakta 6-şey poli-L-lizin kaplı (6 cm çapında) %5 CO237 ˚C 2 h için kültür.
    3. Yeşil flüoresan counterstain (çekirdek ve kromozomlar leke geçirmez membran bir boya) 5 mikron son konsantrasyonu ekleyin.
    4. Hemen ağlar (LDN floresans mikroskobu altında ihraç ekstraselüler DNA bileşenleri) morfoloji gözlemlemek.

2. tümör hücreleri kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama

  1. İnsan kanser hücre hatları MKN45, NUGC ve OCUM-1 hazırlayın.
  2. 1 x 107 hücreleri PBS + 15 mL tüp ve 270 x g, santrifüj RT. 7 min için %0,02 EDTA ile yıkayın
  3. Çözüm için granül boyama boya için 1 mL ekleyin ve hafifçe pipet.
  4. Kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama için çözüm 1 ml 4 µL dağıtılması ve hücre süspansiyon adım 2.2 ile karıştırın.
  5. Granül RT., 4 dk için kuluçkaya
  6. DMEM 4 mL ekleyin (% 10 FBS) boyama reaksiyonu durdurmak için.
  7. 270 x g 7 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  8. 2.6 ve 2.7 adımları iki kez tekrarlayın.
  9. Kontrol floresan mikroskop (uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm) tümör hücreleri kırmızı lekeli.

3. tümör hücre adezyon Nets Analizi

  1. RPMI % 0.1 BSA ile desteklenmiş 1640 1 ml kırmızı floresan lekeli tümör hücreleri (1 x 106) yeniden askıya alma.
  2. 1.3. adımda açıklandığı gibi ağlar üretilen LDN kültür tümör hücreleri ekleyin.
  3. NETs başvurmanız tümör hücreleri sağlar 37 ˚C, 5 min için kuluçkaya.
    Not: Uzun bir kuluçka tümör hücre adezyon LDN veya plakaları neden olmaktadır.
  4. Orta kaldır ve yavaşça kuyuları prewarmed medya (% 0,1 BSA + RPMI 1640) 2 mL ekleme ve çanak dönen yıkayın.
  5. Adım 3.4 çamaşır yordamda iki kez tekrarlayın.
    Not: Beri ağları zayıf plakasına eklemek, çamaşır temizleme ağlarının kendilerini önlemek için mümkün olduğunca yavaşça yapılmalıdır.
  6. Çekirdeği ve kromozom 5 µg/mL NETs görselleştirme için son bir konsantrasyon, boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
  7. NETs gözlemlemek ve tümör hücreleri uygun filtreleri kullanarak bağlı (yeşil, uyarma 504 = nm, yayan 523 = nm; kırmızı, uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm).
  8. Ağlar tarafından tuzağa tümör hücreleri göstermek için rakamlar birleştirme.
    Not: Bazı deneylerde DNA bozulması enzim 5 dk önce 5 min için ortak kuluçka LDN Kültür (son konsantrasyon 100 U/mL) eklenmiştir.

4. zaman atlamalı Video analiz kapana kısılmış tümör hücrelerinin

  1. Kültür bir 35 mm periton LDN çanak poli-L-lizin 1.3 adımda anlatıldığı gibi ile kaplı yuvarlak.
  2. Çekirdeği ve kromozomlar 1.3 adımda anlatıldığı gibi ağlar görselleştirmek için boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
  3. 1 dk, kuluçka sonra medyayı çıkarın ve 2 mL % 0,1 BSA + RPMI 1640 ekleyin.
  4. Medyayı çıkarın ve günahı 1 x 106 MKN45 hücreleri % 0,1 askıya BSA + RPMI 1640 ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya
  5. 3.4. adımda açıklandığı gibi yavaşça yıkayarak herhangi bir bekâr tümör hücreleri kaldırın ve DMEM 100 u/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile % 10 FCS ile ekleyin.
  6. Kültür çanak bir bütün-görünümü hücresi gözlem sistemi monte ve hangi tümör hücreleri ağlar tarafından tuzak vardır uygun alanı seçin.
  7. Bir ek 2 gün ortak kültür ve her 6 dk normal ışık ve MKN45 hücreleri ve ağlar, sırasıyla algılar floresans altında alanın sürekli fotoğraf çekmek devam edin.
  8. Görüntüleri her timepoint, üst üste ve hızlandırılmış videoları Image Viewer yazılımı kullanarak oluşturur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

2 saatlik kültüründe CD66b(+) peritoneal lavaj sıvı gösterdi dize yapılardan türetilmiş LDN lekeli yeşil-floresan boya için nükleer ve kromozom (Şekil 1B), mononükleer hücreler vermedi CD66b(-) ise (Şekil 1 c). LDN kültürleri ile ön işleme Ancak, 100 U/mL DNaz olduğumu karakteristik yapısı (Şekil 1 d), yok ekstraselüler DNA nötrofil ihraç oluşan olduklarını gösteren. LDN kültürlü zaman plastik tabakl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki çalışmalarda tümör hücreleri dolaşan NET yüzeylerde vivo içinde10,11tarafından kapana olduğunu bildirdi. Metastatik meme kanseri hücrelerinin nötrofil uyarmak ve hangi tümör hücre büyümesini hedef organ17yardımcı olur ağlar, oluşumu teşvik gösterilmiştir. Buna ek olarak, biz kısa vadeli kültürleri LDN ameliyat sonrası lavaj sıvı üzerinden verimli bir şekilde tümör hücreleri daha fazla stimülasyon15ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bayan J. Shinohara ve ı. Nieda teknik ve idari personel çalışma için teşekkür ederiz. Ayrıca, biz Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina ve Kazuya Takahashi ameliyathane örnek edinme için işbirliği için teşekkür ederiz. Bu eser bir Grant-in-Aid tarafından Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya ve Japonya Derneği bilimsel araştırma bilim promosyon (17 K 10606) için destek verdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, İSVEÇ17-1440-02
StraightFrom™ Tam Kan CD66b MicroBeadsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-104-913
Fc blokMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-059-901
MACS Durulama SolüsyonuMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-091-222
MACS BSA Stok ÇözümüMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-091-376
LS SütunlarıMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-041-306
MACS Manyetik AyırıcıMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya130-042-501
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,ABD'de SYTOX yeşil nükleik asit lekesi 5mM çözeltisiS7020
PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı KitiSigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDP9691
Seyreltici CSigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDCGLDIL
OrtaSigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDR8758
Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta-yüksek glikoz (DMEM)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDD5796
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDD8537
0.5mol / l-EDTA Çözeltisi (pH 8.0)nacalai tesque, Japonya06894-14
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgelergibco by life technologies, Meksika10437-028
Sığır Serumu Albümin liyofilize toz, & % 96 (agaroz jel elektroforezi)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABDA2153
Penisilin StreptomisinYaşam Teknolojileri Japonya15140-122
Plazmosin ProfilaktikInvivoGen, San Diego, CA-ABDant-mpp
DNase IWorthington, Lakewood NJ)LS002138
Poli-L-Lizin Kaplı MİKROPLAKA 6WellIWAKI, Japonya4810-040
Poli-L-Lizin Kaplı MİKROPLAKA 24WellIWAKI, Japonya4820-040
floresein stereomikroskopBX8000, Keyence, Osaka JaponyaBZ-X710
Tam görünüm hücresi gözlem sistemiNikon, Kanagawa, JaponyaBioStudio (BS-M10)
MKN45 insan mide kanseri hücre hattıRiken, Tukuba JaponyaN/A
NUGC-4 insan mide kanseri hücre hattıRiken, Tukuba JaponyaN/A
OCUM-1 insan mide kanseri hücre hattıOsaka City Üniversitesi, JaponyaN/ADr. M.Yashiro'dan Hediye
DMSO Genel Hücre Zarı Etiketleme için RPMI1640

Kaynaklar

  1. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  2. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  3. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
  4. Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
  5. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
  6. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
  11. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  12. Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).
  13. Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
  14. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  15. Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).
  16. Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
  17. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör Hücre AdhezyonuNET OluşumuFloresan MikroskopiManyetik Aktive Edilmiş Hücre AyıklamaDNase I UygulamasıGastrik Kanser HücreleriTime-Lapse Analizi
Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.