Yöntem makalesi

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

DOI:

10.3791/58252

⸱

5 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, The First Hospital of Jilin University, 2Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranışı ile üç boyutlu iskele ücretsiz kalp doku oluşturmak için net bir kalıp tabanlı yöntemini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir roman ve üç boyutlu (3-D) kalp dokuları ek iskele malzeme olmadan oluşturmak için kolay net kalıp tabanlı yöntemini açıklar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes (IPSC-CMs), insan kalp fibroblastlar (HCFs) ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) izole ve hücre süspansiyon ile %70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs oluşturmak için kullanılır. Onlar aynı anda yüzlerce pulcuklarının yoğuşmalı için micropores içeren bir ultra düşük eki "asılı damla" sisteminde ortak kültürlenir. Hücreleri toplamak ve kendiliğinden dayak pulcuklarının ortak kültür 3 gün sonra oluşturur. Pulcuklarının roman kalıp boşluğuna tohumlari, hasat ve bir shaker kuluçka kültürlü. Pulcuklarının olgun fonksiyonel mendil tohum sonra yaklaşık 7 gün haline. Sonuç çok katmanlı dokuları yuvarlak pulcuklarının tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranış oluşur. Bu yeni yöntem gelecekte kalp yetmezliği tedavisi için tasarlanmış dokular oluşturmak için tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir yöntem olarak umut verici potansiyeli var.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçerli kalp doku mühendisliği amacı değiştirebilir veya yapısı ve fonksiyonu yaralı miyokard doku1tamir için bir terapi geliştirmektir. 3-b kalp doku modelleri yerli kalp dokusunun önemli contractile ve elektrofizyolojik özellikleri sergileyen oluşturmak için yöntem hızla2,3genişletilmesi. Çeşitli stratejileri keşfedilmeyi ve çalışmalar4,5' te kullanılan. Bu yöntemler belirli sentetik ve doğal biyoaktif hydrogels, jelatin, kolajen, fibrin ve peptidler6gibi kullanımı ile arasındadır biyo-mürekkep ifade teknolojileri2 ve bioprinting teknolojileri7.

Bu iskele ücretsiz yöntemleri yabancı iskele malzeme8birleşmeyle dezavantajları olmadan biomaterial tabanlı yöntemi olarak karşılaştırılabilir doku üretebilir gösterilmiştir. Oren Caspi vd. , hücre türleri ortaklığın son derece bozukluklarına insan mühendislik kalp dokusu9nesil sağlar gösterdi. Çene ve ark. pulcuklarının kardiyak yama oluşturulması için 3-b bir yazdırma yöntemi geliştirdi. Sonuçta ortaya çıkan yamalar cardiomyocytes, fibroblastlar ve 70:15:15 oranı10endotel hücreleri oluşur. Pulcuklarının etkili "yapı taşları" İskele ücretsiz kalp doku yaratılış olarak onlar hipoksi karşı dirençli olması ve yeterli mekanik bütünlük implantasyon11,12sahip gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda küresel oluşturmak için çeşitli imalat yöntemleri göstermiştir, idam kullanımı da dahil olmak üzere bırakma yöntemi, spinner şişeler13, mikrosıvısal sistemleri14ve yapışık olmayan kültür yüzeyler kaplamasız veya ile kaplı özel mikro-kalıpları15. Bu protokol için kullandığımız asılı pulcuklarının yüzlerce aynı anda yoğuşmalı için micropores içeren açılan aygıt.

Bu çalışmada bir roman ve el ile bir kare kalıp boşluğuna pulcuklarının tohum ve olgunlaşma için doku üzerinde bir shaker kuluçka içerir kalp doku oluşturmak için verimli iskele ücretsiz yöntemi sunar. Her zamanki gibi statik kültür koşullar altında oksijen difüzyon dış yönleri merkezi nekroz kaynaklanan doku yapısı ile sınırlıdır. Ancak, net kalıp ile medya için besin ve oksijen difüzyon artan sağlayan bir sürekli sıvı hareket ile kalıp içine seribaşı pulcuklarının daldırılır. Ayrıca, bu kalıp tabanlı yöntem farklı boyutta doku yamalar en az el ile çaba ile eşzamanlı oluşturulması için izin verir ve sonuç doku kalıptan kolayca kaldırılabilir. Bu roman yöntemi iskele-free, çok katmanlı kardiyak yamalar verimli ve tekrarlanabilir oluşturulması için izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cardiomyocytes hazırlanması

  1. Kat 6-şey pilakalar ve membran matris ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) daha önce17açıklandığı gibi.
  2. HiPSCs hiPSC-CMs içine önceden açıklanan yöntemleri18kullanarak ayırt etmek.
  3. 16-18 d sonrası farklılaşma cardiomyocytes her şey 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 2 mL ile durulama tarafından kalsiyum ve magnezyum, kuluçka 1 mL/tripsin veya hücre ayrılma reaktif (bakınız tablo, bir de tarafından takip olmadan askıya alma Malzemeler) Oda sıcaklığında 5 min için.
  4. Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) B-27 (RPMI/B-27 hücre medya) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) hücre medya eşit bir birim için. Yukarı ve aşağı pipet yapıştırılır hücreler gevşetmek için.
  5. 10 mL serolojik pipet ile askıya alınmış cardiomyocytes toplamak ve 50 mL konik tüp aktarabilirsiniz.
  6. Hücre süspansiyon 250 x g bir hücre Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  7. Pelet 10 mL RPMI/B-27 hücre medya resuspend.
  8. Hücre süspansiyon, 20 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.
  9. El ile bir hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.

2. fibroblastlar hazırlanması

  1. Bir insan kalp fibroblast (HCF) (yetişkin ventrikül türü) hücre kültürünü daha önce16açıklandığı gibi kültürünü başlatın.
  2. HCFs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında165 min için. Bir T175 şişesi için tripsin veya hücre ayrılma reaktif 10 mL kullanılmıştır.
  3. Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birimi kullanımı, sonra örnek 50 mL konik tüp aktarmak ve hücre süspansiyon 250 x g almak için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi bir Pelet.
  4. Pelet fibroblast büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).
  5. HCF hücre süspansiyon 20 µL % 0,4 trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.
  6. Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve yeni hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.

3. endotel hücreleri hazırlanması

  1. 17daha önce açıklandığı gibi bir insan göbek damar endotel hücre (HUVEC) çizgi kültürünü başlatın. HUVECs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında173 dk için. Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birim için o zaman 50 mL konik tüp transferi ve hücre süspansiyon 250 x g bir Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    Not: 10 mL tripsin veya hücre ayrılma reaktif bir T175 şişesi için kullanıldı.
  2. Pelet endotel hücre büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).
  3. HUVEC süspansiyon 20 µL birleştirmek ve % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda leke ve karışımı yavaşça.
  4. Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.

4. açılan pulcuklarının asılı oluşturma

  1. Asılı koyun steril 6-şey kalıplara 850 micropores (her çapı 350 µm) içeren açılan aygıt.
  2. Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri üç tür izole: hiPSC-CMs, HCFs ve HUVECs. Onları RPMI/B-27 hücre medya mL başına 2,475,000 hücre bir konsantrasyon ile oranında % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs 50 mL konik tüp içinde birleştirir.
  3. Her şey bir 6-şey tabak içinde oturmuş damla sistemi (350 µm micropore çaplı) asılı Ultra düşük ek için hücre süspansiyon (mL başına 2,475,000 hücre) 4 mL dağıtmak.
  4. Hücre süspansiyon içine asılı dağıtım 12 h içinde kendiliğinden pulcuklarının oluşturacak damla aygıt. Kültür toplam 72 h (3 d) 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem pulcuklarının olgunlaşma için devam ediyor.
  5. Kültür 72 h sonra asılı dibinde gözenekler yoluyla pulcuklarının hasat bırak sistem aygıt ile orta bir çanak içine yerleştirip yavaşça pulcuklarının asılı üzerinden yayın için dönen damla aygıt.

5. 3-b yama oluşturma roman Net kalıp kullanarak

  1. Kaidenin alt kare plaka alt net ve 10 katmanlı yan ağları bir çift steril forseps yardımıyla roman kalıp oluşturmak için monte edilir. İlk olarak, yığını hizalamak Bankası, alt kare plaka ve köşe mesaj kullanarak net alt. O zaman, yığını ve ince paslanmaz çelik dişleri bir ağ oluşturmak için talimatları dönüşümlü olarak 10 yan ağlar katman.
  2. PBS veya orta yüzey gerilimi azaltmak ve daha sonra birleştirilmiş kalıp doldurma Bankası üzerine aktarmak için temel dolgu floş.
  3. Net kalıp boşluğu ile PBS ya da aynı yöntemi ortamda ıslak. Yavaş yavaş pulcuklarının istediğiniz boyuta presupposed boşluğuna doldurun (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm veya 6 x 6 x 1 mm).
    Not: %120 pulcuklarının beklenen hacmi böylece hücre toplamları sıkı bağlantısı ve statik kalmak boşluğuna besleniyor emin olun.
  4. Üst net ve üst kare plaka köşe mesaj üzerine montajı ve stoper ve holding tüpler pulcuklarının fiyasko önlemek için güvenli.
  5. Dolgulu net kalıp sistemi 6-şey plaka ile 6 mL RPMI/B-27 hücre medya veya tüm birleştirilmiş kalıp karşılamak için yeterli orta ile steril bir kaba aktarın.
  6. 6-şey plaka dolgulu kalıp sistemi üzerinde sallanan bir shaker ile 3.000-4.000 x g7-10 gün için kuluçkaya.
    Not: Kuluçka süresi kardiyak yamalar boyutu tarafından belirlenir. Daha büyük yamalar ile kuluçka süresi kardiyak yama olgunlaşma için arttırılması gerekecektir.

6. düzeltme roman Net kalıp üzerinden kaldırılması

  1. Kalıp sistemini medyadan kaldırıp steril işleme mat steril bir 10 cm tabak yerleştirin.
  2. Holding Metro, stoper, üst kare plaka ve üst net kaldırın. Dikkatle steril forseps ile bir çift katmanlı yan ağlar tek tek kaydırın. Decannulation sonra sağlam bir kalp yama belgili tanımlık dip net elde edilir.
  3. Net tabandan steril forseps kullanarak yama ile almak ve net alt 5 mL RPMI/B27 medya ile bir 35 mm çanak içine aktarın. Yavaşça yama net alttan yavaş yavaş yemek veya steril hücre sıyırıcı ile net dönen gevşetin. Net alttan dekolmanı sonra kalp dokusu ile RPMI/B27 medya kültürlü.
  4. 35-mm çanak içinde yüzen 3-b kardiyak yama kuluçkaya devam'i tıklatın. Fonksiyonel zaman uyumlu dayak 24 h gibi erken kalıp kaldırılması sonra görülebilir.
  5. Yama net kalıp çıkarmadan sonra şekli bütünlüğü ve zaman ile zaman uyumlu dayak artar şiddeti ile korunur gözlemlemek.
    Not: Bileşen cardiospheres elektrik entegrasyon decannulation sonra 3-b net kalıp tabanlı kardiyak yamaları sergiledi. Biz 60 80 dakikada 60 günden fazla kalıcı arasında değişen bir dayak frekans gözlenen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim deneylerde % 70 IPSC-CMs, HCFs ve % 15 HUVECs RPMI/B-27 hücre medya bir konsantrasyon mL başına 2,475,000 hücre, bir hücre süspansiyon kullanılmaktadır. Hücre süspansiyon oluşturduktan sonra biz protokol 4.3. adımında açıklandığı gibi her de açılan sistem, asılı Ultra düşük ek hücre süspansiyon 4 mL reçete. İdam kullanımı açılan sistem pulcuklarının 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem kültürünün 3 gün sonra dayak yüzlerce kendiliğinden oluşumu sonuçlandı. Pulcuklarının kolayca 4 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem önemi, tekrarlanabilirlik ve sonuç çok katmanlı kalp doku etkinliğini yatıyor. Kalp doku mühendisliği alanında, geçerli gol atan, çok katmanlı ve fonksiyonel 3-b kardiyak yamalar oluşturmak için bir yöntem belirlemektir. Biz cardiomyocytes, endotel hücreleri ve fibroblastlar içerebilen bir roman net kalıp içine oluşan pulcuklarının, doğrudan el ile tohum tarafından çok katmanlı kalp dokuları oluşturmak verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem raporu. Bu yöntemde kullanılan net kalıp çeşitli 6 x 6 x 1 mm için 2 x 2...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynağı kabul: Magic bu konularda Fonu kardiyovasküler araştırma için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan Kardiyak fibroblastları (HCF)Sciencell6310
FM-2 Bazal BesiyerineOluşur Sciencell2331HCF kültür besiyeri
İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC)LonzaCC-2935
EGM + Bullet Kit LonzaCC5035HUVEC kültür ortamı
E8 ortamı InvitrogenA1517001HiPSC kültür besiyeri
Geltrex InvitrogenA1413202
TrypLE Express Enzimi (1X)Thermo Fisher12604013Tripsin ve Hücre ayrışması reaktifi
RPMI ortamıinvitrojen11875093RPMI ortamı hiPSC-CM kültür ortamıdır
B-27 takviyesi (50x)Thermo Fisher17504044B-27 takviyeli RPMI ortamı hiPSC-CM kültür ortamıdır
Tripan Mavisi Çözelti,% 0.4Thermo Fisher15250061
Yeni ağ kalıbı ve nbsp;TissueByNet Co., LtdNM25-1
Asılı damla plakasıKuraray Co., LtdMPc350
6 kuyulu plakalar ve nbsp;Sigma-AldrichCLS-3516
B-27 takviyeli Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Scaffold free Cardiac TissueNet Mold MethodHanging Drop SystemSpheroid FormationiPSC CMs HCFs HUVECsUltra low AttachmentMicropore DeviceStainless Steel NetsTissue MaturationBeating Spheroids

İlgili makaleler